崔晓峰[1]2004年在《双生病毒DNAβ分子βC1基因的功能研究》文中研究指明双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒，已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性危害，且有逐年加重的趋势。卫星DNA分子—DNAβ是一些单组份双生病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链都含有一个位置和大小保守的βC1基因，但其功能未知。为了弄清双生病毒DNAβ分子参与致病的机理，本论文对DNAβ分子βC1基因的功能进行了研究。 利用大肠杆菌系统表达了中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10β和烟草曲茎病毒(TbCSV)Y35β分子的βC1基因，以Ni~(2+)-NTA agarose亲和纯化了TYLCCNV Y10βC1和TbCSV Y35βC1重组蛋白并制备了Y10βC1蛋白的抗体。利用UV交联和电泳迁移率变动试验(EMSA)对βC1蛋白的核酸结合特性进行分析，发现βC1蛋白能结合单和双链DNA，且随着蛋白浓度的增加结合能力增强。βC1结合DNA的活性受盐离子浓度影响，随着NaCl浓度增高，βC1蛋白结合活性降低。EMSA和竞争性结合试验发现βC1蛋白结合DNA的活性无DNA大小、形式和序列特异性，表明其以序列非特异性方式结合DNA。 以TYLCCNV Y10β分子βC1基因与GUS和GFP的融合表达载体在洋葱表皮细胞和sf21昆虫细胞中对βC1蛋白的亚细胞定位进行了研究。用基因枪法将βC1与GUS的融合表达载体导入洋葱表皮细胞，GUS染色后发现βC1融合蛋白能在细胞核内和细胞质中积累，在细胞核中积累量较高。利用杆状病毒表达载体在sf21昆虫细胞中表达βC1与GFP的融合蛋白，激光共聚焦显微镜观察发现βC1融合蛋白定位于昆虫细胞的细胞核内。βC1基因不同长度缺失的突变体与GUS融合后在洋葱表皮细胞中定位发现，含预测的核定位信号序列(NLS，~(45)PALAKKK~(51))的βC1突变体在细胞核内积累量较高，而不含有此NLS或NLS中精氨酸突变为丙氨酸的突变体在细胞质和核中分布均匀，暗示所预测的NLS可能是βC1蛋白的一个功能的NLS。 以农杆菌介导的叶盘转化法将35S启动子驱动的TYLCCNV Y10β分子βC1基因转化本氏烟和普通烟，共获得75个株系的转基因本氏烟和39个株系的转基因普通烟。2种转基因烟草的部分株系都产生类似病毒侵染的曲叶等症状，PCR和Southern印迹分析表明βC1基因已整合入这些转基因烟草株系的基因组中，Northem印迹分析表明转基因烟草类病毒病症状的严重度与那了转录物的积累量成正相关。表达功能丧失的那I基因突变体的转基因烟草不产生任何症状，因而那j基因的表达直接诱导转基因植物产生类病毒病的症状。 RNA沉默是一种植物体内固有的抗病毒防卫反应，在防御病毒侵染中起重要作用。在沉默回复和抑制沉默建立的试验中，TYLCCNV Y10p和TbcsvY35p与辅助病毒共接种时能增强抑制RNA沉默的能力，表明DNAp直接或间接参与抑制RNA沉默。利用农杆菌共浸润试验发现Yl叩C1和Y3邓C1蛋白能抑制正义和反义GFP基因诱导的局部沉默，且能延迟GFP的系统沉默，表明DNAp分子pCI蛋白为RNA沉默的抑制子。在农杆菌共浸润试验中TYLCCNV和TbCSV的CZ和C4蛋白能抑制GFP的局部沉默和延迟GFP的系统沉默，进一步证实双生病毒CZ蛋白为RNA沉默的抑制子并明确C4蛋白也具有抑制RNA沉默的能力。因而，与其它植物RNA病毒不同，双生病毒可能编码多个RNA沉默的抑制子。 利用overiap一PCR方法产生了4个那]基因缺失或定点突变的TYLCCNVYIOp突变体并构建了突变体的侵染性克隆，侵染性和致病性测定表明.4个突变体能系统侵染本氏烟但不诱导明显的症状，推测YlopCI蛋白的c端区和含有预测的NLS序列的中间区对诱导典型症状都是重要的。Southem blot测定表明，4个突变体均能在本氏烟中长期存在和忠实复制，但在组织中的积累量远低于野生型YIOp，表明pCI蛋白与Y10p在组织中的积累有关。 云南烟草曲叶病毒(TbLCYNV)的田间分离物仅含有DNA一A，未检测到DNA一B的存在。鉴定了7个与TbLCYNV Y136和Y143分离物伴随的DNAp分子，序列比较和进化分析发现，这些DNAp分子能被划分为2个类型(I和H)，且分别与TYLCCNV和泰国番茄黄化曲叶病毒伴随的DNAp分子具有很高的同源性和密切的进化关系。 在大肠杆菌中以GST融合方式表达了TYLCCNV Y10分离物和TbCSV Y35分离物复制蛋白(ReP)基因，部分TbcsV ReP基因的融合表达产物是可溶性的，利用GST-SePharose 4B亲和层析柱纯化了TbCsV ReP融合蛋白并制备了抗体，亚细胞分布和免疫胶体金标记定位研究发现TbCSv ReP蛋白定位在感病烟草细胞核内，为研究DNAp的复制机理奠定了基础。J 通过以上研究，基本弄清了双生病毒DNAp分子那1基因的功能，为进一步揭示DNAp分子参与致病的机理奠定了基础。
钱亚娟[2]2005年在《双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用》文中认为双生病毒是一类世界范围内广泛发生的具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒,近年来已在多种作物上造成毁灭性危害,给作物生产造成了严重损失。卫星DNAβ是与一些单组份双生病毒伴随的并是病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链都含有一个位置和大小保守的βC1基因。为了弄清双生病毒DNAβ分子参与致病的机理,本论文对缺失βC1基因的DNAβ分子的致病性及稳定性进行了研究,并利用缺失βC1基因的DNAβ分子进行了外源基因的表达及基因沉默研究。 对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ上的βC1基因进行了功能鉴定。