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流感病毒聚合酶蛋白PB1相互作用的宿主因子的鉴定及功能研究

2020-12-02阅读(901)

流感病毒聚合酶蛋白PB1相互作用的宿主因子的鉴定及功能研究

论文摘要

流感是一种重要的人畜共患病,给养殖业和人类公共卫生安全带来巨大的威胁,A型流感病毒（Infulenza A virus,IAV）能够感染多种宿主并在其体内进行复制,核糖核蛋白复合体（Viral ribonucleoprotein complex,vRNP）是IAV转录复制的最小单位,vRNP的核心部分为聚合酶三聚体,由酸性聚合酶（Polymerase acid protein,PA）、碱性聚合酶1（Polymerase basic protein 1,PB1）和碱性聚合酶2（Polymerase basic protein 2,PB2）三个亚基组成,流感病毒聚合酶在病毒复制中发挥关键作用,PB1是聚合酶的核心蛋白,含有RNA依赖性RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）的保守序列,具有聚合酶活性,可以参与RNA链的延伸,能与vRNA和cRNA相结合。IAV在宿主细胞内复制需要利用多种宿主因子,有些宿主因子在IAV的增殖过程中发挥着重要作用。本研究利用亲和纯化结合质谱分析（AP-MS）的方法发现97个潜在与流感病毒PB1蛋白相互作用的宿主因子,GO分析和KEGG分析发现这些宿主因子在分子功能上主要涉及多聚腺苷RNA结合功能、蛋白结合功能和核糖体结构组分功能等;蛋白互作网络分析发现这些宿主因子主要涉及到核糖体代谢途径、RNA转运途径和剪接酶体途径等。本研究进一步探索了宿主因子YB1对IAV复制的调控机制,并初步地探究了宿主因子PRMT5、FABP5、KCTD2、LRPPRC、SF1、WDR77和YWHAB对IAV增殖的影响。通过免疫共沉淀试验发现YB1蛋白和YWHAB蛋白能与PB1蛋白相互作用,PRMT5蛋白能与PB2蛋白相互作用。通过siRNA沉默宿主因子的表达,本研究发现宿主因子YB1、YWHAB、SF1、PRMT5和WDR77对H1N1流感病毒的复制具有促进作用。本研究不仅加深了对IAV复制机制的理解,还进一步揭示了抗IAV药物的潜在靶标。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • 1 文献综述
  •   1.1 流感病毒简介
  •     1.1.1 vRNP结构与功能
  •     1.1.2 流感病毒的生命周期
  •   1.2 宿主因子YB1
  •     1.2.1 YB1蛋白的生物功能
  •   1.3 宿主因子PRMT5
  •     1.3.1 PRMT蛋白家族分类
  •     1.3.2 PRMT5蛋白的空间结构
  •     1.3.3 PRMT5蛋白生物功能
  •   1.4 宿主因子FABP5
  •   1.5 宿主因子KCTD2
  •   1.6 宿主因子LRPPRC
  •   1.7 宿主因子SF1
  •   1.8 宿主因子WDR77
  •   1.9 宿主因子YWHAB
  • 2 研究目的与意义
  • 3 材料和方法
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 细胞与病毒
  •     3.1.2 质粒和小干扰RNA
  •     3.1.3 抗体和小分子化合物
  •     3.1.4 PCR和质粒构建相关材料
  •     3.1.5 细菌培养和转化相关材料
  •     3.1.6 蛋白提取、定量、SDS-PAGE和银染相关材料
  •     3.1.7 Western blot和Co-IP相关材料
  •     3.1.8 质谱鉴定相关材料
  •     3.1.9 间接免疫荧光和激光共聚焦实验相关材料
  •     3.1.10 RNA提取、RT-PCR和qPCR相关材料
  •     3.1.11 双荧光素酶报告基因实验相关材料
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 质粒的构建
  •     3.2.2 细胞复苏
  •     3.2.3 细胞冻存
  •     3.2.4 细胞转染
  •     3.2.5 流感病毒的增殖
  •     3.2.6 流感病毒的细胞接种
  •     3.2.7 Western Blot实验
  •     3.2.8 银染实验
  •     3.2.9 PR8-PB1蛋白的纯化
  •     3.2.10 质谱鉴定与分析
  •     3.2.11 双分子荧光互补实验
  •     3.2.12 间接免疫荧光实验
  • 4 结果与分析
  •   4.1 PR8-PB1和宿主因子的共纯化
  •   4.2 质谱鉴定PB1相互作用的宿主因子
  •   4.3 筛选对H1N1流感病毒复制影响显著的宿主因子
  •   4.4 沉默相应宿主因子对流感病毒增殖的影响
  •   4.5 沉默YB1对H1N1流感病毒复制的影响
  •   4.6 BiFC实验检测YB1与流感病毒聚合酶亚基的互作
  •   4.7 免疫共沉淀试验检测YB1与流感病毒聚合酶亚基的相互作用
  •   4.8 间接免疫荧光实验检测YB1与PA、PB1、PB2、NP的共定位
  •   4.9 沉默PRMT5对H1N1流感病毒复制的影响
  •   4.10 免疫共沉淀试验检测PRMT5与流感病毒聚合酶亚基的相互作用
  • 5 讨论
  •   5.1 与PB1互作的宿主因子对H1N1流感病毒的调控
  •   5.2 YB1对H1N1流感病毒的调控
  •   5.3 PRMT5对H1N1流感病毒的调控
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 程泰烺

    导师: 周红波

    关键词: 型流感病毒,宿主蛋白

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 华中农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000283

    总页数: 73

    文件大小: 5303K

    下载量: 127

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