澳洲袋鼠皮酶解蛋白肽的应用研究

论文摘要

本研究以澳洲袋鼠皮为原料,研究其提取袋鼠皮蛋白肽的工艺和用途,为实际应用和市场推广提供理论基础依据。蛋白肽提取工艺的过程中,采用木瓜蛋白酶等六种不同的蛋白酶酶解袋鼠皮,以对ABTS自由基清除能力为衡量指标。采用单因素分析方法,确定了六种蛋白酶的最佳酶解条件。比较得出木瓜蛋白酶为优选,通过木瓜蛋白酶酶解袋鼠皮的正交实验,得到料液比为1:20,pHH为6.4、酶量为2%（140,000U）,在55±0.5℃的温度下水解3±0.15h最佳的提取条件。冷冻干燥后,得到水溶性较好,呈淡黄色的袋鼠皮蛋白肽。肽粉得率在15-17%之间。对袋鼠皮蛋白肽的功效通过体外的自由基清除实验、酪氨酸酶活性抑制实验、体外保湿能力比较、H2O2诱导人肝细胞L02氧化损伤的模型建立及对果蝇抗氧化能力实验进行研究。实验结果表明,袋鼠皮蛋白肽在体外能清除DPPH等自由基,且肽浓度与自由基清除能力的大小呈正相关。同时,袋鼠皮蛋白肽对不同种类自由基的清除能力也有所差异。通过体外的抗氧化研究,为细胞实验奠定了良好的基础,提供了细胞实验的可行性。酪氨酸酶活性体外抑制实验证明,袋鼠皮蛋白肽能抑制酪氨酸酶活性,抑制类型为不可逆抑制的。细胞实验也说明,0-0.5 μg/μl的袋鼠皮蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性具有抑制作用,且呈现出浓度依赖性。通过与市面上的保湿产品进行失水率比较来研究袋鼠皮蛋白肽保湿功效。结果表明,蛋白肽性质温和,可以持久而稳定的保持水分,涵养皮肤,同时也能补充人体流失的氨基酸和水分,对皮肤有较好的锁水、滋养作用。在三个不同的肽浓度中,低浓度的蛋白肽10 mg/ml的保湿效果最佳。袋鼠皮蛋白肽具有很好的保湿功效的同时,也能作为化妆品的添加剂。通过建立过氧化氢诱导人肝细胞L02氧化损伤的模型,研究袋鼠皮蛋白肽对氧化损伤的人肝细胞L02的修复作用。结果表明:袋鼠皮蛋白肽在0～0.5 μg/μl浓度范围内不仅对L02细胞活性没有抑制作用而且显著提高了受损细胞的存活率,改善了细胞的形态;与此同时,显著降低了过氧化氢诱导的丙二醛（MDA）释放,降低了蛋白质羰基含量和活性氧的水平,降低细胞受氧化损伤的水平。本研究采用不同剂量的袋鼠皮蛋白肽饲养果蝇,探究袋鼠皮蛋白肽的抗衰老作用及其机制。统计结果表明,果蝇20天的死亡数中,剂量组与对照组表现出了显著性差异,说明肽对果蝇寿命的延长起到较为显著的作用。果蝇体内与寿命相关的SOD酶和CAT酶的活性与肽浓度呈现出浓度依赖性,随着浓度的升高,活性也有所增加。MDA的含量与肽的浓度呈现负相关,随着浓度的增加,MDA含量降低,说明脂质氧化损伤水平在肽的作用下有所降低。以上结果为深入开发袋鼠皮蛋白肽保健产品提供相应的理论基础与技术支持。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 袋鼠皮

