何平[1]2003年在《金龟子总科部分种类线粒体DNA序列及分子系统学研究》文中研究指明金龟子为重要的农林害虫，也是重要的经济昆虫，在国民生产生活中占有重要的地位。鳃角类昆虫其幼虫称作“蛴螬”，其中很多种类是农作物、果树林木、药用植物的重要害虫，有些种类具有极大观赏价值，部分种类尚可入药。鉴于其在国民生产生活中的重要意义，国内外许多科学工作者都对其有研究。但目前对金龟子的系统学研究还多停留在形态学的层次上，并对其分类系统意见不一。本论文从分子生物学的角度入手，以PCR和测序的实验方法，分析金龟子线粒体DNA的Cyt b基因序列特征，探讨该保守区段的序列信息，并应用分子生物学软件对测序结果进行分析处理，建立分子系统进化树，以期得到研究类群间的系统关系，并试图确定其分类定位。以弥补形态学的不足。为进一步研究金龟子的生物防治和合理利用该生物资源提供基础的资料。 研究过程可分为以下几部分：基因组DNA的提取、mtDNA Cyt b基因目的片段的扩增、测序，及对序列结果的分析和研究。 1．基因组DNA的提取及测序：所用标本大部分为无水乙醇浸泡标本和部分保存多年的干标本，基因组提取方法采用SDS蛋白酶K消化法，提取总DNA，以此扩增线粒体基因Cyt b基因的特异性片段，将扩增效果良好的样品进行纯化、测序(委托上海生工生物工程有限公司)。 2．序列校正：对所得测序片段进行校对，使用ContigExpress软件进行正反链的拼接，在EditSeq软件中补齐相应序列的上游引物部分，经与序列图仔细核对、校正后，共得到485bp(含引物部分共52bp)的片段，将序列保存为fasta格式文件。 3．同源性比较：使用ClustalX1.8软件进行多重比对，采用精确慢比对，并将比对的序列保存为Clustal和Phylip格式。 4．构建系统树：使用MEGA2.1统计核苷酸四种碱基的使用频率，计算遗传距离和转换值、颠换值及多态性位点。基于Kimura双参数模型及其它模型，用NJ法(Neighbor-Joining)、ME法和最大简约法(Maximum parsimony method，MP)构建分子系统树，同时使用Phylip 3.6a软件包中的距离法、 简约法和极似然法构建分子系统树。通过对结果的分析讨论，可得到如下结论： 1．通过对所得的Cyt b基因485hp（含引物部分）序列片段的分析，知该片 段序列中富含A、T碱基，这与原有的结论相符合。序列变异位点集中在 第叁位点和第二位点，序列的两两比对所得转换和颠换值随分歧时间的 先后而逐渐减小。同一科内的物种间转换值比颠换值要高，不同科间的 转换值比颠换值低。所测基因共编码144个氨基酸，其中有75个发生变 ．异，占52．08％。2应用Cyt b基因标记金龟子部分种类的系统关系，由结果得知同一属内的 种间以很高的置信度优先相聚为一枝，同科内的不同属间表现为单系性。 且枝间分歧大于枝内分歧。花金龟科同属内种问亲缘关系近，白星花金龟 和多纹星花金龟分歧最小，优先相聚为一枝，并与铜绿花金龟聚为姐妹群。 丽金龟科粗绿彩丽金龟和墨绿彩丽金龟同属于彩丽金龟属，优先相聚，然 后再与弧丽金龟属的棉弧丽金龟以45％的置信度汇合。3．科间关系为：腹部气门处于同一位置的上气门系丽金龟科、花金龟科、斑 金龟科。犀金龟科和鳃金龟科相聚为一个聚类簇，然后依次与侧气I”二系 的粪金龟科和金龟科相聚，且在不同的建树方法中都支持这一结果。但 其它科间的关系还有待进一步探讨。4．本论文应用单一基因遗传分子标记，进行系统进化分析，结果表明Cytb基 因对科下物种的系统分析更为适合。所得系统关系与传统的分类学基本一 致。科间的系统关系，还有待进一步的研究。
张媛[2]2011年在《丽金龟科部分种类线粒体基因序列比较及在分子系统学研究中的作用》文中研究说明本实验以mtDNA CO I、Cyt b以及16S rRNA基因为分子标记,通过PCR扩增和测序技术,对丽金龟科部分种类的基因序列进行比对分析,分别计算了3种基因序列不同种类金龟子的遗传距离、转换与颠换比值、密码子不同位点出现频率、氨基酸使用频率等参数,构建了分子进化树,探讨了丽金龟科部分种类之间的亲缘关系,分析了CO I、Cyt b以及16SrRNA基因部分序列在丽金龟科分子系统学研究中的作用。实验及分析过程包括：总基因组DNA的提取,mtDNA CO I、Cyt b以及16SrRNA基因片段的扩增,基因序列测定以及对获得序列的分析。本研究得出以下几点结论：(1)本实验获得CO I、Cyt b、16S rRNA基因序列片段分别为651bp.489bp、825bp。