流产布鲁菌vhpA基因的功能研究以及评价基因启动子活性质粒的构建和应用

论文摘要

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,该病呈全球性分布,主要引起公畜生殖障碍和孕畜流产,通过接触患病动物或食用带有病原菌的食物传染给人,对畜牧业发展和人类健康构成巨大的威胁。布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌,可入侵宿主细胞并在胞内生存和繁殖,并建立慢性感染,但其致病机制尚未完全揭示,因此本研究通过对流产布鲁菌毒力相关基因vhpA和vhpB1/2的功能分析,以及构建报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,旨在进一步阐明布鲁菌的相关致病机制,并为布鲁菌毒力相关基因的研究奠定基础。1.小蛋白VhpA在布鲁菌致病过程中的功能研究通过生物信息学分析发现vhpA基因编码一个在根瘤菌目中高度保守的小蛋白。为研究该基因的功能,构建流产布鲁菌S2308菌株vhpA基因缺失株以及互补株。对缺失株的表型分析结果表明,缺失株的生长曲线和LPS结构与野毒株无明显差异。通过比较缺失株与野毒株的毒力发现该基因与流产布鲁菌毒力相关,但与布鲁菌对细胞的黏附、入侵,以及胞内存活能力不相关。耐受性试验结果表明,缺失株对H2O2、多粘菌素B和硝普化钠的敏感性与野毒株无明显差异。进一步研究表明,苜蓿中华根瘤菌和土壤农杆菌中vhpA基因的同源基因无法回复缺失株的毒力。2.小蛋白VhpA调控布鲁菌毒力机制的研究为进一步研究vhpA基因的功能,通过比较转录组测序,比较缺失株和野毒株在RNA转录水平的差异,发现vhpA基因的缺失影响流产布鲁菌多个基因的转录。通过实时荧光定量PCR验证,确定了5个下调基因和4个上调基因,并分别将下调基因在缺失株中回补表达,将上调基因在野毒株中过表达;测定重组菌株对小鼠的致病性,结果发现vhpB1和vhpB2两个基因的过表达可以显著减弱野毒株对小鼠的致病性。对vhpB1基因和vhpB2基因编码的蛋白进行生物信息学分析发现这两个蛋白高度同源,且通过RT-PCR验证表明两个基因共转录为一个多顺反子mRNA;为进一步研究vhpB1和vhpB2的功能,后续成功构建了vhpB1/2基因缺失株和互补株,发现这两个基因的缺失同样可以显著减弱流产布鲁菌对小鼠的致病性。vhpB1基因和vhpB2基因被注释为编码未知功能的假定蛋白,进一步通过免疫印迹分析、测定启动子活性和过表达ORF序列证明这两个基因在流产布鲁菌中可以翻译为蛋白质。3.报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建和应用vhpB1/2基因可能通过不同的转录和表达水平对布鲁菌毒力进行精确调控,启动子作为启动基因转录和表达的重要结构,vhpB1/2基因在特定条件下的转录和表达可通过测定其启动子的活性来进行分析,因此需要通过精确分析vhpB1/2基因启动子的活性来研究其精确调控机制。基于NanoLuc荧光素酶高度灵敏的特点,本研究成功获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。

论文目录

摘要

Summary

第一章文献综述

1.布鲁菌病

2.病原学特点

2.1 分类

2.2 形态结构

3.布鲁菌主要毒力因子

3.1 脂多糖（LPS）

3.2 Ⅳ型分泌系统（T4SS）

3.3 双组份调控系统（TCS）

4.小蛋白研究概述

5.NanoLuc荧光素酶概述

6.本研究的目的和意义

第二章小蛋白VhpA在布鲁菌致病过程中功能的研究

1 材料

1.1 菌种、细胞、质粒和实验动物

1.2 主要仪器和设备

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 试剂和培养基配置

2.2 生物信息学分析

2.3 引物设计

2.4 vhpA基因启动子活性分析

2.5 流产布鲁菌全基因组提取

2.6 质粒的构建

2.7 vhpA基因缺失株和互补株的构建

2.8 生长曲线的测定

2.9 LPS结构分析

2.10 耐受性试验

2.11 RNA提取以及荧光定量PCR分析

2.12 细胞感染试验

2.13 小鼠致病性分析

3.结果

3.1 vhpA基因编码一种根瘤菌目中高度保守的小蛋白

3.2 vhpA基因启动子具有较高的翻译活性

3.3 vhpA基因缺失株的构建

3.4 vhpA基因的缺失未引起布鲁菌表型的变化

3.5 vhpA基因在布鲁菌感染小鼠的过程中发挥重要作用

3.6 vhpA基因与布鲁菌对细胞的黏附、入侵和胞内存活无关

3.7 vhpA基因不参与布鲁菌抵抗免疫相关杀菌成分

3.8 苜蓿中华根瘤菌和土壤农杆菌的同源基因不能恢复vhpA缺失株的毒力

4 讨论

第三章小蛋白VhpA调控布鲁菌毒力机制的研究

1 材料

1.1 菌种、细胞、质粒和实验动物

1.2 主要仪器和设备

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 试剂和培养基配制

2.2 RNA提取和转录组测序

2.3 引物设计

2.4 荧光定量PCR分析

2.5 生物信息学分析

2.6 质粒构建

2.7 过表达菌株、缺失株和互补株的构建

2.8 小鼠致病性分析

2.9 启动子活性检测

2.10 转录模式检测

2.11 免疫印迹分析

3 结果

3.1 vhpA基因的缺失引起多基因表达模式的改变

3.2 VhpA调控多个关键基因影响布鲁菌毒力

3.3 小蛋白VhpA调控vhpB1和vhpB2 基因表达

3.4 vhpB1和vhpB2 基因共转录为多顺反子mRNA

3.5 vhpB1和vhpB2 基因氨基酸序列高度同源

3.6 vhpB1/2 基因与布鲁菌毒力相关

3.7 vhpB1和vhpB2 基因通过翻译为蛋白发挥功能

4 讨论

第四章报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建和应用

1 材料

1.1 菌种、细胞、质粒和实验动物

1.2 主要仪器和设备

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 试剂和培养基配置

2.2 引物设计

2.3 原核表达质粒的构建

2.4 Nluc蛋白表达和纯化

2.5 多克隆抗体制备及ELISA效价测定

2.6 报告启动子活性质粒的构建

2.7 布鲁菌重组菌株的构建

2.8 免疫印迹分析

2.9 Nluc酶活性检测

3.结果

3.1 成功构建原核表达质粒并纯化Nluc蛋白

3.2 多克隆抗体效价测定及Nluc蛋白反应原性分析

3.3 成功构建启动子活性报告质粒

3.4 布鲁菌bcsp31 基因启动子和virB启动子活性分析

3.5 布鲁菌virB启动子胞内诱导活性分析

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简介

导师简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 连拯民

导师: 包世俊,于圣青

关键词: 流产布鲁菌,毒力基因,启动子活性

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学

基金: 中国农业科学院科技创新工程(SHVRI-ASTIP-2014-8),国家自然科学基金项目(31602070)

分类号: S852.61

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000165

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流产布鲁菌vhpA基因的功能研究以及评价基因启动子活性质粒的构建和应用

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