陈巧君黄燕（通讯作者）
（浙江大学医学院附属第二医院浙江杭州310009）
【摘要】病理技术是病理诊断的重要依据，病理制片的好坏直接影响病理诊断结果，而在整个病理制片过程中，固定又是及其重要的环节。本文探讨了病理制片中不同因素对固定的影响以及固定对制片的影响
【关键词】固定；影响因素
【中图分类号】R44【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）23-0364-02
固定是整个病理制片过程中最重要的步骤，一张良好的组织学切片取决于良好的固定。固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态，迅速防止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败。使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质。使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率。造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
1.固定的影响因素
1.1固定液
在实际工作中，根据不同的组织和要求来选择不同的固定液。固定液必须具有较强的渗透力，能迅速地渗入到组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，使组织达到一定的硬度，获得不同的折光率以及对染料的较强亲和力。固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时，应使用足量的固定液，其固定液的量一般大于组织块总体积的4倍以上。根据制片目的的不同，选择不同的固定液往往更容易做出理想的结果。常规大体标本的固定液常用AAF液（40%甲醛10ml，95%乙醇85ml，冰醋酸5ml）和10%中性缓冲福尔甲醛100ml，蒸馏水900ml，NaH2PO4?H2O4g，Na2HPO46.5g）。这两种固定液在大体标本的HE染色中效果较好。甲醛能较好地保存蛋白质、脂肪等；乙醇可固定糖元及核糖核酸，单独使用时收缩严重；而冰醋酸穿透力强，易膨胀，正好可以抵消乙醇的收缩作用。
因此，AAF液是HE染色的良好固定液，特别是对染色质的染色，但该固定液对细胞膜上的蛋白质和细胞内的某些结构有一定的破坏作用，特别是对免疫组化和分子病理有一定的影响。目前，免疫组化和分子病理技术已被广泛应用，10%中性缓冲福尔能更好地保存抗原和肿瘤基因，是目前应用最为广泛，对免疫组化和分子病理影响最小的固定液[1-2]。
1.2取材
①水洗固定后水洗通常被很多人所忽略，水洗不彻底组织表面易沉积甲醛颗粒，造成脱水不彻底和染色不鲜艳，而长时间固定对免疫组化亦有影响[3]。②取材取材的厚度不要超过3mm，取材太厚组织中心固定不充分，细胞结构不清晰，影响染色质量。
1.3固定对制片的影响
大体标本的固定液中甲醛的实际浓度在10%左右，甲醛是通过蛋白质分子的交联作用而产生固定作用的[4]，浓度过高，交联作用更为紧密，造成组织周围明显收缩，影响固定液的渗透，造成组织中央固定不佳；而浓度过低，固定的质量也受到影响。特别是室温较高时，低浓度的固定液对组织固定不彻底，将产生自溶、变性或坏死，严重影响到切片的质量。固定液浓度也随着使用次数的增多而下降，一般我们在处理800块组织后及时更换新的固定液。
固定必须及时，越新鲜越好。一般手术标本在离体后半小时内固定最佳，固定时间3～24小时不等。固定温度不宜过高，否则易造成核固缩并破坏组织内抗原；温度过低，应根据组织块的大小适当延长固定的时间，否则会出现固定不足，造成组织脱水、透明、浸蜡等一系列问题。笔者建议在室温下固定或全封闭自动脱水机恒温（35～37℃）固定。
1.4固定对染色的影响
固定是整个病理制片过程中最为重要的步骤，固定不好，在以后的制片过程中很难纠正。固定不佳的标本，蛋白质的某些结构受到破坏，细胞膜的通透性降低，对染料的吸收和吸附作用降低，分子间的作用力减弱，亲和力下降，很难与染料相结合，造成细胞结构不清，甚至不着色和现象，严重影响到病理诊断。
2.结果
图1为AAF固定液，HE染色结构清晰，颜色鲜艳，对比度好，结果较为理想。图2为10%中性缓冲福尔，在荧光显微镜下观察信号，FISH结果质量较好。
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3.讨论
固定是制作大体标本的关键，没有良好的固定基础，就制作不出高质量的标本，组织固定直接影响HE染色的效果。组织染色主要为细胞核染色和细胞浆的染色。细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸（DNA），在DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外带负电荷，呈酸性，易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合从而被染色。细胞质的主要成分为蛋白质，其等电点的pH为4.7～5.0，细胞质的染色与pH密切相关。当细胞质的pH调到它的等电点范围即pH为4.7～5.0时，细胞质则呈现为兼性离子（以蛋白质为主）对外不显电性，此时酸性染色与碱性染料均很难使细胞质染色；当pH调到细胞质的等电点以下也就4.7以下，细胞质就以碱式电离，带正电，可被带负电的酸性染料阴离子染料，从而与细胞核分开；但pH也不能太低，若调到染色体等电点（pH=3.3）以下，染色体也表现碱式电离，带正电荷也被酸性染料染色，细胞核和细胞浆也难以区分。因此，当pH为3.6～4.7，此时恰好细胞核带负电荷可被碱性染料染色，细胞质带正电荷被酸性染料染色，从而使细胞核和细胞质区分开来[5]。AAF液的pH在4.0～4.5间，HE染色后核浆鲜明，有效的避免了核浆共染的现象。冰醋酸穿透速度快，是良好的核蛋白沉淀剂，但易使组织膨胀，95%乙醇对组织收缩和硬化作用较为明显，正好可以抵消冰醋酸的膨胀作用，因此，AAF固定液在HE染色中的效果较为理想（图1），HE染色结构清晰，颜色鲜艳，对比度好。近年来，免疫组化和分子病理得到快速发展，对组织固定的要求也越来越高。酸性固定液在常规HE染色中虽然表现出色，但对免疫组化和分子病理却有一定影响[6]，而10%中性缓冲福尔因能更好地保存抗原和肿瘤基因[1-2]，对需做免疫组化和分子病理的标本更为适用（图2），在荧光显微镜下观察信号，FISH结果质量较好。
因此，根据制作标本的目的不同，应选择合适的固定液。在日常的工作中，我们应注意细节，有高度的责任心，任何一个环节的疏忽，都可能影响最终的病理结果。
【参考文献】
[1]BancroftJD.Theoryandpracticeofhistologicaltechniques[M].London:Churchilllivingstone,2008:53-74.
[2]CarsonFL.Histotechnology.Aselt-instructionaltext[M].Chicago:AmericanSocietyofClinicalPathologistsPrss,2009:4-44.
[3]周会芹,杨江辉,余琦等.不同组织固定液对免疫组化结果的影响[J].诊断病理学杂志,2009,16(6):478.
[4]王伯沄,李玉松,黄高昇等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:67.
[5]全国卫生专业技术资格考试专家委员会.全国卫生专业技术资格考试指导病理学技术[M].北京：人民卫生出版社,2014:227-230.
[6]李晓峰,张冠军,王鸿雁.影响免疫组化染色质量的几点因素分析[J].诊断病理学杂志,2013,20(8):511.