对基因序列碱基组成分析结果如下：COⅠ基因部分序列中A, T、G、C各位点平均含量分别29.2%、35.8%、16.7%、18.3%,其中A+T的平均含量为65.0%,G+C的平均含量为35.0%；Cyt b基因部分序列中A, T、G、C的平均含量分别为31.2%、38.0%、12.6%、18.2%,其中A+T的平均含量为69.2%,G+C的平均含量为30.8%;16S rRNA基因部分序列中A、T、G、C的平均含量分别为33.2%、39.6%、17.6%、9.6%,其中A+T的平均含量为72.8%,G+C的平均含量为27.2%。3个基因序列的A+T含量均明显高于G+C含量,表现出明显的碱基偏好性。(2)序列变异分析结果显示：CO I、Cyt b、16S rRNA基因的变异位点主要发生在第叁位点上,其变异位点数分别为167、118、120,所占总变异率分别为81.5%、74.6%、39.2%。碱基替换主要发生在T和A之间。CO I、Cyt b、16S rRNA基因的平均d值分别为0.14、0.11、0.07,平均R值分别为1.1、1.67、1.14。(3)氨基酸序列分析结果显示：CO I、Cyt b、16S rRNA3个基因的氨基酸使用频率最多的均为Leu,分别为16.4、14.17、17.59。氨基酸使用频率最低为0。3个基因的密码子使用频率最高的均为UUA,分别为16.4、15.1、25.8。最低密码子使用频率也为0。说明在氨基酸和密码子的使用上也具有偏好性。(4)系统进化树的分析结果：基于COⅠ、Cyt b、16S rRNA3个基因分别构建了NJ树、MP树和UPMGA树,分子系统树结果与形态学分类基本一致：异丽金龟属Anomala内的不同种优先聚集,之后为属间的Mimela holosericea, Blitopertha pallidipennis, Popillia quadriguttata依次聚集,最后为白星花金龟科P.brevitarsisde和锹甲科L.maculifemoratus,两个外群依次聚类。说明属内种间的亲缘关系最近,科内属间缘关系次之,与外群关系最远。分析结果提示COⅠ、Cyt b以及16S rRNA部分序列可作为种群间的亲缘关系界定的有效分子标记之一
孙娜[3]2010年在《金龟子Cyt b、CO Ⅰ序列比较及在分子系统学研究中的作用》文中研究指明摘要金龟子隶属鞘翅目Coleoptera,金龟总科Scarabaeoidea,其幼虫称蛴螬,许多是重要的农业害虫。目前国内外对金龟子的研究多集中在形态学分类和防治等方面,分子水平的研究还不深入。mtDNA Cyt b和COⅠ基因具有进化速率适中,一般不会发生插入或缺失,多态性较高,适于通用引物扩增等特点,是研究昆虫分子系统学的理想标记,现已广泛应用在许多昆虫系统发育研究中。但国内利用Cyt b和COⅠ基因研究金龟子的报道还不多,尤其是金龟总科中有关COⅠ基因的研究在国内还鲜有报道。本研究采用PCR扩增和测序技术对金龟总科部分种类的Cyt b, COⅠ基因序列进行了对比分析,获得了Cyt b和COⅠ部分序列,计算了密码子不同位点出现频率,重建了分子进化树,探讨了不同分类单元个体之间亲缘关系,分析了Cyt b和COⅠ基因部分序列在金龟子分子系统学研究中的作用。本实验及分析过程包括：总基因组DNA的提取、mtDNACyt b和COⅠ基因片段的扩增、测序以及对获得序列的分析。本研究得出以下几点结论：(1)获得了433bp的Cyt b序列和658bp的COⅠ序列(不含引物部分)。序列组成分析结果显示：Cyt b部分序列中A、T、G、C平均含量分别为30.6%、38.6%、18.9%、11.9%,A+T的平均含量为69.2%,G+C的平均含量为30.8%。COⅠ基因序列分别为29.3%、34.7%、19.5%、16.6%,A+T的平均含量为64.0%,G+C的平均含量为36.1%,均表现明显的A+T偏倚性。(2)序列变异分析结果显示：Cyt b和COⅠ基因序列变异位点主要集中在第3位点,各占70.34%和79.25%。Cyt b和COⅠ序列转换值与颠换值之比(TS/TV)分别为0.77～1.84、0.72～1.85,亲缘关系较近的物种(科内)TS/TV较高,亲缘关系较远的物种(科间)的TS/TV较低。(3)氨基酸序列分析结果显示：Cyt b序列中共编码144个氨基酸,其中有24个发生变异,占总氨基酸的16.67%,Leu、Phe、Ile、Thr出现的次数较多;COⅠ基因序列中共编码219个氨基酸,其中有16个发生变异,占总氨基酸的7.31%,Leu、Gly、Ser出现的次数较多。(4)Mega4.0软件构建的几个种金龟子个体分子系统树与形态学研究结果相吻合。结果显示：多色异丽金龟与蒙古异丽金龟的关系较近,与铜绿异丽金龟亲缘关系次之。丽金龟科和花金龟科之间的差异相对小于丽金龟科与鳃金龟科。说明Cyt b和COⅠ基因序列可作为金龟子种群亲缘关系界定的有效分子标记之一