构建了一个βC1基因完全缺失的突变体Y10 DNA△C1β,侵染性测定表明在和TYLCCNV-Y10共同侵染寄主植物时,突变体Y10 DNA△C1β能系统侵染本氏烟、心叶烟、矮牵牛,但不能侵染普通烟、叁生烟、番茄,突变体DNA△C1β在寄主上不诱导明显症状。而野生型Y10 DNAβ和TYLCCNV-Y10共同侵染后能够系统侵染以上的所有寄主并且诱导严重的病害症状,侵染效率也高于Y10 DNA△C1β。推测βC1基因是一个参与症状诱导的关键因子并且可能和TYLCCNV-Y10/DNAβ复合体的侵染效率有关。Southern印迹分析显示βC1基因不是TYLCCNV和Y10β复制所必需的,但是它的存在可以增加病毒及卫星在植物组织中的积累量。免疫捕获PCR检测表明,βC1基因缺失的Y10 DNA△C1β(1.0kb)能够包裹在Y10编码的外壳蛋白中。PCR和Southern印迹检测都表明βC1基因缺失的突变体Y10 DNA△C1β在寄主植物中非常稳定,并且能利用多种异源双生病毒复制。 对烟草曲茎病毒Y35分离物(TbCSV-Y35)DNAβ上的βC1基因也进行了功能鉴定。构建了一个βC1基因完全缺失的突变体Y35 DNA△C1β。侵染性测定表明在和TbCSV-Y35共同侵染寄主植物时,突变体Y35 DNA△C1β能够系统侵染本氏烟、心叶烟、矮牵牛、三生烟、普通烟和番茄等寄主,但是与野生型DNAβ相比,TbCSV/DNA△C1β复合体引起的症状减轻,并且缺失βC1基因后TbCSV/DNAβ复合体的侵染效率会有不同程度的下降。Southern印迹分析显示βC1基因缺失对TbCSV-Y35的复制没有明显影响,但是它的缺失使DNAβ在植物组织中的积累水平明显降低。在Y35与Y35 DNA△C1β共同侵染的本氏烟、心叶烟、三生烟、矮牵牛中发
陶小荣[3]2004年在《中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）致病分子机理及其卫星DNA诱导的基因沉默研究》文中进行了进一步梳理双生病毒是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒，已在多种重要经济作物上引起严重危害。在我国云南、广西等地的烟草、番茄和黄瓜等作物上也相继发现了多种双生病毒。本论文对云南红河地区的双生病毒Y10分离物基因组结构、功能和致病机制进行了研究。 对Y10分离物DNA-A全长基因组的克隆和序列测定表明DNA-A全长2737bp，其基因组结构属于典型的旧世界双生病毒，全序列比较发现Y10 DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)同源性达到89％以上，表明该病毒是TYLCCNV的一个分离物(TYLCCNV-Y10)。在TYLCCNV-Y10分离物中没有发现DNA-B组分，但是在该分离物中发现了一种新型的卫星DNAβ分子。序列测定表明TYLCCNV-Y10 DNAβ全长1336bp，Y10 DNAβ与DNA-A之间几乎没有同源性，与其它TYLCCNV的DNAβ同源性较高，而与不同种双生病毒的DNAβ同源性较低。在鉴定TYLCCNV-Y10 DNA-A和DNAβ基础上，进一步对田间样品进行检测表明，25个TYLCCNV分离物中都伴随有DNAβ。 为了研究TYLCCNV DNA-A和DNAβ在致病中的作用，对TYLCCNV-Y10 DNA-A和DNAβ的侵染性克隆进行了构建，侵染性测定表明TYLCCNV-Y10 DNA-A单独可以侵染本氏烟、叁生烟、心叶烟、番茄和矮牵牛，但不能产生任何症状，只有与TYLCCNV-Y10 DNAβ共同侵染时才能诱导产生叶片卷曲、叶脉增厚、耳突增生和植株严重矮化等典型的病害症状。Southern印迹检测表明，TYLCCNV-Y10 DNAβ可以显著地增强DNA-A在植物中的积累水平，对整个发病过程的TAS-ELISA检测发现DNAβ可以迅速地提高病毒积累量。叶盘法检测表明，DNAβ不能进行自我复制，它必须依赖于DNA-A进行复制。DNAβ包裹在DNA-A编码的外壳蛋白中，并且可以被烟粉虱传播。因此，TYLCCNV DNA-A与DNAβ是一种相互依赖的关系。 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的βC1基因、富含A区和共同区依次进行了功能鉴定。βC1基因突变后不再诱导产生典型的病害症状，表明βC1是一个重要致病因子，但Southern印迹杂交表明βC1突变后依然能够在植物中稳定复制，因此βC1对于TYLCCNV-Y10诱导典型的病害症状是必需的，但它对于DNAβ本身的复制却并不是必需的。对A-Rich区进行缺失突变发现，A-Rich区缺失突变后依然能够在植物中进行复制和系统移动，表明A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的；免疫捕获PCR检测表明，A-Rich区缺失的DNAβ依然能够包裹在DNA-A编码的外壳蛋白之中，因此A-Rich区并不能决定DNAβ的包裹。对DNAβ上115bp高度保守区和上游一些相对保守的5碱基序列(GGN_1N_2N_3)结构域与外源片段融合后进行复制相关鉴定发现，115bp的高度保守区足以支持DNAp的复制，而上游的一些序列对于DNAp的复制并不是必需的。 在发现TYLccNv DNAp的基础上，我们进一步在田间样品中发现了TYLccNV ONA一A与DNAp的重组分子(RecDNA一Ap)，并对其进行了致病性研究。通过对TYLCCNV-YIO Rec0NA一Ap分子全长基因组的克隆和结构分析表明，RecDNA一Ap分子大小与DNAp类似，在基因组结构上含有叁个共同的结构:DNA一A的共同区、DNAp的那I基因和A一Rich区.进一步对采自云南烟草、番茄和稀硷的25个TYLCCNV分离物的检测表明，其中有6个TYLCCNV分离物中含有ReeDNA一Ap分子。对TYLCCNV-Y 10 ReeDNA一Ap分子的侵染性测定表明，ReeDNA一Ap和DNAp分子一样都能够在烟草、番茄和矮牵牛上诱导产生典型的病害症状，在植物中能稳定复制，并且能够被DNA一A编码的外壳蛋白所包裹，因此RecDNA一 Ap分子在田间也具有引起病害和导致病害流行的能力。 