顾红祥, 朱惠明, 刘玉杰, 黄友明[1]2007年在《受控凋亡素基因逆转录病毒载体诱导人肝癌细胞凋亡》文中认为目的:构建受控重组凋亡素基因逆转录病毒载体,观察受四环素调控的凋亡素基因的表达对人肝癌细胞的影响。方法:构建重组逆转录病毒表达载体pRevTRE—VP3。调节载体pRevTet-Off和表达载体pRevTRE—VP3分别转染PT67包装细胞后,取其病毒上清液依次感染人肝癌细胞系HepG2,以四环素调控凋亡素基因在HepG2/Off-VP3细胞中的表达,以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:重组逆转录病毒载体pRevTRE—VP3构建成功;经PCR和RT—PCR证实凋亡素基因在HepG2细胞中得到了表达;HepG2/Off-VP3—8细胞在无四环素培养环境中凋亡率明显高于在1μg/ml四环素环境中的细胞凋亡率(P＜0．05)。结论:凋亡素基因经RevTet系统导入人肝癌细胞HepG2后,可在四环素调控下表达凋亡素并诱导HepG2细胞凋亡。
顾红祥[2]2003年在《受控凋亡素基因逆转录病毒载体诱导人肝癌细胞凋亡研究》文中指出目的：构建可经四环素调控的重组凋亡素基因逆转录病毒载体，观察受四环素调控的凋亡素基因的表达对人肝癌细胞的影响。 方法：将凋亡素基因克隆入逆转录病毒质粒载体pRevTRE，构建出重组载体pRevTRE-VP3。质粒载体pRevTet-Off、pRevTRE-VP3以磷酸钙共沉淀法分别转染PT67包装细胞，经抗生素筛选及病毒滴度测定选取稳定产病毒的包装细胞株PT67/Off和PT67/VP3。取PT67/Off和PT67/VP3细胞病毒上清液依次感染人肝癌细胞系HepG2，用抗生素筛选出抗性细胞株HepG2/Off-VP3。通过向培养液中加入或去除四环素调控凋亡素基因在HepG2/Off-VP3细胞中的表达，Annexin V-FITC/PI双染色后，以流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果：经酶切和测序鉴定，凋亡素基因被正确克隆到逆转录病毒载体pRevTRE；筛选出稳定产病毒的包装细胞株PT67/Off和PT67/VP3，其病毒滴度分别为1×10~4cfu/ml和3×10~4cfu/ml；获得可经四环素调控凋亡素基因表达的人肝癌细胞株HepG2/Off-VP3-8，经PCR和RT-PCR证实凋亡素基因已整合于HepG2/Off-VP3-8细胞DNA，并得到了表达；HepG2/Off-VP3-8细胞在无四环素培养环境中培养24小时、48小时和72小时凋亡率明显高于在1μg/ml四环素环境中相同时间点的细胞凋亡率，两者差异有显着性。 结论：(1)成功构建了可调控凋亡素基因表达的重组逆转录病毒载体pRevTRE-VP3；(2)凋亡素基因经RevTet系统导入人肝癌细胞HepG2后，在四环素调控下表达凋亡素并诱导HepG2细胞凋亡。
陈立刚[3]2006年在《含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究》文中提出本研究将新城疫病毒HN基因与人白细胞介素18基因融合表达并与凋亡素VP3基因共同克隆入真核表达载体pIRESneo,构建了能够同时表达上述3种外源基因的重组真核表达质粒,并对重组质粒进行了表达鉴定。将重组质粒pIRVP3IL-18HN转染胃癌细胞BGC-823,采用各种细胞生物学方法观察了重组质粒pIRVP3IL-18HN转染致BGC-823肿瘤细胞的死亡方式及通路。实验结果表明,重组质粒pIRVP3IL-18HN转染最终导致肿瘤细胞凋亡,主要是通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射所构建的重组质粒pIRVP3IL-18HN,电镜及病理组织学切片显示肿瘤细胞存在凋亡现象,对实验组小鼠脾淋巴细胞亚群分类检测结果显示,重组质粒可不同程度地提高CD4+、CD8+ T淋巴细胞数量,推测重组质粒pIRVP3IL-18HN主要通过恢复机体的细胞免疫水平来提高其抑制肿瘤的作用。本研究提示,重组质粒pIRVP3IL-18HN在动物体内发挥了抗肿瘤作用,并且HN基因、IL-18基因和VP3基因具有协同抑瘤效应。