方晨晨[4]2012年在《花金龟科（Cetoniidae）部分种类基因序列及系统发育关系研究》文中指出本试验研究中使用核酸测序法测定了花金龟科43条核酸序列,分别为:褐绣花金龟(Anthracophora rusticola Burmeister)、白星花金龟(Protaetia brevitarsis Lewis)、多纹星花金龟(Protaetia famelica Janson)蓝星花金龟(Protaetia impavida Janson)的Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA、COⅡ基因序列,华美花金龟(Cetonia magnifica Ballion)、暗绿花金龟(Cetonia viridiopaca Motschulsky)、黄粉鹿花金龟(Dicranocephalus wallichi bowringi Pascoe)的Cyt b、COⅠ、28S rRNA、COⅡ基因序列,疏纹星花金龟(Protaetia cathaica Bates)的Cyt b、COⅠ、28S rRNA基因序列,双斑短突花金龟(Glycuphana nicobarica Janson)Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA基因序列,小青花金龟(Oxycetonia jucunda Faldermann)Cyt b、16S rRNA、28S rRNA基因序列,自NCBI中查询下载一条Chiloloba acuta的28S rRNA基因序列。应用DNAman100软件及ClustalX 2.0软件进行拼接、校正及多重同源性比较,MEGA 4.0软件对序列组成和遗传距离进行分析,并采用Kimura-2参数模型、NJ法和MP法重建系统发育树。得到下述结论:(1)花金龟科11个种Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA、COⅡ基因序列长度分别为350bp、537bp、703bp、600bp、246bp,保守位点分别为226个、372个、572个、577个、156个,其中均为第二位点居高;变异位点依次为124个、165个、131个、23个、90个,第叁位点的变异率最高。Cyt b基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为36.8%、33.2%、19%、11%,其中A+T的平均含量为70.0%,G+C的平均含量为30.0%;COⅠ基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为30.3%、35.5%、15.9%、18.2%,其中A+T的平均含量为75.8%,G+C的平均含量为34.2%;16S rRNA基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为39.9%、34.1%、8.7%、17.2%,其中A+T的平均含量为74%,G+C的平均含量为25.9%;COⅡ基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为34.2%、32.8%、17.8%、15.2%,其中A+T的平均含量为67%,G+C的平均含量为33%。28S rRNA基因序列中A、T、G、C的平均含量分别为25.4%、20.8%、30.4%、23.4%,其中A+T的平均含量为46.2%,G+C的平均含量为53.7%。表现出明显的线粒体及核的碱基偏好性。(2)花金龟科11个种Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA、COⅡ的碱基转换/颠换平均值(R值)分别为1.1、1.2、1.3、2.5、1.1。其中,Cyt b基因序列的疏纹星花金龟与多纹星花金龟的R值为2.3745,16S rRNA基因的白星花金龟与多纹星花金龟R值为2.5179,COⅡ基因的蓝星花金龟与多纹星花金龟R值为1.5731,均说明属内不同种间的R较大,亲缘关系较近,这与形态学分类结果基本相吻合。(3)花金龟科11个种Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA、COⅡ基因的遗传距离分别为0.0097-0.4103、0.0038-0.2340、0.0104-0.1571、0.0104-0.0223、0.0097- 0.2477。