赵华燕[1]2004年在《利用反义RNA技术进行木质素生物合成调控的研究》文中认为木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成叁种相关酶咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)的基因对植物木质素生物合成途径调节的研究，取得如下进展：1． 农杆菌介导法将COMT和CCoAOMT基因的单价和双价的反义表达载体导入烟草，比较了两个甲基化酶的功能。PCR-Southern和Northern点杂交结果表明反义基因已整合到烟草基因组DNA上，并在转录水平表达。两种反义基因对木质素生物合成调节的效果显示，CCoAOMT能更有效地调节木质素生物总量的合成，COMT仅特异调节S木质素的合成。表达反义CCoAOMT基因的转基因毛白杨，内源CCoAOMT基因的表达在转录和蛋白水平均受到抑制，最终引起转基因植株木质素含量普遍降低，最多降低达26． 20％，筛选出木质素含量下降10％以上的转基因毛白杨株系8个，为源头治理造纸废水污染奠定了基础。2． 对克隆的．4CL基因进行了表达特性分析， RT-PCR分析表明，分离的毛白杨4CL基因主要在木质部丰富表达，叶中表达量较少，树皮中不表达。在毛白杨的一个生长季，该基因表达显示明显的双锋特征，该表达模式与木材早材和晚材的发育时期相吻合，表明分离的毛白杨4CL基因与木质素的生物合成密切相关。农杆菌介导法将反义4CL基因导入烟草和毛白杨，利用分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源4CL基因表达，能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深度与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关性，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。现己获得木质素含量下降10％以上的转基因株系3个，最多下降达41． 73％，可供中试与制浆实验，为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据。3.为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨基因组中分离得到‘袱厅(肉桂酸4一轻基化酶)基因启动子片段(GenBank注册号:AY351673)。GUS荧光活性分析和组织化学染色显示，该启动子在一些木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动子受伤诱导。反义扰b月哪7基因在‘毋偏动子的调控下，会引起转基因烟草木质素均有不同程度的减少，但不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的乙丫泞启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。 4.首次从水稻中华10号(口娜a sativa L.ssP.joponica)分离了CCO月。彻?基因家族的叁个成员，对其基因结构及表达特性的分析表明，该基因家族的叁个成员与水稻的木质化进程关系密切，研究结果有助于了解单子叶植物中的甲基化途径发生机制，为高产水稻抗倒伏和茎杆饲料作物的遗传改良奠定了基础。关键词:木质素生物合成反义RNA制浆造纸/
路静[2]2004年在《利用反义RNA技术调节木质素生物合成的研究》文中研究表明木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成途径中的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)的基因调节植物木质素的生物合成，研究取得了如下进展： 1．农杆菌介导法将CCoAOMT和4CL基因的反义表达载体导入毛白杨中。PCR-Southern、RT-PCR和Western杂交检测结果显示，两个反义基因均已整合到毛白杨基因组DNA上，并在转录水平表达。通过分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源CCoAOMT或4CL基因的表达，均能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。研究中还发现，转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深浅与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关，因此，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。已筛选出木质素含量下降10％以上的转CCoAOMT基因毛白杨株系8个，最多降低26.20％；获得木质素含量下降10％以上的转4CL基因株系3个，下降最多达41.73％，可用于中试与制浆实验。该研究结果为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据，也为从源头治理造纸废水污染奠定了基础。 2．为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨(Populus tomentosa)基因组中分离得到木质素合成相关酶--肉桂酸-4-羟化酶(C4H)基因启动子片段(GenBank注册号：AY351673)。测序结果表明该启动子片段长1117bp，与杂交颤杨(P．kitakamiensis)C4H 5’非翻译区的上游片段同源性为94％。序列分析结果表明，该启动子包含转录因子MYB的结合位点CACCAACC和转录因子Myb26结合位点GTTAGGTT等保守序列，这与C4H参与苯丙酸代谢合成途径的生物学功能相吻合。GUS荧光活性分析和组织化学染色结果显示，该启动子在木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动子受伤诱导表达。反义艺之介川么胡，基因在乙萝刀启动子的调控下，使得转基因烟草木质素含量有不同程度的减少，且并不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的乙解启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。
