异常球菌角蛋白酶的异源表达和羽毛降解特性研究

论文摘要

角蛋白（Keratin）是一类广泛存在于自然界的非营养型硬蛋白,主要分布在动物的皮毛、蹄甲部位,结构中含有大量氢键、半胱氨酸构成的二硫键,二硫键相互作用形成致密的角蛋白结构使其难以被降解利用。角蛋白酶（Keratianse）是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,它能破坏羽毛角蛋白致密的结构达到降解的目的。为了更好的利用角蛋白和开发角蛋白酶基因本研究从戈壁异常球菌（Deinococcus gobiensis）I-0和耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）R1中鉴定了三个角蛋白酶基因,分别命名为Kerdg1（DGORS02895）、Kerdg2（DGORS03965）、Kerdr（A2G07RS01950）,并在大肠杆菌中进行了异源表达和羽毛降解特性研究。主要结果如下:1、为了研究这三个基因,分析其序列结构发现Kerdg1由1239碱基组成可编码412个氨基酸残基,分子量为:41.1 kDa;Kerdg2由1599碱基组成编码532个氨基酸残基,分子量为:53.78 kDa;Kerdr由1599碱基组成编码532个氨基酸残基,分子量为:53.39kDa。序列比对发现KerDG1、KerDG2、KerDR蛋白含有跨膜结构和前导肽。结构中信号肽（The signal peptide）、N端前肽（N-terminal pro-peptide）、成熟蛋白区（mature protease）、C端尾巴（C-terminal pro-peptide）这四个部分与peptidasess8s53家族蛋白相似,此外成熟蛋白区都有3个主要的氨基酸残基（Asp、His、Ser）与已知的芽孢杆菌角蛋白酶（KerA）一致,确认三个基因是角蛋白基因。2、将这3个角蛋白基因分别连接到pET22b载体中,并转化到表达宿主BL21进行原核表达。对重组菌株进行降解能力分析,结果显示重组菌株对羽毛的降解作用明显。对重组菌株作用于羽毛后的产物进行检测,结果显示降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。3、将重组菌株诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示在菌液中、菌体上清中均能获得目的蛋白。对角蛋白酶酶学性质进行研究发现KerDG1最适pH和温度是5.0和60℃,酶活3.5 U/mL。KerDG2的最适pH和温度是8.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。KerDR的最适pH和温度是7.0和40℃,酶活是3.0 U/mL。耐受性实验表明角蛋白酶能耐受一定的温度和pH。同时,还发现酶对金属离子和化学试剂也有一定的耐受性。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 耿秀秀

导师: 王劲

关键词: 角蛋白,角蛋白酶,异常球菌,酶活

来源: 西南科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 西南科技大学

基金: 国家重点基础研究发展计划(“973”计划)(2013CB733903),国家自然科学基金(31500063)

分类号: X705;X172

总页数: 64

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