在植物中，病毒诱导的基因沉默(virus indueed gene sileneing，VIGS)是近年来发展出的一种研究植物基因组功能的强有力的研究工具，病毒载体通过携带一段植物同源功能基因cONA，侵染植物后诱导植物内源功能基因发生沉默，从而在植物的表型突变或生理指标上反映该基因的功能。在当前植物全长基因组序列或序列表达标签(ExPressed sequence tags，EsT)大量测定的情况下，VIGS为研究植物基因组的功能提供了强有力的研究手段。到目前为止，己经建立了以RNA病毒、DNA病毒和卫星RNA病毒为载体的vIGS体系。我们在克隆TYLCCNV-Y10 ONAp的基础上对那I进行了缺失、并引入多克隆位点，构建了一种新型的卫星ONAmp沉默载体，该卫星DNAmp载体既可以抑制转基因GFP的表达，也可以抑制内源基因尸刀S和Su的表达，产生明显的表型突变:虽然辅助病毒TYLCCNV-Y10并不侵染分生组织，但是它也同样可以诱导分生组织特异性表达的尸C入兄基因发生沉默;该卫星DNAmp载体还可以同时抑制两个基因的表达;在该卫星DNAmp载体上插入17obP一1 loobP的片段都可以诱导有效的基因沉默:此外，它在所有己测定的5种寄主植物都能诱导高效的基因沉默;它还可以与多种异源双生病毒包括烟草曲顶病毒 (TbSV)、中国胜红蓟黄脉病毒(AYVCNV)和赛葵黄脉病毒(MYVV)等病毒之间建立有效的基因沉默。改造的卫星DNAmp沉默载体在植物中不产生任何的病毒症状，因此能够很容易的辨认viGs的沉默表型。近年来，begomovirus心NAp病害复合体在亚洲和非洲的棉花等多种重要经济作物上相继?
张彤[4]2012年在《双生病毒卫星DNA的复制及介导的病毒—介体互惠机制研究》文中研究指明双生病毒是世界范围内广泛发生的一类单链环状DNA病毒,已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性灾害。为了更好地了解双生病毒的致病机理及病毒的危害流行,本论文围绕双生病毒卫星DNA的复制专化性的分子机制和双生病毒与介体烟粉虱间接互惠的机制开展了以下两个方面的研究：1中国番茄黄曲叶病毒与烟草曲茎病毒卫星复制专化性的分子机制研究中国番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(TbCSV)的卫星DNAP分子可以被异源辅助病毒稳定复制,但是当同源及异源的DNAβ共同侵染时,异源的DNAβ会在后期丢失,而同源DNAβ则在整个侵染过程中一直存在,说明卫星分子对辅助病毒具有复制专化性。为了了解TYLCCNV和TbCSV卫星复制专化性的分子机制,首先构建了各种置换相应片段的突变体侵染性克隆,通过接种试验发现DNAP基因组上270bp左右的LCR区段决定了复制专化性,并且这种复制专化性是由辅助病毒上的复制蛋白(Rep, AC1)介导的。为了更进一步精细的寻找复制专化性的决定位点,通过序列比较分析发现LCR片段中存在一个具有重复序列的结构域(RBM),而TYLCCNV和TbCSV的卫星DNAP的这个结构域存在着序列上的不同。通过一系列的体外生化试验发现辅助病毒的Rep与其同源的RBM的结合能力强于其与异源的RBM的结合能力。通过构建该结构域的置换或缺失突变体侵染性克隆并且接种本氏烟,证实了该结构域正是这两种病毒卫星DNAP复制专化性的决定位点,且该结构域是卫星DNAβ复制所必须的。进一步利用烟草细胞系,证实了RBM结构域对于卫星DNAP的复制效率具有决定性的作用。在此基础上,利用中国番茄曲叶病毒(ToLCCNV)及其卫星DNAβ,与TYLCCNV或TbCSV的卫星DNAβ接种植物,证实了RBM结构域决定复制专化性的机制在双生病毒中是普遍存在的。2中国番茄黄曲叶病毒与介体烟粉虱的互惠机制研究前期的研究表明烟粉虱能与其传播的TYLCCNV通过寄主植物建立互惠关系。我们发现TYLCCNV伴随的卫星TYLCCNB是双生病毒与介体烟粉虱建立互惠互作关系所必须的。通过表达谱测序和qRT-PCR发现TYLCCNV和TYLCCNB共同侵染能抑制烟草的茉莉酸(Jasmonic acid, JA)防御途径；利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)或转基因下调JA途径有利于烟粉虱的存活,通过外源涂抹茉莉酸甲酯(MeJA)或转基因上调JA途径则不利于烟粉虱的存活；进一步发现TYLCCNB所编码的βC1蛋白是影响植物防御途径变化从而使得介体昆虫和病毒建立互惠关系的关键因子,从而揭示了植物防御信号途径介导的介体昆虫和病毒建立互惠关系的重要机制；我们还发现了TYLCCNV和TYLCCNB共同侵染和烟粉虱取食分别下调和上调了普通烟中萜类化合物合成途径的一个关键基因5-epi-aristolochene synthase (NtEAS)的表达；通过VIGS或转基因沉默NtEAS有利于烟粉虱的存活,揭示了烟草的次生代谢途径是介导介体昆虫和病毒互惠关系的重要途径。
郭维[5]2008年在《叁种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究》文中研究说明双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性灾害。近年来的研究发现,很多单组份双生病毒伴随有诱导典型症状所必需的卫星DNAβ分子。这类卫星DNAβ分子与其辅助病毒形成了一种新型的病害复合体,给亚洲和非洲地区的农作物生产造成了巨大损失。为了更好的了解双生病毒的致病机理,本论文围绕叁种双生病毒及其卫星DNAβ的致病性进行了研究:1.与赛葵黄脉病毒相伴随的卫星DNAβ的分子变异及致病性研究目前对双生病毒伴随的卫星DNAβ的变异研究主要集中在来自不同寄主的卫星DNAβ之间,本论文则对来自我国云南省不同地区赛葵上的20个与赛葵黄脉病毒(MYVV)相伴随的卫星DNAβ进行了克隆、测序和遗传变异分析,发现这些卫星DNAβ之间虽然变异较小,但是仍然具有按地理分布聚类的特征。侵染性测定表明卫星DNAβ对于MYVV在本氏烟、心叶烟、矮牵牛和赛葵上引起典型的病害症状是必需的。