徐晓红[4]2010年在《抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用》文中研究表明由抗体介导的免疫靶向治疗是肿瘤生物治疗的主要组成部分,但其发展仍面临诸多挑战,如作为靶向工具的抗体分子量比较大、侵透性差、稳定性弱；所应用抗体多为鼠源抗体,免疫原性较高；所应用抑癌分子特异性较低,存在损伤正常细胞的隐患等。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种广泛存在于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) T84.66对CEA具有较高特异性,已普遍应用于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的诊断和免疫治疗,其疗效已为临床Ⅰ期试验所证实。且scFv T84.66具有结合活性高、侵透性强、免疫原性低和廓清快等优点。scFv T84.66同其它单链抗体一样具有先天缺陷,如较亲本抗体亲合力有所下降；在体温条件下稳定差较差；特定情况下会出现聚集倾向等,这可能与scFv的轻、重链可变区存在非共价键有关,但这种现象会通过引入链间二硫键而有所改观,即将scFv改构为稳定性较高的二硫键稳定型单链抗体(disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv)。Apoptin基因来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV),能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无细胞毒作用。另外,肿瘤的放射治疗和多数化学治疗药物通过p53发挥作用,一旦p53突变即会形成耐药,而Apoptin的凋亡诱导作用不依赖p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影响,bcl-2分子的存在反而能够增强其作用。因此,Apoptin基因已广泛应用于肿瘤基因治疗研究领域。本研究通过生物信息学方法设计scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,将Apoptin基因通过柔性肽序列连接至scdsFv T84.66下游,构建并表达了具有特异性识别／结合CEA功能和特异性杀伤肿瘤细胞功能的抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin,并在体内、外对其抑瘤作用进行了分析。
管国芳[5]2006年在《联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究》文中提出本研究将叁个抑瘤机制不同的抗肿瘤基因鸡贫血病毒VP3、新城疫病毒HN及IL-18基因叁者联合,分别以真核表达质粒pVAX1及鸡痘病毒FPV为载体,构建了含有上述叁种基因的真核重组质粒pVVP3IL-18HN及重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN,并对两者进行了体内外抑瘤实验的研究,观察了叁种基因的协同抑瘤作用,为在一个载体内实现联合基因治疗奠定了基础。首先将真核重组质粒pVVP3IL-18HN转染人喉癌Hep-2细胞,通过RT-PCR、western-blot法及间接免疫荧光分析表明,外源基因VP3基因及IL-18HN嵌合基因在Hep-2细胞中获得了正确的表达;采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、电子显微镜超薄切片、基因组DNA电泳、流式细胞仪结合DCFA染色、罗丹明123染色、MHC-I分子表达检测等方法观察了pVVP3IL-18HN对Hep-2肿瘤细胞的体外杀伤作用及其作用机制,实验结果显示,该重组质粒对Hep-2细胞具有明显的杀伤作用,作用最终将导致肿瘤细胞凋亡,推测其所诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体途径发生的;另外,pVVP3IL-18HN还上调了肿瘤细胞表面MHC-I分子的表达,提高了肿瘤细胞的免疫原性。其次本研究还建立了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,观察了pVVP3IL-18HN的体内抑瘤效应;通过对抑瘤率、小鼠脾细胞淋巴细胞亚群分类及特异性细胞毒CTL活性的检测,比较了单基因疫苗与联合基因疫苗的体内抑瘤效果及其对机体的免疫刺激作用,结果表明:联合基因疫苗pVVP3IL-18HN的抑瘤率及对机体抗肿瘤主动免疫的诱导作用明显高于上述基因的单基因疫苗pVVP3、pVIL-18及pVHN,说明克隆在同一载体上的鸡贫血病毒VP3基因、IL-18基因和HN基因在动物体内应用可产生协同的抗肿瘤效应。