小鼠胚胎干细胞中Etv5-Tet2-Fgfr2轴正反馈调控ERK磷酸化的机制研究

小鼠胚胎干细胞中Etv5-Tet2-Fgfr2轴正反馈调控ERK磷酸化的机制研究

论文摘要

细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性的动态平衡被多重反馈环路调控以确保小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)正常的自我更新。以前的研究证明,在mESCs中存在多种阻止ERK磷酸化(pERK)过度激活的负反馈环路。但是,在mESCs中一直都不清楚是否存在正反馈环路来维持pERK的最低水平。有研究表明pERK进入细胞核后可以激活一系列的转录因子,包括Etv4、Etv5、Dusp6、Spry和Sef等。其中Dusp6、Spry和Sef作为负反馈调控来调节pERK的水平,而Etv4和Etv5是通过负反馈还是正反馈调控来维持pERK的水平并不清楚。本研究用CRISPR/Cas9对Etv5基因进行了敲除(KO),再根据Etv5敲低(KD)的RNA-seq数据,用qPCR、Western blot、生物信息学分析、启动子克隆、双荧光素酶检测和甲基化测序等实验进行检测,主要获得以下结果:1.用CRISPR/Cas9在mESCs中敲除Etv5本实验设计了一对特异靶向Etv5基因第7号外显子的sgRNA,将其通过分子克隆连接到PX459M载体中,通过基因敲除获得了Etv5 KO B10、B13和B23三株克隆。2.确立了Etv5和pERK之间的正调控关系在Etv5 KO的mESCs中pERK蛋白的表达水平降低。Etv5 KO mESCs的生长速度减慢、Otx2基因表达显著上调、细胞核可以被荧光染料Hoechst 33258深染。3.在mESCs中发现了Etv5-Tet2-Fgfr2轴介导的正反馈环路来调控pERK为了探索在Etv5 KO mESCs中导致pERK下调的分子机制,本研究分析了之前在mESCs中Etv5 KD的RNA-seq数据来确定FGF-ERK信号通路中哪个基因的表达既显著下调又能够使pERK去磷酸化,最终发现Fgfr2在Etv5 KD mESCs中不仅显著下调其表达丰度在mESCs中也比较高。在Etv5 KO mESCs中Fgfr2的mRNA和蛋白表达水平也都下降。为了进一步研究Etv5是怎样调控Fgfr2的表达,我们将生物信息学预测的Fgfr2启动子克隆到了PGL3载体中,双荧光素酶实验的检测结果发现与对照组相比过表达Etv5仅能产生大约两倍的荧光强度。为了探究Etv5是否通过其它因子的介导来调控Fgfr2的表达,我们使用Cistrome网站中的ChIP数据库,分析了结合在Fgfr2启动子区的转录因子,结果发现有43个转录因子结合在Fgfr2启动子区,而在这43个因子中Tet2在Etv5 KD后下调最显著。Tet2的mRNA和蛋白在Etv5 KO mESCs中的表达也都显著下降。我们又检测了Fgfr2启动子区的甲基化程度,结果发现在所检测的Fgfr2启动子区Etv5 KO后的甲基化程度为16.7%,而野生型J1细胞甲基化程度为2.5%。总之,我们在mESCs中发现了调控pERK的一个新模式,即Etv5促进Tet2的表达,而Tet2去甲基化Fgfr2启动子区从而促进Fgfr2的表达,Fgfr2反过来再继续激活ERK信号通路,这为理解早期胚胎发育过程中细胞命运决定提供了新的参考。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  •   第一章 转录因子Etv5的研究进展
  •     1.1 Ets家族成员及结构特征
  •       1.1.1 Ets家族成员和分类
  •       1.1.2 Ets家族的结构特征
  •       1.1.3 PEA3家族的成员和结构特征
  •       1.1.4 PEA3家族蛋白的活性调节
  •     1.2 PEA3家族成员的研究进展
  •       1.2.1 ETV5在生殖领域的研究
  •       1.2.2 ETV5在癌症领域的研究
  •       1.2.3 ETV5在mESCs中的研究
  •   第二章 ERK1/2信号通路的研究进展
  •     2.1 ERK1/2信号通路
  •     2.2 ERK1/2信号通路的调控
  •       2.2.1 ERK1/2信号通路的负反馈调控
  •       2.2.2 ERK1/2信号通路的正反馈调控
  •     2.3 ERK1/2信号通路在胚胎发育过程中的研究
  • 试验研究
  •   第三章 Etv5 KO mESCs的建立及鉴定
  •     3.1 材料和方法
  •       3.1.1 材料
  •       3.1.2 方法
  •     3.2 结果
  •       3.2.1 Etv5基因敲除的mESCs建立
  •       3.2.2 Etv5 KO对mESCs增殖的影响
  •       3.2.3 Etv5 KO对mESCs多能性的影响
  •       3.2.4 Etv5 KO对mESCs凋亡的影响
  •     3.3 讨论
  •     3.4 小结
  •   第四章 Etv5 正反馈调节FGF-ERK信号通路维持pERK平衡
  •     4.1 材料与方法
  •       4.1.1 材料
  •       4.1.2 方法
  •     4.2 结果
  •       4.2.1 mESCs Etv5 KD RNA-seq数据检测FGF-ERK信号通路中的差异基因
  •       4.2.2 在mESCs中Etv5正向调控Fgfr2的表达
  •       4.2.3 Etv5在mESCs中主要间接调控Fgfr2的转录
  •     4.3 讨论
  •     4.4 小结
  •   第五章 Etv5介导Tet2调控Fgfr2启动子甲基化水平
  •     5.1 材料与方法
  •       5.1.1 材料
  •       5.1.2 方法
  •     5.2 结果
  •       5.2.1 Fgfr2启动子区结合转录因子的生物信息学分析
  •       5.2.2 Etv5 KO mESCs Tet2的表达显著下调
  •       5.2.3 Etv5 KO引起Fgfr2启动子区甲基化程度的改变
  •     5.3 讨论
  •     5.4 小结
  • 结论
  • 论文中的创新点和有待继续研究的方向
  • 附录
  • 参考文献
  • 英文缩略词表
  • 致谢
  • 作者简介
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 范辰

    导师: 张仕强

    关键词: 小鼠胚胎干细胞,细胞外信号调节激酶

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家自然科学基金(编号:31301218)

    分类号: Q75

    总页数: 72

    文件大小: 4192K

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