进一步将MYVV与泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)DNAβ或中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)DNAβ共同接种本氏烟,发现MYVV可以支持异源双生病毒的卫星DNAβ在本氏烟中进行转录复制和系统移动,且病毒DNA在组织中的积累量与产生症状的严重程度呈正相关。2.中国番茄曲叶病毒及其卫星DNAβ的分子鉴定和致病性研究利用菜豆金色花叶病毒属病毒的简并引物,对从广西省采集的表现出叶片下卷等症状的番茄样品(G16、G17和G18)进行了PCR检测,经过克隆、测序发现这些样品均感染了双生病毒。对所得到的部分病毒基因组序列进行联配比较后发现它们具有96.6%到98.5%的序列同源性,表明它们感染了同一个双生病毒。因此对其中的G16和G18分离物进行了病毒全基因组序列测定,发现G16和G18的全长分别为2729个核苷酸(AJ704602)和2733个核苷酸(AJ558119),它们之间的序列同源性达到98.7%。与其它已报道的双生病毒进行比较发现,G16和G18与越南番茄曲叶病毒的相似性最高,分别为83.6%和82.8%。根据双生病毒“种”的分类标准,G16和G18代表同一个双生病毒新种的不同分离物,因此我们将这个双生病毒新种命名为中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV)。系统进化及重组分析发现ToLCCNV可能是一个由重组产生的新病毒。进一步通过PCR的方法发现这些分离物中都含有卫星DNAβ,并对其全序列也进行了测定。序列测定表明与G16、G17和G18叁个分离物伴随的DNAβ的全长分别为1346个核苷酸、1341个核苷酸和1342个核苷酸(AJ704610-AJ704612)。与其它已报道的卫星DNAβ的序列比较发现这三个DNAβ分子都与中国番茄黄化曲叶病毒Y8分离物的DNAβ具有最高的同源性,分别达到49.1%、49.1%和49.8%。同时,为了研究卫星DNAβ的致病性及生物学功能,构建了ToLCCNV-G18及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆,致病性测定发现卫星DNAβ是ToLCCNV诱导产生典型的病害症状所必需的,同时其还能提高ToLCCNV在寄主植物中的积累量。利用农杆菌共浸润等方法发现ToLCCNV DNAβ编码的βC1蛋白为RNA沉默抑制子。同时为了明确βC1蛋白中维持RNA沉默抑制子功能的关键氨基酸基序,根据生物信息学预测的结果构建了7个不同区段缺失的βC1突变体。农杆菌共浸润试验、Northern及Western印迹杂交结果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸构成的中心结构域(central domain)对于维持βC1抑制子活性是至关重要的。由于目前已报道的大多数RNA沉默抑制子也是致病因子,所以又构建了7个βC1不同区段缺失的DNAβ的突变体的侵染性克隆。侵染性测定发现所有的突变体都可以在ToLCCNV的辅助下系统侵染本氏烟,但是均不能诱导产生明显的症状,表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其诱导产生典型病害症状所必需的。Southern印迹杂交分析发现虽然所有的突变体都能够在本氏烟中复制并且各个突变体之间的复制水平以及对辅助病毒的影响不尽相同,但是总体来说它们的复制水平远远低于野生型DNAβ的复制水平。以上实验结果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其诱导产生病害症状的决定因素。为了确定βC1蛋白及其突变体的亚细胞定位,利用激光共聚焦显微镜对βC1及其突变体与GFP的融合蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位进行了研究。结果发现不具备RNA沉默抑制子活性的突变体βC1~(dm44-60)和βC1~(dm61-74)也不能在细胞核中定位,而野生型及其它突变体βC1则均能在细胞核和细胞质中定位,表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性与其能否在细胞核中定位有关,其44-74位氨基酸构成的中心结构域对于维持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在细胞核中的定位都是必需的。从ToLCCNV单独接种或与其卫星DNAβ共同接种的本氏烟中克隆到了11个病毒或卫星DNAβ来源的小RNA。进一步的分析发现这些来源于病毒的小RNA主要集中在CP的转录区和βC1的转录区,表明病毒可能具有产生小RNA的热点区。3.泰国番茄黄化曲叶病毒是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)引起的番茄黄化曲叶病是影响泰国番茄生产最重要的病害之一,为了明确该病毒到底是单组份双生病毒还是双组份双生病毒,构建了TYLCTHV-Y72分离物及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆。致病性测定表明TYLCTHV可以单独侵染本氏烟、心叶烟和番茄并诱导产生典型的症状,但是当与其卫星DNAβ共同接种时则能够加重病害症状,并且可以提高病毒在植物组织中的积累量。根据以上实验结果以及之前的相关报道,我们认为TYLCTHV是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒。4.广西番茄曲叶病是由两种双生病毒及卫星DNA复合侵染引起的通过PCR、Southern印迹、RCA-PCR以及测序等方法对采自广西省表现出曲叶症状的31个番茄样品进行了复合侵染检测,发现双生病毒的复合侵染是导致广西省番茄曲叶病的重要原因。所有检测的样品中均含有ToLCCNV和中国番木瓜曲叶病毒(PaLCCNV)两种病毒,同时还伴随有ToLCCNV DNAβ或者TYLCCNV DNAβ。
