李莉艳, 莫秋华, 徐湘民[1]2003年在《反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血》文中提出目的 建立一种简便快速筛查非缺失型α-地中海贫血点突变的反向点杂交 (reverse dotblot,RDB)技术。方法 将生物素直接标记在引物上 ,选择性扩增人α2珠蛋白基因 ,将 PCR产物与固化在膜条上的寡核苷酸探针杂交 ,洗膜、显色后分析结果。结果 采用生物素标记的引物 Bio- C1和 Bio- C3可选择性扩增α2珠蛋白基因 ,PCR产物长度为 10 85 bp,该标记片段与固相探针构成的反向点杂交检测体系 ,可以分辨出中国人群中已知的 6种非缺失型α-地中海贫血点突变。结论 该反向点杂交检测体系无需巢式 PCR扩增 ,一步选择性扩增的α2珠蛋白基因产物即可用于杂交 ;无需进行检测标记物 (如生物素 )反应 ,而将生物素直接标记在引物上 ;无需不同的洗膜条件 ,故较已报道的同类方法更为简单易行。RDB技术可用于快速诊断中国人非缺失型α-地中海贫血点突变。
李莉艳[2]2003年在《反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血》文中研究说明目的 建立一种简便快速的筛查中国人非缺失型α-地中海贫血点突变的反向点杂交(reverse dot blot，RDB)技术，使之可以应用于临床诊断及大人群筛查工作中。 方法 1．标准DNA样品准备及罕见突变样品的构建：DNA的抽提按经典的酚-氯仿抽提法，DNA样品经测序确定基因型作为本实验的标准样品。罕见突变样品α~(CD30)α，α~(CD59)α和α~(WS)α的构建是通过基于PCR设计的人工致突变反应体系从野生型样品中制备所需点突变的目的基因，再运用经典的基因工程技术将诱变得到的目的基因进行克隆并测序鉴定。 2．RDB膜条的制备：设计、合成寡核苷酸探针，5’端加-NH_3标记。膜条的制备由本实验室完成。 3．PCR选择性扩增人α~2珠蛋白基因：合成特异性扩增α~2珠蛋白基因的引物C1、C3，将生物素直接标记在引物5’端上，以DNA样品及诱变成功的质粒为模板，用这一对引物可以选择性地扩增出一长1,085bp的α~2珠蛋白基因，包含了中国人已发现的6种非缺失型α-地贫的突变位点。可以直接用于杂交。 4．杂交：将PCR产物与固化在膜条上的寡核苷酸探针杂交，洗膜、显色后分析结果。 结果 采用生物素标记的引物Bio-C1和Bio-C3可选择性扩增α~2珠蛋白基因，PCR产物长度为1,085bp，该标记片段与固定在膜条上的寡核苷酸探针构成的反向点杂交检测体系，可以分辨出中国人群中已知的6种非缺失型α-地贫血点突变，与DNA序列测定结果完全吻合，且本法操作较现有诊断非缺失α-地贫其他方法简便易行，故可用于临床快速诊断中国人非缺失型α-地中海贫血点突变。 结论 该反向点杂交检测体系膜条制备简单快速；无需用巢式PCR扩增产物，一步选择性扩增的α2珠蛋白基因产物即可用于杂交；无需进行检测标记物(如生物素)反应，而将生物素直接标记在引物上；无需不同的洗膜条件，一次可同时检测6种不同非缺失型a-地贫点突变，故较已报道的同类方法更为简便易行.我们应用该技术与PCR-SSCP和PCR-TGGE技术对非缺失型Q-地贫进行了对比分析，进一步证实该技术是快速诊断非缺失型Q-地贫的有效方法。
陈孜孜[3]2014年在《泸州市儿童β地中海贫血基因突变类型研究》文中研究指明目的：地中海贫血是由于血红蛋白基因的突变导致珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病，包括α地中海贫血和β地中海贫血两种类型，是世界上最常见和发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一。在国外以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国以广东、广西、海南、四川等省（自治区）较常见。本病具有高度的遗传异质性和极大的地域民族差异，不同地区人群的发病率和基因背景差异均很大，因此，研究这些变化特征可为本病的预防及诊断提供科学依据。