本研究通过同源重组成功的筛选出了一株具有良好遗传稳定性的重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN。运用Southern blot、Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光等方法检测外源基因重组情况及重组鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞内的表达。实验结果证明,外源基因已重组入鸡痘病毒基因组中,且可在鸡胚成纤维细胞内有效表达。采用MTT法、吖锭橙/溴化乙锭染色、基因组DNA电泳、流式细胞仪检测细胞内活性氧水平、线粒体膜电位及MHC-I分子的表达等方法观察并比较了含叁基因的重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN与含单基因的重组鸡痘病毒vFVVP3、vFVHN对Hep-2肿瘤细胞的体外杀伤作用及其对肿瘤细胞免疫原性的影响。实验结果证明,叁联重组鸡痘病毒vFVVP3IL-18HN在体外对肿瘤细胞的抑制作用及对肿瘤细胞免疫原性的增强作用要明显强于单基因的重组鸡痘病毒vFVVP3及vFVHN,说明叁联重组鸡痘病毒载体中携带的的叁个抑癌基因发挥了协同抑瘤作用;另外,对其作用机制的研究表明,重组鸡痘病毒的感染最终导致肿瘤细胞凋亡,推测重组鸡痘病毒所诱导的细胞凋亡路径可能是线粒体途径。此外,我们还借鉴了prime-boost的加强免疫策略,建立了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,利用本研究所构建的携有相同基因的两种不同载体抗肿瘤叁基因疫苗rDNA和rFPV,分别以不同免疫策略,进行了荷瘤小鼠基因免疫治疗的实验研究,通过对基因免疫治疗小鼠脾CD4+、CD8+ T细胞亚群的数量、脾细胞特异性CTL杀伤活性及抑瘤率的检测,探讨应用不同载体的两种疫苗以不同方式进行联合免疫,对以上两种疫苗免疫应答及抑瘤效果的影响。结果表明,应用prime-boost联合免疫组小鼠的细胞免疫应答水平及抑瘤效果均明显高于2个单独免疫组,证实了rDNA+rFPV,即以治疗性rDNA疫苗进行基础免疫,以rFPV疫苗进行加强免疫的Prime-Boost加强免疫治疗策略能诱导荷瘤小鼠机体产生更强大的特异性抗肿瘤主动免疫,对肿瘤细胞的杀伤作用最大。而与此对应的,rFPV+rDNA联合免疫策略总体效果则与单一疫苗的水平相当。从而提示我们,合适的联合免疫方案对免疫效果的提升具有重要的作用。
杨恩成[6]2010年在《特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用》文中认为本研究利用分子生物学和免疫学等技术和手段,探索了利用多结构域嵌合蛋白提高裸质粒DNA转导效率的问题。首先,在PCR方法分别克隆了GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147序列,并将其克隆于酵母表达载体pPIC9K,成功构建了酵母表达质粒pPI-G、pPI-NG、pPI-TG和pPI-TNG,并在酵母菌株GS115内对目的蛋白进行了表达,通过对表达时间、温度、转速、甲醇浓度等条件的优化,最终获得了目的蛋白G、NG、TG和TNG。基于GAL4特异性识别／结合序列UAS、EGFP基因和Apoptin基因,成功构建了能够被融合蛋白特异性识别／结合的真核表达质粒DNA,并在体外对融合蛋白与UAS质粒的结合效率和条件进行了探索。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术、AnnexinV染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了融合蛋白介导的重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导和抑制作用。实验结果表明,融合蛋白能够有效介导重组质粒对人肝癌细胞HepG-2的转导,并能够实现对人肝癌细胞HepG-2生长的抑制。本研究复制了C57BL／6小鼠荷小鼠肝癌(H22)肿瘤模型,通过瘤内注射融合蛋白-重组质粒复合物的方式,检测抑瘤率、生存期等指标,探讨了融合蛋白介导的重组质粒在动物体内的转导作用和对体内实体肿瘤的抑制作用。实验结果表明,融合蛋白在动物体内也可有效介导重组质粒的转导,并能够实现对C57BL／6小鼠荷小鼠H22肿瘤模型实体肿瘤的抑制。上述研究为研制安全、高效、低毒的裸质粒DNA转导辅助系统,拓展裸质粒DNA的应用空间奠定了基础。