杨彩霞[6]2009年在《福建省六种双生病毒的分子鉴定及RaMoV NSP互作蛋白的筛选》文中研究指明双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环形DNA病毒,至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起,在我国华南地区的作物及杂草上己相继发现了多种双生病毒。本文报告了福建省几种作物和杂草上的双生病毒的分子鉴定结果。从福建福州采集了八份表现矮化症状的普通烟样品,利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分片段的相似性高于95%。挑选分离物F3进一步进行DNA-A全序列测定,结果显示F3 DNA-A(F3A)全长为2739 nts(EF125190)。利用RCA鉴定出DNA-B分子,F3 DNA-B(F3B)全长是2720 nts(FJ874926)。核苷酸同源性比对发现,F3A与海南报道的苎麻花叶病毒的一个分离物(Ramie mosaic virus,RaMoV,EU596959)相似性最高,为95.1%。因此,我们认为F3是RaMoV的一个分离物。这是首次有关RaMoV自然侵染烟草的报道。为进一步验证RaMoV F3分离物的致病性,我们构建了F3A和F3B的侵染性克隆。农杆菌接种实验发现,F3A单独能完成系统侵染本氏烟、普通烟、珊西烟、心叶烟、叁生烟和番茄,但是不能诱导任何症状。混合接种F3 A+B,可在本氏烟、普通烟、珊西烟和叁生烟上诱导产生典型的双生病毒侵染症状。从福建福州烟田采集的表现曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状的普通烟样品YC7中分离出F11和F12两种病毒。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分序列,确定YC7为F11和F12不同病毒复合侵染。F11和F12全长分别是2741 nts(FJ869907)和2754 nts(FJ869908)。同源性比对发现,F11与报道的广东番木瓜曲叶病毒的分离物PaLCuGuV-[CN:Gd2:02](AJ558122)的核酸相似性最高,为97.3%;F12与胜红蓟黄脉病毒的台湾分离物AYVVTW-[TW:Tai:99](AF307861)的核酸相似性最高,为90.1%。利用引物β01/02找到F12的伴随卫星DNAβ(F12β),F12β全长1344 nts(FJ869909),与胜红蓟黄脉病毒台湾分离物伴随卫星AYVB-[TW:CHu:02] (AJ542495)相似性最高,96.5%,说明F11和F12分别是PaLCuGuV和AYVV的一个分离物。以样品YC7为毒源,利用粉虱进行传毒,能在普通烟和心叶烟上引起曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状。PCR检测表明,传毒烟草上存在F11和F12两种病毒和F12β分子。Fp1-Fp4分离物来自福建福州表现轻微的花叶和皱缩症状的圆叶矮牵牛。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增,得到约500bp的DNA片段,它们间的的核苷酸相似性为97.5%,说明它们是同一种病毒的不用分离物。随机选择Fp1进行全序列测定及进一步分析。Fp1全长2828 nts(FJ515896),具有典型的双生病毒DNA-A的基因组结构。Fp1DNA-A全序列与中国江苏报道的番薯曲叶病毒的一个分离物SPLCV-[CN-Js:08](FJ176701)相似性最高,为92.1%,说明Fp1是SPLCV的福建分离物。据我们所知,这是首次报道SPLCV可以自然侵染圆叶矮牵牛。通过构建SPLCV Fp1分离物的侵染性克隆,并进行致病性测定,结果表明,Fp1A不能侵染本氏烟。从福建漳州采集到表现明显黄脉症状的一点红(Fz1-Fz5)和野茼蒿(Fz6)等六个样品。从这些植物的叶片中提取总DNA并采用滚环复制扩增法检测。Fz1-Fz6扩增产物分别用限制性内切酶BamH I、EcoR I、Kpn I、Sac I、Xba I和Sal I处理。Fz1-Fz6酶切片段(EcoR I切下的2.7 kb,Xba I切下的1.3 kb)被测序,部分结果显示这些植物被同一种病毒侵染。选择Fz1进行进一步分析。Fz1全长2725 nts(EU377539),伴随的DNAβ全长1337 nts(FJ869906)。Fz1全序列与印度的夜香牛黄脉病毒分离物VeYVV-[IN:Mad:05] (AM182232)的相似性最高,76.7%。根据双生病毒“种”的分类标准,Fz1是一个双生病毒新种,我们将这个双生病毒新种命名为一点红黄脉病毒(Emilia yellow vein virus,EmYVV)。我们还构建了EmYVV及其伴随DNAβ的侵染性克隆,致病性测定表明,Fz1DNA-A可以单独侵染本氏烟并诱导产生轻微的曲叶症状。Fz1DNA-A+ DNAβ能侵染本氏烟并诱导产生典型的曲叶症状。从福建地区表现黄色花叶症状的大青样品(Fz7-Fz9)上分离到双生病毒。利用简并引物PA/PB对叁个分离物进行扩增,获得的约500bp片段的DNA序列,其相似性为99.54%。随机选择分离物Fz7进行病毒全长基因组的扩增和序列测定。结果表明,Fz7 DNA-A全长2776 nts(FJ011668),与重瓣臭茉莉金色花叶病毒(ClGMV)相似性最高,达82%,是一新型的双生病毒,命名为中国大青黄色花叶病毒(Clerodendrum yellow mosaic China virus,ClYMCNV)。从Fz7中发现有DNA-B分子,全长2739 nts(FJ011669),证实ClYMCNV是一个新的双组分双生病毒。ClYMCNV侵染性克隆的构建为后来的致病性测定做好了准备。通过PCR扩增获得了RaMoV八个功能蛋白的基因AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BV1和BC1基因。将BV1构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上,把AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、BV1和BC1构建到捕获载体pGADT7上,通过筛选鉴定获得了重组子pGBK-BV1、pGAD-BV1、pGAD-BC1、pGAD-AC1、pGAD-AC2、pGAD-AC3和pGAD-AC4。