本课题通过了解泸州市β地中海贫血的基因突变类型及构成比，为本地区地中海贫血的诊断和预防提供理论依据，同时探讨基因诊断在地中海贫血中的重要作用。方法：1.全部病例来源为2011年1月至2013年6月在泸州医学院附属医院儿科门诊（包括儿保门诊）及住院部就诊儿童。2.所有病例均进行血常规检查，筛查出的血红蛋白（Hb）<110g/L,红细胞平均容积（MCV）<80fl或红细胞平均血红蛋白（MCH）<27pg的小细胞低色素贫血患儿，进一步做血红蛋白电泳检测。3.血红蛋白电泳检测结果中判为β地中海贫血表型阳性者，即MCV<80%，HbA2>3.2%或HbF>3.1%，进行β地贫基因检测。4.用聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)结合反向斑点杂交技术(reverse dot blot，RDB)检测常见β-珠蛋白基因上的17个位点突变，包括CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C﹥T)、-28(A﹥G)、CD71-72(+A)、CD17(AAG﹥TAG)、βE (GAG→AAG)、CD31(-C)、CD43(GAG﹥TAG)、-32(C﹥A)、-29(A﹥G)、-30(T﹥C)、CD14-15(+G)、CAP+40-43(-AAAC)、起始密码子Int(ATG﹥AGG)、CD27／28(+C)、IVS-Ⅰ-1（G﹥T）、IVS-Ⅰ-5（G﹥C）。首先制备DNA标本，通过PCR扩增、杂交、洗膜等步骤，最后显色观察结果，膜条有蓝色杂交斑点为阳性结果。结果：1.在进行地贫基因检查的114例β-地贫表型阳性儿童中，检测到β地贫基因突变者72例，占总检测对象的63.16%。2.72例β-地贫中共检出7种基因突变位点，分别为CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD17（AAG﹥TAG）、-28（A﹥G）、CD71-72（+A）、βE(GAG→AAG)、-32（C﹥A）。其中以CD17（AAG﹥TAG）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD41-42（-TTCT）3种基因型最为常见，占90.22%。3.基因突变组成15种基因型，包括52例杂合子(72.22%)、13例双重杂合子(18.05%)、3例叁重杂合子(4.17%)和4例纯合子(5.56%)。杂合子基因型分别为: CD17(27.78%)、IVS-Ⅱ-654(22.22%)、CD41-42(19.44%)和-28(2.78%)。双重杂合子基因型分别为：IVS-Ⅱ-654/CD17(8.33%)、CD41-42/CD17(2.78%)、-28/CD17(1.39%)、CD41-42/CD71-72(1.39%)、CD41-42/βE(1.39%)、CD41-42/IVS-Ⅱ-654(1.39%)、CD41-42/-32(1.39%)。叁重杂合子基因型分别为: IVS-Ⅱ-654+CD17/-32(2.78%)、CD41-42+IVS-Ⅱ-654/-28(1.39%)。纯合子基因型为: CD41-42/CD41-42(2.78%)和IVS-Ⅱ-654/IVS-Ⅱ-654(2.78%)。结论：1.泸州地区儿童β-地贫基因突变以CD17（AAG﹥TAG）、IVS-Ⅱ-654（C﹥T）、CD41-42（-TTCT）最为多见。2.基因型以杂合子频率较高。3.泸州地区儿童β地中海贫血检出率较高，应加强β地贫筛查，以做到及早诊断。4.RDB-PCR技术在β地贫的检测中诊断率高，适合于中国人群常见的突变类型β-地贫基因检测。
陈兴, 肖奇志, 于雯, 周玉球, 谢建红[4]2015年在《应用探针熔解曲线分析技术快速检测非缺失型α-地中海贫血》文中认为目的应用探针熔解曲线法检测3种常见非缺失型α-地中海贫血(αT-地贫)并进行临床评价。方法选取已经反向点杂交法(RDB)结合DNA测序方法确诊为3种常见αT-地贫标本149份(羊水标本6份),其中血红蛋白(Hb)CS 63例、Hb QS22例、Hb WS 43例和Hb CS/Hb WS双重杂合子1例及20例正常α-珠蛋白基因型,通过盲法方式,采用探针熔解曲线法进行检测其αT-地贫以评价该技术的特异性、准确度和可靠性。结果盲法分析结果显示,探针熔解曲线法对αT-地贫基因型经RDB结合DNA测序方法确诊的DNA标本的诊断准确度达到100%。结论探针熔解曲线法能快速准确检测3种常见αT-地贫,可用于临床及产前诊断。