赵华燕[3]2001年在《毛白杨木质素合成相关基因分离和转基因杨树植株获得》文中研究指明木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物，却是造纸工业污染的主要源头物质。本研究目的在于利用反义RNA技术，在分子水平调节木质素的生物合成，降低中国特有造纸树种毛白杨的木质素含量，培育更适于我国造纸工业的原料树种。以下为本研究已取得的相关研究进展：1 通过RT-PCR技术，从毛白杨中克隆了木质素生物合成的两个相关酶的cDNAs，它们分别为咖啡酸甲基转移酶（caffeic acid O-methyltransferase，COMT）和咖啡酰CoA甲基转移酶（caffeoyl Co-enzyme A O-methyltransferase，CCoAOMT）。序列分析显示了毛白杨这两个基因与杨属中其它种的相应基因cDNA核苷酸序列高度同源。Northern点杂交分析表明，COMT 和CCoAOMT基因在毛白杨正在生长的次生木质部中高水平表达，其表达高峰与树木的木质化进程同步；而在叶与叶柄中，这两个基因均不表达。COMT和CCoAOMT是木质素生物合成的相关酶，该表达特征与其基因功能相一致。本研究克隆的COMT 和CCoAOMT基因的cDNAs已在GenBank注册登记，接受号分别为AF237777和AF240466。2 通过一系列的DNA重组，构建了携带反义COMT 和CCoAOMT cDNA的反义表达载体以及同时整合反义COMT 与CCoAOMT cDNA的双价反义表达载体，PCR扩增与酶切检测确证构建无误。3 以田间取材的速生叁倍体毛白杨B19、B331及B304的茎尖、叶片与嫩茎为外殖体，首次获得了叁倍体毛白杨的组培再生试管苗，并建立了速生叁倍体毛白杨的组培再生系统，为通过基因工程改良其造纸性能奠定了基础。4 通过农杆菌介导，将反义CCoAOMT cDNA转入欧洲山杨与银白杨的杂交杨（P. tremula×P. alba）。经PCR，PCR-Southern及Southern检测，确认获得了转基因植株。以Digoxigenin标记的对应于CCoAOMT cDNA反义链的单链RNA为探针与转基因杂交杨总RNA进行Northern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA已在转录水平表达。
赵华燕, 张景昱, 刘惠荣, 王台, 宋艳茹[4]2002年在《抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成》文中提出咖啡酸-3-O-甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶,构建了它们的单价与双价反义表达载体,并用农杆茵介导转化烟草.PCR-Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中;Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达.对表达单个及两个甲基化酶反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明,反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降,但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT,并且两个基因同时被抑制时,降低幅度更大,说明它们具有协同效应.组织化学染色结果说明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显着减少.上述结果表明,抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径.
周冰彬[5]2009年在《赤霉素合成酶基因沉默诱导植物矮化的研究》文中认为矮化和盆栽的木本花卉植物在园林绿化、室内装潢等方面有着重要作用,现有的木本花卉主要以乔木和小乔木为多。在控制木本花卉高生长的因素中,赤霉素合成酶(GA20-oxidase)通过反馈调节赤霉素含量,影响植物的高生长,是最重要的内源影响因子之一。本研究利用反义RNA及RNA干扰技术,在烟草上对GA20-oxidase基因的表达进行抑制,为最终实现木本花卉植物矮化性状的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.从cDNA中克隆烟草NtGA20ox基因,构建了以NPTⅡ为标记基因的反义载体pBIantiW和RNA干扰载体pBIRNAiW;从载体pGEX-4T-2中克隆PttGA20ox基因,构建了以抗除草剂bar基因为标记基因的反义载体pBIbarantiG和RNA干扰载体pBIbarRNAiG。