论文摘要
真核生物的基因表达过程涉及多个复杂而精密的调控过程。其中,无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）可以识别并降解含有提前终止密码子（premature termination codon,PTC）的异常mRNA,从而避免截短蛋白质对机体产生的潜在危害。此外,NMD途径还可以调控细胞中约10%或者20%的正常mRNA或非编码RNA的表达水平,以确保机体细胞的内平衡,与胚胎的发育、细胞的免疫及神经系统发育等密切相关。因此,对NMD途径机制的研究具有重要意义。NMD途径的核心问题是对含有无义密码子的mRNA的识别及降解。到目前为止,趋于主流的主要有3个模型:以哺乳动物为代表的外显子连接复合体（exon junction complex,EJC）模型;以果蝇为代表的3?-UTR（untranslated sequence）模型;以酿酒酵母为代表的DSE（downstream sequence element）模型。但是其详细机制尚未阐释清楚。基于原生动物蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）进化地位的特殊性,通过对蓝氏贾第虫中NMD途径的研究,我们不仅可以探明其体内的NMD途径,同时也能为在进化和分子机制上阐明高等生物体内的NMD途径的详细分子机制提供理论和数据支持。本实验室前期研究表明,贾第虫（G.lamblia）细胞中的NMD途径启动过程中,首先在无义mRNA的PTC处形成SURF（eRF3-eRF1-UPF1-SMG1）复合物,UPF1被磷酸化修饰,NMD途径激活,但对其激活后下游无义mRNA的降解机制还有待深入了解。本文在生物信息学数据的支持下,鉴定得到了参与蓝氏贾第虫NMD途径的相关因子:贾第虫上游移码蛋白1（G.lamblia up-frameshift 1,GlUPF1）、贾第虫不均一核小核糖核蛋白（G.lamblia HRP1,GlHRP1）、贾第虫5?-3?核糖核酸外切酶（G.lamblia 5?-3?exoribonuclease 1,GlXRN1）、贾第虫3?-5?超级杀手蛋白质（G.lamblia 3?-5?superkiller protein 7,GlSki7p）等。通过构建包含不同结构域的GlUPF1截短体蛋白质GlUPF1、GlUPF1（1500 aa）及GlUPF1（5011 304 aa）,运用酵母双杂交实验,在体内进行蛋白质间的相互作用的研究,以此分析贾第虫中NMD因子间的相互关系。结果显示,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1（1500 aa）、GlSki7p间均可发生相互作用。而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域可分别与GlHRP1、GlXRN1（1500 aa）、GlSki7p相互作用。以ONPG为底物,对β-半乳糖苷酶活性进行检测,分析GlUPF1（1500 aa）和GlUPF1（5011 304 aa）分别与GlHRP1、GlXRN1（1500 aa）、GlSki7p相互作用的强度,结果显示,GlUPF1（5011 304 aa）与GlHRP1、GlXRN1（1500aa）、GlSki7p相互作用的强度均强于GlUPF1（1500 aa）。进一步进行蛋白质的体外相互作用实验来证实上述结果,构建重组质粒pET-28aGlSki7p、pET-28a-GlHRP1、pET-28a-GlXRN1（1500 aa）、pGEX-6P-1-UPF1（1500 aa）及pGEX-6P-1-UPF1（5011304 aa）,在大肠杆菌中进行原核表达纯化,通过Ni-NAT柱Pull-down实验进一步验证各因子间的相互作用关系,结果表明,GlUPF1（1500aa）和GlUPF1（5011 304 aa）均与GlHRP1、GlXRN1（1500 aa）、GlSki7p间有较强的相互作用。综合以上实验结果,结合实验室前期研究结果,我们初步建立起蓝氏贾第虫中NMD途径的通路:在贾第虫NMD途径的起始阶段,肽链释放因子eRF1和eRF3协同识别提前终止密码子,核糖体停滞在PTC处,然后肽链释放因子与UPF1因子相互作用,在提前终止密码子处形成复合体SURF（SMG1-UPF1-eRF1-eRF3）,其中GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶（suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1）磷酸化修饰,NMD途径激活;随后被修饰的GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD途径的底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5?-3?核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3?-5?核糖核酸降解因子GlSki7p;两个降解因子通过5?-3?和3?-5?两个方向协同作用,最终降解靶标mRNA。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 吕佳
导师: 柴宝峰
关键词: 蓝氏贾第虫,无义介导的降解途径,贾第虫上游移码蛋白,贾第虫核糖核酸外切酶,贾第虫超级杀手蛋白质
来源: 山西大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山西大学
基金: 国家自然科学基金
分类号: Q522.2
DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000268
总页数: 68
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