高鹏[7]2011年在《特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定》文中指出利用基因工程操作技术克隆了4个分别含有表达产物为147个氨基酸的酵母转录激活因子核苷酸序列和(或)核定位信号(NLS)和(或)Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)穿膜肽(Tat)的嵌合核苷酸序列,并分别命名为GAL4/147、NLS-GAL4/147、Tat-GAL4/147和Tat-NLS-GAL4/147。将上述核苷酸序列克隆入原核表达载体pET28a(+),分别构建了原核表达质粒pET28-G(含GAL4/147序列)、pET28-NG(含NLS-GAL4/147序列)、pET28-TG(含Tat-GAL4/147序列)和pET28-TNG(含Tat-NLS-GAL4/147序列)。将原核表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并对诱导时间、培养温度、培养转速、IPTG浓度等表达条件进行优化,从获得目的蛋白G (pET28-G表达产物)、NG (pET28-NG表达产物)、TG (pET28-TG表达产物)和]NG (pET28-TNG表达产物)。结合本课题组构建的含有能够被GAL4识别和结合的半乳糖上游激活序列(UAS)、绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒(pUAS-EGFP),对所表达蛋白在细胞内和细胞外水平的UAS序列特异性结合和转导功能进行了探讨。结果表明,G、NG、TG和TNG均可有效的识别和结合含有UAS序列的质粒DNA；含有Tat片段的TG和TNG能够有效的将携带UAS序列的pUAS-EGFP质粒转导入真核细胞,且实现所转导pUAS-EGFP质粒外源基因(EGFP)的表达。结合本课题组构建的含有UAS序列、凋亡素基因(Apoptin)的真核表达质粒pUAS-Apoptin和所制备的多结构域嵌合蛋白,在体内、外分别对肝癌细胞HepG-2和C57BL/6小鼠荷肝癌模型进行了抑瘤作用研究。MTT检测、AO/EB检测、DAPI检测、Caspase酶检测、线粒体膜电位检测、细胞活性氧水平检测等细胞水平检测结果和免疫指标、抑瘤率、平均生存期、肿瘤生长趋势等模型动物体内检测结果表明,多结构域嵌合蛋白可以有效的介导pUAS-Apoptin对人肝癌细胞HepG-2和模型动物体内实体肿瘤的抑制。
郑洪玲[8]2007年在《基于甲病毒复制子的核酸疫苗的构建及实验免疫研究》文中研究指明本研究旨在探讨表达新城疫病毒HN基因和鸡贫血病病毒Apoptin基因的“自杀性”DNA疫苗的抑瘤效应。以新城疫病毒HN基因及鸡贫血病毒Apoptin基因为效应基因,利用真核表达载体pIRESneo和西门利克(Semliki)森林脑炎病毒cDNA复制子为基础构建了pSFV载体,插入目的基因HN和Apoptin,分别构建了两种“自杀性”DNA疫苗,pSFV-HN和pSFV-Apoptin。采用限制性酶切、吖啶橙/溴化乙锭染色结合荧光显微镜观察、Western blot、RT-PCR等方法检测了外源基因的重组和在肿瘤细胞内的表达。结果显示,外源基因已经插入pSFV载体中,且可以在HCT-116细胞中有效表达。采用MTT法和DAPI染色等方法观察了重组质粒转染HCT-116细胞后的抑癌效应和死亡方式。结果显示,重组质粒能够有效抑制肿瘤细胞,并使肿瘤细胞呈现典型的凋亡特征。本研究复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,探讨了“自杀性”DNA疫苗的体内抑瘤作用及其诱导的体液和细胞的免疫水平。结果显示,两种“自杀性”DNA疫苗均能有效抑制实体肿瘤的生长,并且能够有效刺激机体产生抗肿瘤免疫反应,为基因工程抗肿瘤治疗性疫苗的研发策略提供了新思路。
曾飒[9]2016年在《慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建》文中指出目的:口腔黏膜疾病是发生于口腔黏膜的所有疾病的总称,其种类繁多,病因复杂且多数疾病的致病机理尚未完全明确。其中起源于口腔黏膜的恶性肿瘤不仅发病率高而且成为影响人们生活质量的常见疾病,甚至严重威胁着生命健康。由于正常的OMECs体外培养困难,对细胞营养要求高而且存活时间短,一般传代培养5~6代后即开始衰老死亡,这严重限制了我们对其发病机制的深入研究,因此,迫切需要一个能够长期稳定传代的OMECs系来作为体外细胞实验模型。本文研究目的:1.使用慢病毒过表达系统构建pLVX-puro-hTERT重组质粒并对其进行包装;2.