将四个载体转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中。2.建立并优化普通烟草W38及转基因烟草GW(转化超量表达PttGA20ox基因)的再生和遗传转化体系。继代培养基:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5g/L;生根培养基:1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5 g/L;分化培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂4.8 g/L。3.建立最优遗传转化程序。通过选择剂敏感性试验,确立了叶片不定芽诱导的选择剂浓度为:Kan 75 mg/L,Glu 0.5 mg/L。茎段增殖和生根的选择剂浓度为Kan150 mg/L,Glu 1.0 mg/L。结合Cef对农杆菌的抑菌效果,在遗传转化和再生、扩繁、生根时都选择250 mg/L为最适抑制浓度。对预培养时间、菌液侵染时间、菌液浓度、共培养时间、延迟选择时间、AS浓度等影响转化的因素进行研究,结果表明,预培养时间、延迟选择时间、AS浓度对转化的影响不大;当菌液浓度OD_(600)=0.6时,10～15 min为比较合适的菌液侵染时间,此时抗性芽的转化效率最高;共培养最适宜时间为2 d。4.对四种转化苗烟草AW(转反义NtGA20ox基因)、烟草RW(转反向重复NtGA20ox基因)、烟草AG(转反义PttGA20ox基因)、烟草RG(转反向重复PttGA20ox基因)进行叶片的再分化培养检测和分子生物学鉴定,证明目的片段已经插入到转基因植株基因组DNA中。5.对转基因植株进行移栽和表型性状的统计与观测。转基因植株AW、GW与对照W38相比,明显矮化,茎段增粗,节间距变短,叶片变大,生根时间推迟且根数量相对稀少。转基因植株AG、RG与对照GW相比也呈现矮化状态,节间距明显缩短,茎段粗细变化不明显,叶片细长与对照相似,根稀少,生根时间推迟。6.对转基因植株进行细胞学比较。显微观察显示,转基因植株在细胞层面上与对照植株有显着差异,生长初期叶片细胞更为致密,茎段细胞长度小于对照,实施RNA干扰的细胞甚至成为椭圆形,细胞长度远远小于对照。7.对转基因植株进行内源激素含量的测定,并对转化苗进行外源GA喷施实验。内源激素测定结果表明,转化苗体内ABA、ZR的含量与对照相比没有显着差异,而其体内的IAA、GA_3、GA_4含量明显低于对照。外源GA喷施实验表明,转基因造成的GA含量降低是可逆转的,外源GA的喷施,可以提高植株体内GA的含量,使转基因植株的矮化状态得到恢复。
李亚红[6]2004年在《转基因杨树作为新造纸资源植物的研究》文中研究指明制浆造纸工业中,化学方法去除木质素类原料既消耗大量化学品与能源,又会造成严重的环境污染。许多研究都致力于对造纸树种进行基因改良来改进脱木质素工艺。我们用反义RNA技术得到了过氧化物酶负调节的转基因杨树,研究了它们的木质素特性和制浆性能。结果表明转基因杨树生长正常,木质素含量降低,可望作为新的造纸资源植物生产出适合造纸工业用的木材。
黄克安[7]2009年在《反义RNA的作用机理及在农业上的应用》文中进行了进一步梳理反义RNA最初在原核细胞中被发现并广泛存在于多类生物中,通过与mRNA互补结合形成杂交链而抑制基因的表达,作用于DNA的复制、转录、翻译的过程,实现对基因表达的调控。目前人们利用反义RNA的这一特点,在动植物、微生物及医药等领域对生物基因进行有效调控并取得了显着的成就。
傅向东, 侯嵩生[8]1996年在《植物反义寡核苷酸的研究进展》文中研究说明本文介绍了近年来植物中反义寡核苷酸的研究现状，它包括反义ＤＮＡ、反义ＲＮＡ和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ。反义寡核苷酸能特异地桔抗内源或外源基因的表达，这为研究某特定基因功能提供了更为有效的方法。此外也为培育抗病植株、建立植物反向筛选系统，次生代谢调控及农艺性状改良提供了可能途径。
许本波, 张学昆, 李加纳[9]2003年在《反义RNA技术在现代作物遗传改良中的应用》文中认为介绍了反义RNA的作用原理及其在作物遗传改良中的应用 ,主要有 :(1)在提高作物耐储藏性中的应用 ;(2 )在植物抗病虫中的应用 ;(3)在提高作物品质中的应用 ;(4 )改变花卉颜色中的应用 ;(5 )雄性不育控制中的应用。
参考文献：
[1]. 利用反义RNA技术进行木质素生物合成调控的研究[D]. 赵华燕. 中国科学院研究生院（植物研究所）. 2004
[2]. 利用反义RNA技术调节木质素生物合成的研究[D]. 路静. 首都师范大学. 2004
[3]. 毛白杨木质素合成相关基因分离和转基因杨树植株获得[D]. 赵华燕. 新疆农业大学. 2001
[4]. 抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成[J]. 赵华燕, 张景昱, 刘惠荣, 王台, 宋艳茹. 科学通报. 2002
[5]. 赤霉素合成酶基因沉默诱导植物矮化的研究[D]. 周冰彬. 北京林业大学. 2009
[6]. 转基因杨树作为新造纸资源植物的研究[C]. 李亚红. 第二届全国环境化学学术报告会论文集. 2004
[7]. 反义RNA的作用机理及在农业上的应用[J]. 黄克安. 世界农业. 2009
[8]. 植物反义寡核苷酸的研究进展[J]. 傅向东, 侯嵩生. 生物工程进展. 1996
[9]. 反义RNA技术在现代作物遗传改良中的应用[J]. 许本波, 张学昆, 李加纳. 中国农学通报. 2003
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