将上述重组子分别单独转化到酵母菌AH109中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,检测八个蛋白对酵母细胞的毒性和自激活活性,结果表明,RaMoV八个蛋白对酵母菌AH109都未表现出毒性和自激活活性。将重组子pGBK-BV1与所有pGAD-X重组子两两共转化到酵母菌AH109中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,从而检测RaMoV BV1自身互作及BV1与其它七个蛋白之间的互作情况。结果显示, BV1分别与AV2、AC3和BC1之间被检测到互作现象。“本氏烟”文库质量鉴定结果表明:文库初始文库滴度分别为3.1×107 cfu/mL,扩增文库滴度为3.4×107 cfu/mL。文库重组率均大于95%,“本氏烟”文库cDNA插入片段长度集中分布在900-1000 bp之间。该文库可以用于配合实验进行文库筛选。将重组子pGBKT7-BV1单独转化到酵母菌Y187中,转化产物涂布不同营养缺陷型培养基,检测BV1蛋白对Y187细胞的毒性和自激活活性。结果表明,BV1蛋白对酵母菌Y187都未表现出毒性和自激活活性。所以,我们将Y187 ( pGBKT7-BV1 )和AH109 (pGADT7-cDNA)进行配合,配合产物涂布不同营养缺陷型培养基,筛选可能与诱饵蛋白BV1互作的寄主蛋白。结果表明,以BV1为诱饵,从本氏烟文库中筛选到八个阳性克隆。PCR鉴定阳性克隆子中cDNA插入片段的大小,将含有不同长度插入片段的酵母质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中,经测序,并在GenBank数据库中对测序结果进行blast比对,根据同源序列的注释信息,发现BV1蛋白与烟草SnRK1和DXR两个蛋白发生互作,其机理和功能有待进一步探讨。
韩芳[7]2008年在《侵染醴肠的双生病毒及其伴随的DNAβ的分子鉴定》文中提出双生病毒是植物病毒中唯一的一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒(single stranded DNA, ssDNA),双生病毒可侵染双子叶和单子叶植物,且在田间通常为复合侵染,导致作物大范围受害。该病毒一般发生在热带、亚热带地区,温带地区也有发生。在我国的云南、广西、广东、海南等省的番茄、南瓜和番木瓜等多种重要作物上都发现了双生病毒的危害,有的甚至是毁灭性的危害。本文利用双生病毒的简并引物PA和PB,对福建省福州和龙岩两地的杂草醴肠(Eclipta prostrate)进行PCR检测,结果均检测到了双生病毒。经测序,检测到的F30和F31两分离物均为空心莲子草黄脉病毒(Alternanthera yellow vein virus, AlYVV)的分离物。对两分离物DNA-A的全序列分析表明:F30及F31基因组DNA-A核酸序列相似性为96.4%。两分离物与亚洲报道的粉虱传双生病毒的基因组相似性较高,而与非洲、地中海地区报道的双生病毒相似性较低。F30与其它双生病毒比较得:其全基因组DNA-A与空心莲子草黄脉病毒(AlYVV)同源性最高,为96.4%;IR区与AlYVV-[Hn51]最为相似,具有90.3%的同源性。其4个ORFs编码的氨基酸序列与AlYVV、AlYVV-[PT1]、AlYVV-[Zin]和AlYVV-[G38]分别具有最高的同源性。应用扩增DNAβ分子的通用引物对F30和F31进行PCR扩增,结果在F30中得到一个DNAβ分子(F30β)。全序列测定分析表明:F30β全长1350nt,其互补链编码1个13.7kDa的βC1蛋白;其全序列与番茄曲叶病毒F09分离物相伴随的DNAβ(Tomato leaf curl virus-[F09], ToLCV-F09β)同源性最高,达96.7%;βC1编码的氨基酸序列与ToLCV-F09β和ToLCVβ最为相似。通过分离物F30 DNA-A和DNAβ的序列分析结果可推测,福建省醴肠杂草上可能存在空心莲子草黄脉病毒(AlYVV)和番茄曲叶病毒(ToLCV)的混合侵染。我们利用双生病毒的传毒介体烟粉虱(Bemisia tabaci),对F30分离物进行了生物学传毒试验,接种后植物的Southern blot检测结果和PCR扩增结果均证明了F30能够通过烟粉虱侵染其它植物。本文同时构建了F30分离物DNA-A的侵染性克隆,为深入研究DNA-A和DNAβ在病毒致病过程中的作用打下基础。
许雄彪[8]2017年在《双生病毒复制相关寄主因子及其卫星DNAβ复制顺式作用元件鉴定和功能分析》文中研究表明双生病毒是一类在世界范围内广泛发生的植物单链环状DNA病毒,其中菜豆金色花叶病毒属病毒(begomoviruses)种类最多,危害最为严重。双生病毒通过编码的复制相关蛋白Rep招募寄主DNA复制机器,在侵染的植物细胞核内以滚环复制模式进行基因组复制,但该过程涉及的寄主因子及其功能尚缺乏深入研究。此外,begomoviruses通常伴随有一类基因组大小约为辅助病毒一半的卫星分子,称为betasatellite。辅助病毒与betasatellite的复合侵染常常是引起重要病害症状的原因。为了更好地探究双生病毒复制及致病的机理,以及了解begomoviruses伴随betasatellite的复制、进化分子机制,本文筛选了与菜豆金色花叶病毒属病毒复制相关蛋白Rep互作的寄主因子并鉴定了 betasatellite复制顺式作用元件,取得了以下研究结果:1 Begomoviruses伴随的betasatellite复制相关顺式作用元件的鉴定及制机理研究Begomoviruses可反式复制同源或异源betasatellites,其复制缺乏显着的特异性;但当同源及异源的卫星共同存在时,辅助病毒倾向于复制和维持同源卫星,但其机理尚不清楚。前期研究发现,辅助病毒对同源卫星的复制选择性是由卫星DNA分子中一段与同源辅助病毒Rep特异性结合的序列元件(Rep binding motif,RBM)决定。