以包装成功的慢病毒颗粒感染口腔黏膜上皮细胞(OMECs),建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的口腔黏膜上皮细胞系,为探索建立高效、稳定的永生化口腔上皮细胞系提供新的思路。方法:1.通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR方法扩增获得hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体p LVX-puro-hTERT并使用辅助包装系统将其包装为慢病毒颗粒;2.通过使用DisepaeⅡ酶分离,结合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit无血清培养基培养,体外分离培养获取原代OMECs,并用包装好的慢病毒颗粒感染OMECs,通过嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆,进行传代培养,倒置相差显微镜下观察其生物学性状;3.采用qRT-PCR和Western blot检测培养7代后感染细胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.通过RT-PCR获得目的基因片段hTERT,核酸电泳检测可见3kb处有一条亮带,与目的基因大小基本一致。2.重组质粒pLVX-puro-hTERT经NheI和EcoRI双酶切鉴定后,可在3.3kb左右处得到一条亮带,初步表明hTERT已成功插入慢病毒载体pLVX-puro。3.通过对重组质粒进行DNA测序,进一步证实重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT构建成功。4.显微镜下观察可见成功转染hTERT的OMECs与正常OMECs形态相似,细胞呈多边形,“铺路石”状紧密排列,具有典型的上皮细胞特征。而转染空载体后的细胞形态较不规则,未转染细胞和转染空载体后的细胞传4-5代后生长缓慢,逐渐衰老死亡,而转染hTERT后的OMECs仍生长迅速并且增殖稳定。5.qRT-PCR检测转染后OMECs中hTERT的相对表达,结果显示:hTERTmRNA在转染细胞中高表达,与正常OMECs组中hTERTmRNA的表达量呈显着性差异。表明慢病毒介导的hTERT基因片段已稳定整合到OMECs的基因组中并高表达(P<0.01)。6.Western blot结果显示在转染细胞组中hTERT蛋白成功表达,与正常细胞组呈显着差异。这说明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮细胞的基因组并可进行翻译。结论:本研究通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,初步证明了使用慢病毒载体介导hTERT基因永生化OMECs的可能性及优越性,为探索构建高效、稳定增殖的人永生化口腔粘膜上皮细胞细胞系提供了新思路。
参考文献：
[1]. 受控凋亡素基因逆转录病毒载体诱导人肝癌细胞凋亡[J]. 顾红祥, 朱惠明, 刘玉杰, 黄友明. 中国临床医学. 2007
[2]. 受控凋亡素基因逆转录病毒载体诱导人肝癌细胞凋亡研究[D]. 顾红祥. 暨南大学. 2003
[3]. 含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究[D]. 陈立刚. 吉林大学. 2006
[4]. 抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用[D]. 徐晓红. 吉林大学. 2010
[5]. 联合应用NDV HN基因、CAV VP3基因及IL-18基因对喉癌细胞的杀伤作用及其体内抑瘤效应研究[D]. 管国芳. 吉林大学. 2006
[6]. 特异性多结构域DNA转导重组嵌合体在毕赤酵母中表达及其体内外转导作用[D]. 杨恩成. 吉林大学. 2010
[7]. 特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D]. 高鹏. 吉林大学. 2011
[8]. 基于甲病毒复制子的核酸疫苗的构建及实验免疫研究[D]. 郑洪玲. 吉林大学. 2007
[9]. 慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建[D]. 曾飒. 兰州大学. 2016
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