张力, 高秀蓉, 颜慕霞, 李彦媚[5]2015年在《应用高效液相色谱技术检测小儿β地中海贫血的研究》文中认为目的探讨应用高效液相色谱技术(HPLC)快速诊断小儿β地中海贫血(β地贫)的实际应用价值。方法应用HPLC技术,对150例临床疑似珠蛋白生成障碍性贫血患儿进行血红蛋白分析,检测其血红蛋白A2(Hb A2)与血红蛋白F(Hb F)的含量。同时对上述患儿采用缺口聚合酶链反应技术(GAP-PCR)检测α地中海贫血(α地贫)缺失型突变,反向点杂交法(RDB)检测α地贫基因点突变与17种β珠蛋白基因突变。结果 1.以Hb A2>4.0%或Hb F>10.0%作为HPLC方法诊断β地贫的诊断标准,共检测出90例β地贫。与基因分析方法比较,应用HPLC方法检测小儿β地贫的敏感性为98.9%,特异性为100.0%,准确性为99.3%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为98.3%。2.β地贫纯合子或双重杂合子与β地贫杂合子的Hb F含量有显着性差异。结论应用HPLC方法检测小儿β地贫敏感性高,特异性强,与基因分析方法有很高的符合率,且其操作简便,快速,适用于小儿β地贫的诊断分型。
肖奇志, 周玉球, 张永良, 谢建红, 郑勤[6]2012年在《单管多重PCR结合RDB技术在α-地贫产前诊断中的应用》文中提出目的基因诊断结果在α-地贫的产前诊断中具有决定意义。采取两种不同技术原理的方法验证产前诊断结果,是保证产前诊断结果可靠性的基本要求。本文探讨检测常见非缺失型α-地贫的RDB技术作为单管多重PCR技术产前诊断α-地贫验证方法的可行性。方法采用双盲法,对73例α-地贫产前诊断的标本分别采用针对中国人3种常见缺失型α-地贫突变的单管多重gap-PCR技术和针对常见3种非缺失α-地贫点突变的RDB法进行分析,根据单管多重PCR技术扩增产物电泳图谱和RDB膜条上显色的斑点分别判断某一个标本缺失型和非缺失α-地贫的突变类型,且与引产或出生后胎儿脐带血中HbBart′s定量结果进行比对。结果单管多重PCR和RDB技术均能分别准确检出常见缺失型和非缺失型α-地贫各种突变类型。如将两者结合分析,还能提供相互佐证的重要信息:对于--SEA、-α3.7和-α4.2自身或相互组合的各种基因型标本,其RDB膜条的杂交斑点均不显色;而--SEA与αCSα、αQSα和αWSα组合的基因型标本该突变的正常对照点不显色。α-地贫产前诊断结果与胎儿脐带血电泳结果完全吻合。结论单管多重PCR结合RDB技术同时应用于α-地贫的基因诊断,可保证产前诊断的可靠性,值得在临床遗传诊断实验室中推广应用。
参考文献：
[1]. 反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血[J]. 李莉艳, 莫秋华, 徐湘民. 中华医学遗传学杂志. 2003
[2]. 反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血[D]. 李莉艳. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[3]. 泸州市儿童β地中海贫血基因突变类型研究[D]. 陈孜孜. 泸州医学院. 2014
[4]. 应用探针熔解曲线分析技术快速检测非缺失型α-地中海贫血[J]. 陈兴, 肖奇志, 于雯, 周玉球, 谢建红. 国际检验医学杂志. 2015
[5]. 应用高效液相色谱技术检测小儿β地中海贫血的研究[J]. 张力, 高秀蓉, 颜慕霞, 李彦媚. 中国优生与遗传杂志. 2015
[6]. 单管多重PCR结合RDB技术在α-地贫产前诊断中的应用[J]. 肖奇志, 周玉球, 张永良, 谢建红, 郑勤. 国际检验医学杂志. 2012
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