其中最小值均发生在星花金龟属内,尤以疏纹星花金龟、白星花金龟之间与多纹星花金龟之间最小,说明同属不同种亲缘关系较近。(4)线粒体Cyt b、COⅠ、16S rRNA、COⅡ基因序列中,氨基酸使用中频率最高的是Leu (亮氨酸),密码子使用频率最高的为UAA、AAA;核基因序列氨基酸使用频率最高的是Arg(精氨酸),密码子使用频率最高的是CUC。说明线粒体基因与核基因在氨基酸和密码子的使用方面有明显差异。(5)基于Cyt b、COⅠ、16S rRNA、28S rRNA、COⅡ5种基因,采用Kimura-2参数模型分别构建的11种花金龟NJ树和MP树结果显示:NJ和MP树的系统发育关系基本一致,即星花金龟属Protaetia的疏纹星花金龟、白星花金龟、多纹星花金龟、蓝星花金龟优先聚为一个分支,其次为花金龟属Cetonia的华美花金龟(长毛花金龟)和暗绿花金龟,其他属先后聚集在花金龟科支下,外群多色异丽金龟和斑股锹甲处于次外枝和最外枝。说明同属不同种亲缘关系较近,同科不同属亲缘关系次之,科间亲缘关系最远,这与传统的形态学分类结果基本吻合。说明基因序列分析是研究花金龟种属科间系统发育关系的有效方法。
武元园[5]2016年在《中国锹甲科分子系统发育研究（鞘翅目：金龟总科）》文中认为锹甲科(Lucanidae)隶属鞘翅目(Coleoptera)金龟总科(Scarabaeoidea),是一个较古老的甲虫类群。因其雄虫上颚发达多似雄鹿外形奇特的角,而被通称为Stag beetles。绝大多数锹甲的形态比较复杂,有明显的性二型和雄性多型现象,使得传统形态分类鉴定存在一定困难,疑难属种较多。鉴于此,本文尝试利用分子系统学研究方法,对中国锹甲科的主要代表属种进行系统发育研究,尝试解决部分疑难属种的分类问题。通过大量的实验筛选,最终确定了两个线粒体基因COI、 16S rDNA及两个核基因Wingless及28S rDNA作为联合标记基因,通过PAUP*、 MEGA、MrBayes和BEAST等软件,采用最大简约法(Maximum Parsimony,MP)、最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和贝叶斯推断(Bayesian Inference, BI)等方法,构建了中国锹甲科26属103种及亚种的系统发育树。此外,本研究首次尝试从组学角度探讨锹甲科的系统发育,选取了7个属的8个代表物种进行线粒体全基因组的测定和分析,基于蛋白质编码基因构建系统发育树以验证主要分支的聚类情况。同时,基于四个化石标定点计算各属分化时间,综合分析了中国锹甲科的系统发育关系。相关研究结果如下：(1)获得的基因序列超过500条(含Cytb、ITS2、EF1-α等筛选标记),其中用于本研究分析的目的基因标记有：COI部分序列102条、16S rDNA部分序列116条、Wingless部分序列77条、28S rDNA 94条。(2)获得的线粒体基因组数据：6个种的全序列和2个种的主要编码区。已向Genbank数据库提交了4个种的数据。线粒体基因组结构和基因排列顺序均符合经典的昆虫线粒体基因组结构特征；其中云南拟锹甲Sinodendron yunnanense发生了一个tRNA重排,孔夫子前锹甲Prosopocoilus confucius有两段主要的非编码区。(3)系统发育分析结果在亚科水平上支持Sinodendroninae是独立有效的亚科且属于锹甲科最原始的支系。支持锹甲科中“族(Tribe)"阶元划分的合理性,根据各族间较好的单系性,中国的锹甲科可归为10个族：Sinodendrini+((Ceruchini +Lamprimini)+((Platycerini+Aesalini)+(Figulini+(Lucanini+(Dorcini+(Odontolabini+Aegini))))))。属级水平的分析结果表明：异锹甲属Pseudolucanus不是个单系,它与另外2个形态相似属(锹甲属Lucanus和凸锹甲属Noseolucanus)之间的关系还需要更多的数据支持；奥锹甲属Odontolabis和新锹甲属Neolucanus明显聚为单系并互为姐妹群关系；现有分类系统中常用的前锹甲属Prosopocoilus是一个并系：部分种明显聚成一支且具有很好的单系性,部分种则与广义刀锹甲属Dorcus (s. l.)形成交叉聚类；疑难属广义刀锹甲属Dorcus (s. l.)所涉及到的4属的系统发育关系仍有待研究：分属于Dorcus (s. s.)、Hemisodorcus、Macrodorcas、 Serrognathus的26个种存在交叉聚类现象,所代表的属均不能很好的聚成单系,这可能是研究中所选择的代表性物种数量较少所致。(4)分化时间推算显示：中国锹甲科昆虫首次发生分歧的时间约在130 Mya(95%置信区间：103-154 Mya),为白垩纪早期(Early Cretaceous);约在20-30Mya(渐新世到中新世早期)发生了大量的物种分化。