序列分析发现,TbCSB RBM序列中存在两个串联的重复子(iteron)样的顺式元件GAGGACC,推测其与Rep的结合以及卫星的复制相关。竞争性EMSA试验以及iterons突变和置换分析发现,TbCSB RBM内重复子元件介导与TbCSV Rep的高亲和性结合。本氏烟侵染试验及叶盘复制试验发现,TbCSB重复子对于卫星的反式复制具有重要作用,且3'-重复子对于复制起关键作用,而5’-重复子能够增强TbCSB的复制。构建了 TYLCCNB和TbCSB的重复子互换突变体,侵染性克隆接种实验发现,betasatellite内的重复子序列是决定辅助病毒对同源卫星选择性复制的关键元件。利用基于指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment,SELEX)分析发现,TbCSV Rep体外筛选得到的卫星DNA配体序列中均含有与野生型重复子高度相似的保守序列GGACC或GAACC,且这些配体序列与Rep具有很高的结合亲和性。序列比对分析发现,betasatellites中的重复子序列与辅助病毒基因组DNA内的重复子序列在位置、大小及序列上具有高度的保守性。突变分析表明,辅助病毒重复子序列也是其复制所必需的。进一步大规模序列分析发现,多种双生病毒/卫星病害复合体均存在一致的重复子序列。这些结果表明,betasatellite在长期的进化过程中获得了与辅助病毒类似的重复子序列,以适应辅助病毒介导的高效复制。本研究首次报道了 betasatellite需要与辅助病毒同源的重复子进行高效复制,解释了困扰学界的卫星复制专化性机制的疑问,同时为双生病毒/卫星病害复合体的起源,进化和流行提供新的见解。2与菜豆金色花叶病毒属病毒复制相关蛋白Rep互作的本氏烟寄主因子筛选和功能研究双生病毒侵染已成熟的寄主植物细胞后,通过复制相关蛋白(Replication protein,Rep)与寄主细胞的蛋白互作,从而激活细胞周期,营造有利于病毒复制的细胞环境。为了更深入探究双生病毒复制机理,我们利用酵母双杂交文库筛选与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus-Y 10,TYLCCN V)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus-Y35,TbCSV)Rep互作的本氏烟寄主因子,共得到15个互作的蛋白。利用TRV沉默寄主因子表达,发现其中铁氧还蛋白FerredoxinⅠ(NbFdnⅠ)表达下调后,本氏烟植株表现出褪绿黄化的表型。NbFdnⅠ沉默植株接种TbCSV后,病毒引起的症状大大减轻,病毒复制积累量也显着降低,表明NbFdnⅠ参与了 TbCSV侵染复制过程。NbFdnⅠ参与光合作用中电子链传递,亚细胞定位研究发现,其定位于叶绿体表面。表达分析发现,NbFdnⅠ在双生病毒TbCSV单独侵染时表达量上调,但当TbCSV与伴随的betasatellite(TbCSB)存共同侵染时,NbFdnIⅠ转录反而显着下调。前期研究发现,当TbCSV单独侵染时,JA的受体COI1转录明显上调,而在有TbCSB共同侵染时,COI 1被显着下调。为了验证COI 1与NbFdn Ⅰ响应TbCSV侵染的关系,我们利用TRV沉默下调NbFdnⅠ时,发现COI 1的转录被显着下调,暗示NbFdnⅠ能够调控COI1基因的转录而调控JA抗病毒反应。进一步的研究发现,βC1即为抑制NbFdnⅠ表达的关键因子。3印度绿豆黄化花叶病毒复制相关酵母寄主因子鉴定及编码的AC5基因功能研究我们构建了印度绿豆黄化花叶病毒(Mungbean yellow mosaic India virus,MYMIV)的酵母复制载体,分别转化酵母菌株BY4741和W303-1B,发现MYMIV能在酵母中复制。进一步利用酵母必需基因温度敏感型突变体库,筛选了 787个温度敏感型突变体酵母菌株,通过适宜温度、半致死温度以及营养缺陷筛选,获得了 131个影响MYMIV复制的酵母寄主因子。分析发现,这些寄主因子涉及DNA复制、DNA损伤修复、细胞分裂周期、Pre-mRNA加工等生物学途径。对MYMIV基因组不同长度的插入及突变分析发现,MYMIV在酵母体内的复制模式并非经典的滚环复制(rolling circle replication,RCR)。利用MYMIV酵母复制系统,对AC5基因进行突变分析发现,MYMIV-AC5m无义突变体在酵母中的复制效率大大降低,且在绿豆寄主上引起的黄化、花叶症状减轻。Southern blot检测发现,AC5突变体可系统侵染试验寄主本氏烟,但DNA积累量降低;进一步本氏烟叶盘复制试验发现,AC5m导致MYMIV DNA-A复制积累量降低,说明AC5基因对于MYMIV复制虽然并非必需,但能显着增强复制。PVX过表达AC5发现能引起活性氧积累而导致细胞坏死;AC5转基因本氏烟具有植株矮小、开花延迟的表型,且AC5转基因能显着增强MYMIV的毒性,说明AC5是一个症状决定因子。进一步研究发现AC5能抑制sense-RNA介导的转录后水平基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),且能抑制 DOMAINS REARRANGAED METHYTRANSFERASE 2(DRM2)的转录从而抑制寄主的转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)抗病毒反应。
