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南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及硅藻土固定化应用研究

2020-12-02阅读(800)

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及硅藻土固定化应用研究

论文摘要

南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）具有非常强的区域、立体选择性和广泛的底物特异性,无论是在水相还是有机相均能发挥极高的催化活性,因此在对映体拆分、药物成分制备、有机合成等领域具有重要的应用。但是目前CALB商品酶价格昂贵,使其大规模应用成本较高,CALB重组表达水平也难以有效降低应用成本。本研究基于黑曲霉完善的蛋白修饰系统和强大的胞外蛋白分泌能力,将CALB基因整合到黑曲霉基因组中进行重组表达,筛选出了一株高酶活的CALB基因工程菌,对重组CALB的酶学性质和菌株生长性能进行了研究,并以硅藻土为载体制备了硅藻土-CALB固定化酶,研究了其在己酸乙酯合成中的反应条件。主要研究结果如下:（1）CALB在黑曲霉中的重组表达及重组菌生长性能研究:分别以PglaA和PnaII/tpi为启动子,构建PglaA-CALB和PnaII/tpi-CALB两种CALB表达载体并转化到黑曲霉中,筛选到了一株以PnaII/tpi为启动子的CALB高酶活黑曲霉转化株LB3ang02E（CALB）-2,其摇瓶发酵至72 h时酶活最高,为117 U/mL。对该菌株的生长性能研究发现,在传统发酵培养基的基础上添加2%葡萄糖可使酶活提高至171 U/mL,活力提高了46%。（2）重组CALB的纯化及酶学性质:通过镍柱亲和层析对重组CALB进行纯化,纯化后比酶活为32 U/mg,纯化倍数为6.4倍,经SDS-PAGE分析发现该重组CALB分子量为33 kDa,与文献报道的理论值一致。重组CALB最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0,在温度不超过45℃及pH为6.09.0范围内稳定性较高,CALB酶活性受10 mmol/L Cu2+、Zn2+和0.1%（w/v）SDS强烈抑制,而能被1 mmol/L Ca2+、0.1%（w/v）山梨醇强烈激活。（3）CALB的硅藻土固定化及固定化酶在酯合成中的应用:1 g硅藻土在50 mL CALB粗酶液体系中最佳固定条件为给酶量70 U/mL,温度40℃,pH 7.58.0,固定时间3 h,该条件下可制备出活力为187 U/g的固定化酶。将固定化酶在无溶剂体系中催化乙醇和己酸反应合成己酸乙酯,最佳反应条件为酸醇摩尔比1:1,起始含水量占己酸摩尔量的10%50%,固定化酶用量1.2 g,反应温度50℃,该条件下己酸乙酯产率在4 h内达到了91%。对该固定化酶的操作稳定性进行测试发现,重复使用三次后固定化酶活力保持在80%以上。综上所述,本研究利用黑曲霉表达系统获得了一株高效表达重组CALB的工程菌株,构建了硅藻土-CALB固定化体系,完成了固定化酶在无溶剂体系中的酯化反应,为提高CALB的重组表达水平及其应用提供了数据支持。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 南极假丝酵母脂肪酶B简介
  •     1.1.1 南极假丝酵母脂肪酶B的来源
  •     1.1.2 南极假丝酵母脂肪酶B的结构与性质
  •     1.1.3 南极假丝酵母脂肪酶B的催化机理
  •     1.1.4 南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造
  •   1.2 南极假丝酵母脂肪酶B的固定化
  •   1.3 南极假丝酵母脂肪酶B的应用与重组表达研究
  •     1.3.1 南极假丝酵母脂肪酶B的应用
  •     1.3.2 南极假丝酵母脂肪酶B的重组表达研究
  •   1.4 丝状真菌简介
  •     1.4.1 丝状真菌表达系统
  •     1.4.2 异源蛋白在丝状真菌中高效表达的策略
  •   1.5 研究意义与内容
  •     1.5.1 研究意义
  •     1.5.2 研究内容
  • 第二章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌种与质粒
  •     2.1.2 引物设计
  •     2.1.3 试剂与试剂盒
  •     2.1.4 培养基与溶液
  •     2.1.5 仪器与设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 CALB基因密码子优化
  •     2.2.2 CALB表达载体的构建
  •     2.2.3 黑曲霉HL-1-A和 HL-1-B的转化
  •     2.2.4 CALB重组工程菌的鉴定与发酵表达
  •     2.2.5 酶活力和蛋白质含量的测定
  •     2.2.6 SDS-PAGE分析和蛋白质纯化
  •     2.2.7 重组CALB酶学性质的研究
  •     2.2.8 宿主背景缺陷对菌体生长性能影响的研究
  •     2.2.9 硅藻土-CALB固定化酶的制备及固定条件研究
  •     2.2.10 固定化酶在己酸乙酯合成中的应用
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 CALB密码子优化
  •   3.2 CALB表达载体的构建
  •     3.2.1 PglaA、PnaII/tpi启动子和CALB基因的扩增
  •     3.2.2 同源重组通用表达载体pUEV质粒的线性化
  •     3.2.3 重组表达载体的酶切验证
  •   3.3 CALB基因在黑曲霉中的转化与鉴定
  •     3.3.1 CALB基因在黑曲霉中的转化结果
  •     3.3.2 CALB重组表达转化子的表型鉴定
  •     3.3.3 CALB重组表达转化子的PCR鉴定
  •   3.4 CALB重组工程菌的酶活测定与SDS-PAGE分析
  •     3.4.1 对硝基苯酚标准曲线
  •     3.4.2 以HL-1-A为宿主的CALB表达株的酶活测定与SDS-PAGE分析
  •     3.4.3 以HL-1-B为宿主的CALB表达株的酶活测定与SDS-PAGE分析
  •   3.5 重组CALB的纯化与酶学性质研究
  •     3.5.1 重组CALB的纯化
  •     3.5.2 重组CALB的酶学性质
  •   3.6 宿主背景缺陷对菌体生长性能的影响
  •     3.6.1 糖化酶缺陷对菌体生长及产酶的影响
  •     3.6.2 蛋白酶缺陷对菌体生长及产酶的影响
  •   3.7 CALB硅藻土固定条件的优化
  •   3.8 硅藻土-CALB固定化酶在己酸乙酯合成中的应用
  • 结论与展望
  •   结论
  •   展望
  • 本论文创新点
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张玲敏

    导师: 王斌

    关键词: 黑曲霉,重组表达,南极假丝酵母脂肪酶,硅藻土固定化

    来源: 华南理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 华南理工大学

    分类号: Q78;Q55

    DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001208

    总页数: 81

    文件大小: 4110K

    下载量: 103

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