导读:本文包含了双特异性单链抗体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:抗体,特异性,噬菌体,表皮,细胞,肿瘤,受体。
双特异性单链抗体论文文献综述
祁麟,熊梦裳,林芳珍,卢杨,熊冬生[1]（2019）在《人AFP启动子操控的跨膜型抗CD3单链抗体构建及其在AFP阳性肝癌细胞中特异性表达》一文中研究指出目的设计肝癌特异性人甲胎蛋白启动子(hAFPp)操控的跨膜型抗CD3单链抗体(antiCD3scfv),使其仅在AFP阳性(AFP~+)肝癌细胞中特异性表达。方法利用分子克隆技术构建pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序验证其基因序列的正确性。取AFP~+人肝癌细胞HepG2、Huh-7及AFP阴性(AFP~-)正常人肝细胞HL-7702、人乳腺癌细胞MCF-7,利用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定hAFPp的肝癌细胞转录特异性;通过Western blotting、免疫荧光、流式分析检测antiCD3scfv蛋白在细胞的表达、定位及表达效率。结果构建的pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序后基因序列正确。hAFPp在AFP~+的HepG2、Huh-7细胞中转录活性分别为160.86%±26.24%、80.08%±12.64%,而在AFP~-细胞中转录活性均<7%(P均<0.05)。在AdCD3scfv感染的细胞中,仅HepG2、Huh-7细胞中检测到antiCD3scfv蛋白表达(36.7 kD),且表达于细胞膜表面,细胞中GFP~+ antiCD3scfv~+细胞群比例>90%,而HL-7702、MCF-7均无条带出现。结论携带antiCD3scfv蛋白基因的腺病毒感染周围细胞后,hAFPp调控antiCD3scfv在肝癌细胞的细胞膜特异性表达,进而可能实现antiCD3scfv分子直接介导免疫杀伤的抗肿瘤效果。(本文来源于《山东医药》期刊2019年29期）
郭艳,张长庆[2]（2018）在《靶向HER2/EGFR分子双特异性单链抗体的构建及其体内外抗乳腺癌的研究》一文中研究指出目的构建一种可以同时靶向抑制人类表皮生长因子受体2(HER2)和表皮生长因子受体(EGFR)分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果。方法采用Overlap PCR法通过柔性肽(G4S)将曲妥珠单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建工程载体,并通过大肠埃希菌系统进行表达纯化,获得同时靶向HER2和EGFR的双特异性单链抗体;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和HER2过表达的乳腺癌细胞BT474的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测单链抗体对BT474乳腺癌细胞的增殖抑制;建立BT474荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性;使用免疫组织化学检测单链抗体是否可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化,并对肿瘤细胞增殖指标Ki-67进行检测。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体,经蛋白印迹法鉴定验证了双特异性单链抗体表达及装配正确。流式细胞术检测双特异性单链抗体与乳腺癌细胞BT474的结合率为53.3%,与曲妥珠单抗(69.0%)、西妥昔单抗结合率(60.3%)相当。MTT法中,与磷酸盐缓冲液(PBS)组相比,曲妥珠单抗组、西妥昔单抗组与双特异性单链抗体组对乳腺癌细胞BT474均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性。在蛋白水平为400nmol/L时,双特异性单链抗体组抑制率[(65.19±4.21)%]强于曲妥珠单抗组[(40.67±1.78)%]与西妥昔单抗组[(32.20±2.94)%]。通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤实验,双特异性单链抗体组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(74.32±4.37)%,明显优于曲妥珠单抗组(44.83±6.02)%与西妥昔单抗组(39.44±8.75)%。通过免疫组织化学对给药后的肿瘤组织进行分析,与PBS组相比,双特异性单链抗组可以明显抑制BT474皮下移植瘤组织中p-EGFR、Ki-67的表达量。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体。双特异性单链抗体具有良好的体内外抗肿瘤活性,有效抑制乳腺癌细胞BT474的体内外增殖,并通过免疫组织化学分析到双特异性单链抗体可以抑制EGFR的磷酸化并抑制肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景。(本文来源于《检验医学与临床》期刊2018年19期）