姜磊[9]2007年在《双生病毒卫星DNA编码的βC1基因的原核表达、单克隆抗体制备及细胞定位》文中研究表明双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒，至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。近年来发现一些单组分双生病毒伴随有卫星DNAβ。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因，该基因是一个参与症状诱导的关键因子。本论文进行了βC1基因的原核表达，并制备了单克隆抗体。利用原核表达载体pET-30a和pET-32a在大肠杆菌中分别表达了与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus)Y10分离物(TYLCCNV-Y10)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus)Y35分离物(TbCSV-Y35)相伴随的DNAβ分子的βC1基因，用Ni~(2+)-NTA树脂亲和纯化了重组蛋白Y10βC1和Y35βC1。分别以重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，用杂交瘤细胞技术制备了6株能够稳定传代并分泌抗Y10βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各单抗腹水的间接ELISA效价在1：16000～1：128000之间，获得9株分泌抗Y35βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各单抗腹水的间接ELISA效价在1：128000～1：1024000之间。用制备的Y10βC1和Y35βC1单克隆抗体分别对TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35侵染的烟草中的βC1蛋白进行亚细胞定位，结果发现该蛋白在健康烟草中没有积累，而在病毒侵染的烟草细胞核和叶绿体中表达并积累。
丁陈君[10]2009年在《双生病毒卫星DNA与脉突和耳突症状相关的遗传决定因子研究》文中进行了进一步梳理双生病毒/DNAβ病害复合体在自然寄主上能诱导不同的症状表型。烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)/DNAβ在烟草和番茄上能引起曲叶症状,而中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)/DNAβ除引起曲叶外还引起寄主的脉突和耳突症状。为了确定症状差异的遗传决定因子,对TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ进行了假重组试验,结果表明脉突和耳突的表型是由TYLCCNV DNAβ决定的。DNAβ互补链上编码一个保守的ORF,即βC1,对TYLCCNV DNAβ的βC1的突变发现它编码一个症状决定因子,表达TYLCCNV DNAβ的βC1的转基因烟草产生曲叶、畸形和叶背面组织增生等发育异常的表型,而大部分转化TbCSV DNAβ的βC1基因的烟草和番茄植株均与正常植株类似,只有少数烟草表现出轻微叶上卷表型。为了进一步定位DNAβ上决定症状的遗传决定因子,利用Overlap Extension PCR的方法对两个卫星的βC1 ORF及其上游约430 nt的片段(包含A-rich区和βC1基因转录起始位点上游173 nt或200 nt的片段,简称为片段AP)分别进行了互换。构建嵌合体卫星的侵染性克隆,分别与辅助病毒TbCSV和TYLCCNV共同接种烟草和番茄。嵌合有TbCSV DNAββC1的TYLCCNV DNAβ丧失了诱导脉增厚和耳突表型的能力;嵌合有TYLCCNV DNAββC1或AP片段的TbCSV DNAβ也不能诱导植株产生典型的脉增厚和耳突。而嵌合TbCSV AP片段的TYLCCNVDNAβ则产生了耳突,但是耳突的数量减少、大小变小,并延迟产生。通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性,发现TbCSV DNAββC1基因上游的全长片段拥有启动子活性,它能驱动GUS在转基因烟草中组成型表达。Southern印迹分析说明了所有嵌合体卫星均能系统侵染寄主植物,而且无论是辅助病毒还是卫星分子,其在植物体内的积累量与病害复合体引起的表型差异无关。上述结果表明,DNAβ编码的βC1蛋白对病害复合体TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ产生的症状差异起主导作用,但βC1的启动子也能影响症状诱导。对接种含TYLCCNV DNAββC1的PVX(PVX-Y10βC1)和PVX空载体的本氏烟植株分别提取RNA,进行miRNA芯片分析,结果表明,与杨树miR398b、番茄miR397、拟南芥miR397a以及拟南芥miR166a序列同源的miRNA积累量在两个样品之间存在显着性差异。Northern印迹结果验证了miR165/166同源物的积累量在表达TYLCCNV DNAββC1的本氏烟中特异性降低。这表明βC1有可能通过某种机制降低miRNA的量,减弱miRNA的有效切割,从而打乱植物的正常发育。
参考文献：
[1]. 双生病毒DNAβ分子βC1基因的功能研究[D]. 崔晓峰. 浙江大学. 2004
[2]. 双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用[D]. 钱亚娟. 浙江大学. 2005
[3]. 中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）致病分子机理及其卫星DNA诱导的基因沉默研究[D]. 陶小荣. 浙江大学. 2004
[4]. 双生病毒卫星DNA的复制及介导的病毒—介体互惠机制研究[D]. 张彤. 浙江大学. 2012
[5]. 叁种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究[D]. 郭维. 浙江大学. 2008
[6]. 福建省六种双生病毒的分子鉴定及RaMoV NSP互作蛋白的筛选[D]. 杨彩霞. 福建农林大学. 2009
[7]. 侵染醴肠的双生病毒及其伴随的DNAβ的分子鉴定[D]. 韩芳. 西北农林科技大学. 2008
[8]. 双生病毒复制相关寄主因子及其卫星DNAβ复制顺式作用元件鉴定和功能分析[D]. 许雄彪. 浙江大学. 2017
[9]. 双生病毒卫星DNA编码的βC1基因的原核表达、单克隆抗体制备及细胞定位[D]. 姜磊. 浙江大学. 2007
[10]. 双生病毒卫星DNA与脉突和耳突症状相关的遗传决定因子研究[D]. 丁陈君. 浙江大学. 2009
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