LncRNA Oeblr20通过Oct4 eRNA通路调控干细胞多能性和重编程的作用及机制研究

论文摘要

研究背景:多能性干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）因其无限的自我更新及向三个胚层分化的多能性,在发育生物学及再生医学中拥有巨大的应用潜能。PSCs包括由哺乳动物囊胚中的内细胞团分离而来的胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）及由体细胞过表达Oct4 Sox2,Klf-4,c-Myc（OSKM）四种转录因子重编程而产生的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）。其中iPSCs来源于自体体细胞,回避了 ESCs应用时的伦理争议,且避免了异体移植产生的免疫排异,因此应用前景更广。然而,目前的重编程体系存在效率低、耗时长的瓶颈,阻碍了 iPSCs在再生医学中的应用。近期的研究发现长链非编码RNA（lnon-coding RNA,lncRNA）在重编程及多能性的维持上可能具有重要的调控作用。lncRNAs的长度一般超过200个核苷酸,此类RNAs虽然不编码蛋白质,但以其独特的方式在多种层面上调控基因的表达,包括转录层面、转录后层面及蛋白质层面等等。通常,物种越复杂,lncRNAs的种类越繁多,且lncRNAs常常具有较强的组织、细胞特异性。因此,提示lncRNAs在细胞命运决定上具有重要作用,如干细胞多能性维持、细胞分化及重编程等。深入揭示lncRNAs的作用机制,对于探索决定细胞命运的关键因素,形成高效稳定的诱导体系具有十分重要的理论意义和应用价值。为寻找具有多能性潜能的lncRNA,本研究前期通过比较Fib及iPSCs RNA-Seq数据,筛选出iPSCs中高表达的lncRNA。再通过RNA原位逆转录捕获测序技术（RNA reverse transcription-associated trap sequencing,RAT-seq）,进一步从中挑选出与多能性基因调控区结合的具有调控潜能的lncRNA。研究者应用该方法筛选出一条位于17号染色体的全新lncRNA,RNA-Seq示它在iPSCs中高表达,RAT-Seq示它富集在多能性基因Oct4增强子区域,故将其命名为Oct4 enhancer binding lncRNA 20,简称Oeblr20。因此,本研究需要进一步深入探讨具有多能性潜能的lncRNAs Oeblr20是否可调控多能性并促进重编程,更重要的是揭示其具体的调控机制。研究目的:1.明确lncRNA Oeblr20差异性表达的特点、亚细胞定位及全长序列信息。2.探讨lncRNA Oeblr20调控干细胞多能性及促进重编程的作用。3.揭示lncRNA Oeblr20结合Oct4增强子后通过eRNA通路发挥作用的分子机制。研究方法:1.应用RT-PCR明确lncRNA Oeblr20在不同细胞及组织中的表达差异,RNA-FISH明确它的亚细胞定位,cDNA末端快速扩增技术（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）获得它的全长信息。2.合成shRNA敲低质粒,转染iPSCs后观察lncRNA Oeblr20表达水平降低对多能性基因表达的影响。3.合成过表达质粒,转染体细胞Fib后观察]ncRNA Oeblr20表达水平上调对多能性基因表达的影响。4.将Oeblr20过表达及对照质粒转染DOX-OSKM-MEFs,诱导完成重编程,观察lncRNA Oeblr20对重编程效率及多能性的影响。5.应用RAT-Seq、DNA-RNA FISH及Luciferase双荧光素酶报告系统明确Oct4增强子为lncRNA Oeblr20的作用靶点。6.通过RT-qPCR明确过表达及敲低lncRNA Oeblr20影响Oct4增强子RNA的表达水平。7.通过甲基化水平检测明确lncRNA Oeblr20对Oct4增强子区域DNA甲基化水平的影响。8.应用ChIP及RIP方法确定lncRNA Oeblr20、Oct4及去甲基化酶之间的互相作用。研究结果:1.通过RNA-Seq及RAT-Seq筛选出具有多能性潜能的lncRNA Oeblr20,RNA-Seq提示它在iPSCs中高表达而在Fib中不表达;RAT-Seq提示它与关键多能性基因Oct4的增强子区域结合。2.RNA-FISH提示Oeblr20位于细胞核内;差异性表达实验提示它的表达水平与干细胞多能性密切相关,Oeblr20在Fib及未编程成功的URC细胞中几乎不表达,然而一旦重编程为iPSCs,它的表达水平明显增加;而且lncRNAOeblr20在分化为终末脏器的组织中并不表达。3.LncRNA Oeblr20对干细胞多能性的维持至关重要,在敲低实验中,当敲低Oeblr20的表达水平时,关键性多能性基因的表达水平均下降,且iPSCs发生分化,NANOG免疫荧光染色为阴性,细胞难以维持多能性。4.LncRNAOeblr20可促进多能性基因Oct4的表达,在过表达实验中,当在Fib中过表达Oeblr20后,Oct4的表达水平也提高了 3倍左右。5.LncRNA Oeblr20可提高重编程效率,在DOX-OSKM-MEFs体系中过表达Oeblr20可提高iPSCs的诱导效率及iPSCs的多能性。6.Oct4是Oeblr20的作用靶点,尤其是Oct4的增强子区域。前期的RAT-seq已明确lncRNA Oeblr20可结合Oct4的增强子区域;随后我们在iPSCs及过表达了Oeblr20的Fib中进行Oeblr20ncRNA-Oct4 DNA FISH发现两者在空间上毗邻;最后Luciferase双荧光素酶报告系统也证实lncRNA Oeblr20可提高Oct4增强子的活性。7.LncRNA Oeblr20通过促进OctDNA区域去甲基化而激活OcteRNA表达:功能实验中,当Oeblr20敲低后Oct4 eRNA水平明显下调,而Oeblr20过表达后Oct4 eRNA水平随之升高,提示lncRNA Oeblr20可直接影响Oct4 eRNA的表达水平。且通过DNA甲基化水平检测发现外源性过表达Oeblr20时,Oct4增强子区域DNA甲基化水平明显下降。8.LncRNA Oeblr20招募TET2到Oc4增强子区域:用抗TET1、抗TET2及IgG对照抗体进行ChIP实验发现在Oeblr20过表达的Fib中TET2可结合于Oct4的增强子区域。而且随后的RIP实验提示TET2主要与Oeblr20的3’端及5’端结合。提示lncRNA Oeblr20可能通过招募TET2到Oct4增强子区域,促进DNA去甲基化而调控eRNA表达。研究结论:1.lncRNA Oeblr20位于细胞核内,在iPSCs及ESC中高表达,在Fib、未编程成功的细胞及分化的组织器官中不表达或表达量极低,其表达水平与其他关键多能性基因呈正相关。2.lncRNA Oeblr20对多能性的维持至关重要,敲低Oeblr20后iPSCs发生分化难以维持多能性,且关键多能性基因表达随之下调。3.lncRNA Oeblr20可促进体细胞Fib多能性基因Oct4的表达,提高OSKM重编程体系的诱导效率,并提高iPSCs的多能性。4.RAT-Seq、RNA-DNA FISH 及 Luciferase 实验均证实 Oct4 为 lncRNA Oeblr20的作用靶点。Oeblr20可提高Oct4增强子的活性,促进Oct4 eRNA的表达。5.lncRNA Oeblr20可招募TET2去甲基化酶,促进Oct4增强子区域DNA去甲基化,从而促进Oct4eRNA表达。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王聪

导师: 李薇

关键词: 长链非编码,多能性,重编程,增强子,甲基化

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R329.2

总页数: 105

文件大小: 6505K

下载量: 284

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