1.1.1 袋鼠的基本情况

1.1.2 袋鼠皮产品的综合开发利用

1.2 蛋白肽的研究概况

1.2.1 蛋白肽的制备

1.2.2 蛋白肽的应用

1.2.2.1 蛋白肽抗氧化作用

1.2.2.2 蛋白肽美白作用

1.2.2.3 蛋白肽保湿作用

1.2.2.4 蛋白肽对果蝇寿命的影响

1.3 本论文的研究内容及意义

2 实验的材料、方法

2.1 材料和试剂

2.2 仪器

2.3 实验方法

2.3.1 不同蛋白酶酶解袋鼠皮蛋白肽条件研究

2.3.2 最佳蛋白酶的正交实验

2.3.3 蛋白质含量测定分析

2.3.4 游离氨基酸含量测定分析

2.3.5 总糖和还原糖含量测定分析

2.3.6 灰分含量测定分析

2.3.7 金属元素组成测定分析

2.3.8 袋鼠皮蛋白肽分子量测定分析

2.3.9 袋鼠皮蛋白肽的氨基酸总量测定分析

2.3.10 袋鼠皮蛋白肽抗氧化能力的测定

2.3.10.1 袋鼠皮蛋白肽对超氧阴离子的清除能力

2.3.10.2 袋鼠皮蛋白肽对羟基的消除能力

2.3.10.3 袋鼠皮蛋白肽对DPPH的消除能力

2.3.10.4 袋鼠皮蛋白肽对ABTS自由基清除能力

2.3.10.5 袋鼠皮蛋白肽对ROS自由基清除能力

2.3.11 袋鼠皮蛋白肽的美白功效

2.3.11.1 袋鼠皮蛋白肽对酪氨酸酶的半抑制率

2.3.11.2 袋鼠皮蛋白肽对酪氨酸酶的抑制类型

2.3.11.3 袋鼠皮蛋白肽对酪氨酸酶单酚酶活力分析

2.3.11.4 袋鼠皮蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞活性的影响

2.3.11.5 袋鼠皮蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响

2.3.12 袋鼠皮蛋白肽的体外保湿效果

2.3.13 过氧化氢损伤LO2细胞的模型建立

2.3.13.1 细胞培养与收集

2.3.13.2 袋鼠皮蛋白肽对人肝细胞LO2细胞活性的影响

2.3.13.3 细胞氧化损伤模型的建立

2.3.13.4 活性氧簇（ROS）含量的测定

2.3.13.5 脂质氧化产物丙二醛（MDA）含量测定

2.3.13.6 蛋白质羰基含量的测定

2.3.14 MTT比色法

2.3.15 相差显微镜法

2.3.16 袋鼠皮蛋白肽对果蝇抗氧化能力影响的模型建立

2.3.16.1 生存实验

2.3.16.2 生化实验

2.3.17 统计方法

3 实验结果

3.1 袋鼠皮蛋白肽提取的工艺优化

3.1.1 不同蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.1 中性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.2 酸性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.3 碱性蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.4 木瓜蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.5 胃蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.1.6 胰蛋白酶酶解袋鼠皮的条件研究

3.1.2 最佳蛋白酶的正交实验

3.1.2.1 最佳蛋白酶的选择

3.1.2.2 木瓜蛋白酶的正交实验

3.1.2.3 袋鼠皮蛋白肽的提取制备

3.1.3 袋鼠皮蛋白肽成分分析

3.1.3.1 袋鼠皮蛋白肽的主要成分与金属元素分析

3.1.3.2 袋鼠皮蛋白多肽的氨基酸总量分析

3.1.3.3 袋鼠皮蛋白肽的分子量测定

3.2 袋鼠皮蛋白肽的抗氧化能力

3.2.1 袋鼠皮蛋白肽对超氧阴离子的清除能力

3.2.2 袋鼠皮蛋白肽对羟基自由基的清除能力

3.2.3 袋鼠皮蛋白肽对DPPH的清除能力

3.2.4 袋鼠皮蛋白肽对ABTS自由基清除能力

3.2.5 袋鼠皮蛋白肽对ROS自由基清除能力

3.3 袋鼠皮蛋白肽的美白功效

3.3.1 袋鼠皮蛋白肽对体外酪氨酸酶的半抑制率

3.3.2 袋鼠皮蛋白肽抗酪氨酸酶活性的抑制类型

3.3.3 袋鼠皮蛋白肽对酪氨酸酶单酚酶活力分析

3.3.4 袋鼠皮蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞活性的影响

3.3.5 袋鼠皮蛋白肽对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响

3.4 袋鼠皮蛋白肽的体外保湿效果

3.5 过氧化氢损伤LO2细胞的模型建立

3.5.1 袋鼠皮蛋白肽对人肝细胞LO2细胞活性的影响

3.5.2 过氧化氢损伤人肝细胞LO2模型建以

3.5.3 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢损伤细胞LO2活性的影响

3.5.4 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢诱导损伤LO2细胞的形态影响

3.5.5 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢诱导损伤人肝细胞LO2的凋亡影响

3.5.6 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢损伤LO2中ROS清除能力的影响

3.5.7 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢损伤LO2中丙二醛（MDA）含量影响

3.5.8 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢损伤LO2中蛋白质羰基含量的影响

3.6 袋鼠皮蛋白肽对果蝇抗氧化能力影响的模型建立

3.6.1 生存实验

3.6.2 生化实验

3.6.2.1 果蝇体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

3.6.2.2 果蝇体内过氧化氢酶（CAT）活性的测定

3.6.2.3 果蝇体内丙二醛（MDA）含量的测定

4 讨论

4.1 袋鼠皮蛋白肽的制备工艺

4.2 袋鼠皮蛋白肽体外抗氧化能力的测定

4.3 袋鼠皮蛋白肽美白功效研究

4.4 袋鼠皮蛋白肽保湿功效研究

4.5 袋鼠皮蛋白肽对过氧化氢诱导损伤人肝细胞LO2的修复作用

4.6 袋鼠皮蛋白肽对果蝇抗氧化能力的研究

5 结论

6 展望

参考文献

在学期间发表论文和会议摘要

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王碧雪

导师: 陈清西

关键词: 袋鼠皮蛋白肽,提取工艺,美白,保湿,抗氧化

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q51

总页数: 86

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