张倩[6]2013年在《中国奥锹甲属Odontolabis Hope和新锹甲属Neolucanus Thomson的分子系统学研究（鞘翅目：金龟总科：锹甲秋）》文中指出奥锹甲属Odontolabis Hope和新锹甲属Neolucanus Thomson是鞘翅目Coleoptera锹甲科Lucanidae中的两个外部形态较为相似的属。两属中的绝大部分已知种类都分布在东洋界,仅有零星种类分布到了古北界的日本。中国是这两属分布的重点地区,约有50%的世界已知种类分布在中国的华南、东南及西南地区。在中国的这些已知种类中,不少种类的外部形态很相似,雌、雄外生殖器的差异也很小,且同一种内又存在显着的性二型现象、雄性多型现象、不同的色斑型变化,导致了种间鉴定较为困难,具亚种分化的多型种现象相当突出,两属间的系统关系不清楚。目前,二者的系统分类已经成为锹甲科分类研究中的一个突出问题。因此,非常有必要利用现代分子生物学技术,从分子系统学角度来研究和探讨并解决这两属面临的分类学问题。本研究以16S rRNA、COI和28S rRNA基因为分子标记,对来自福建、浙江、广东、广西、贵州、海南等地的11种锹甲进行了研究,共获得长度为2261bp的序列片段,其中保守位点1709个,变异位点552个,变异率为32.3%。以简颚锹甲Nigidionus parryi为外群,采用最大简约法(maximum parsimony, MP)、最大似然法(maximum likelihood, ML)和贝叶斯法(Bayesian inference, BI)构建系统发育树。结果显示：内群由两大分支组成,其中中华奥锹甲Odontolabis sinensis、华美奥锹甲Odontolabis fallaciosus、西奥锹甲Odontolabis siva、扁齿奥锹甲Odontolabis platynota聚为一支；缝斑新锹甲Neolucanus parryi、华新锹甲Neolucanus sinicus、亮光新锹甲Neolucanus nitidus、陶新锹甲Neolucanus tao、刀颚新锹甲Neolucanus perarmatus、大新锹甲Neolucanus maximus、红巨新锹甲Neolucanus giganteus聚为一支。在属间关系上支持奥锹甲属和新锹甲属分别为独立有效属的分类地位；种间关系上：形态学上分类地位很明确的种,西奥锹甲Odontolabis siva和扁齿奥锹甲Odontolabis platynota、缝斑新锹甲Neolucanus parryi和华新锹甲Neolucanus sinicus分子数据上同样支持它们作为有效种的分类地位；形态学上有一定相似性的种,亮光新锹甲Neolucanus nitidus和陶新锹甲Neolucanus tao、刀颚新锹甲Neolucanus perarmatus和大新锹甲Neolucanus maximus,分析结果表明它们确实存在很近的亲缘关系但又属于不同的种；形态分类地位不确定的疑难种(根据其鞘翅色斑特征,它们或为独立种,或为不同地理亚种,或为不同的色斑型)中华奥锹甲和华美奥锹甲的分析结果显示：来自6个地区的10头样本的种间遗传差异很小(为0.5%),分子数据不支持它们作为独立种,支持它们作为同一个种,它们间鞘翅色斑的特征可能属于不同的色斑型变化。
参考文献：
[1]. 金龟子总科部分种类线粒体DNA序列及分子系统学研究[D]. 何平. 陕西师范大学. 2003
[2]. 丽金龟科部分种类线粒体基因序列比较及在分子系统学研究中的作用[D]. 张媛. 沈阳大学. 2011
[3]. 金龟子Cyt b、CO Ⅰ序列比较及在分子系统学研究中的作用[D]. 孙娜. 沈阳大学. 2010
[4]. 花金龟科（Cetoniidae）部分种类基因序列及系统发育关系研究[D]. 方晨晨. 沈阳大学. 2012
[5]. 中国锹甲科分子系统发育研究（鞘翅目：金龟总科）[D]. 武元园. 安徽大学. 2016
[6]. 中国奥锹甲属Odontolabis Hope和新锹甲属Neolucanus Thomson的分子系统学研究（鞘翅目：金龟总科：锹甲秋）[D]. 张倩. 安徽大学. 2013
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