杨妹[3]（2018）在《CIK细胞和肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500共同介导抗p21Ras单链抗体治疗脑胶质瘤的实验研究》一文中研究指出[目的]通过体外实验研究重组腺病毒KGHV500对脑胶质瘤U251细胞生物活性等的影响,通过体内实验研究CIK携带重组腺病毒KGHV500共同介导抗p21Ras单链抗体治疗裸鼠脑胶质瘤移植瘤的效果及靶向性,实现抗p21Ras单链抗体在脑胶质瘤中的持续长效表达,为治疗脑胶质瘤提供实验依据及新方法。[方法]一、重组腺病毒KGHV500和KGHV400的扩增、浓缩、纯化、鉴定:体外利用HEK293细胞将重组腺病毒KGHV500大量扩增;经PCR鉴定其是否含有纤毛片段和单链抗体片段;经双重氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,利用TCID50法测其滴度;KGHV500以不同MOI值感染人脑胶质瘤U251细胞,以确定KGHV500感染人脑胶质瘤U251细胞的最佳感染复数。二、体外实验:免疫组织化学检测人脑胶质瘤U251细胞表面CD46蛋白的表达情况;透射电镜观察重组腺病毒KGHV500、KGHV400对人脑胶质瘤U251细胞的感染情况;细胞划痕实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞迁移能力的影响;MTT比色实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞活力的影响;Transwell侵袭小室实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞侵袭能力的影响;TUNEL凋亡实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞的促凋亡作用。叁、CIK细胞的分离制备、培养与鉴定:分离人外周血单个核细胞,采用多种细胞因子共培养诱导成为CIK细胞;利用免疫组织化学Envision法对CIK细胞表面CD3、CD56蛋白检测以鉴定CIK细胞;利用免疫组织化学Envision法对CIK细胞表面的KGHV500受体CD46蛋白进行鉴定;免疫组织化学Envision法检测KGHV500对CIK细胞的感染效率;电镜观察CIK细胞携带重组腺病毒KGHV500、KGHV400的情况。四、建立人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤模型并分组尾静脉进行注射治疗以及体内实验:裸鼠右侧腋下皮下注射人脑胶质瘤U251细胞建立裸鼠脑胶质瘤移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分组治疗,实验组尾静脉注射携带KGHV500的CIK细胞,四个对照组分别尾静脉注射携带KGHV400的CIK细胞、KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液以进行治疗。动态监测各组裸鼠生长状态及移植瘤大小,绘制肿瘤生长曲线;观察各分组治疗脑胶质瘤移植瘤的效果,取实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500的裸鼠进行比较,在治疗后第1、3、5、7天分别处死两组裸鼠各一只,剖取肿瘤及心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、大肠、小肠、脑组织制成石蜡标本并切片进行HE染色,观察肿瘤和各脏器的病理变化,,并利用免疫组织化学Envision法观察重组腺病毒及其表达的单链抗体在裸鼠移植瘤内的表达情况,免疫组织化学Envision法观察重组腺病毒六邻体在裸鼠各脏器组织中的表达情况;Western Blot检测实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500组的裸鼠在治疗后期,两组裸鼠的移植瘤组织及各脏器组织中的单链抗体的表达情况;TUNEL凋亡实验检测各组治疗后期的移植瘤组织中的细胞凋亡情况;RT-qPCR检测各组治疗后期的移植瘤组织中的凋亡基因表达。[结果]一、采用特异性引物对重组腺病毒KGHV500进行PCR扩增后,经电泳检测显示重组腺病毒含有ScFv片段、F5/35片段,鉴定确为重组腺病毒KGHV500,双重氯化铯密度梯度离心并透析纯化后,最终获得的重组腺病毒KGHV500、KGHV400 的滴度分别为 1×109pfu/ml、1.5×1010pfu/ml,KGHV500感染人脑胶质瘤U251细胞最佳感染复数MOI为100。二、体外实验:(1)免疫组织化学Envision法检测人脑胶质瘤U251细胞表面的KGHV500受体CD46蛋白的阳性表达率约100%,且定位于细胞膜;(2)透射电镜观察重组腺病毒KGHV500、KGHV400感染脑胶质瘤U251细胞后进入细胞,病毒颗粒可见于U251细胞胞浆内;(3)细胞划痕实验显示KGHV500能抑制人脑胶质瘤U251细胞的迁移能力,实验组KGHV500感染的U251细胞在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(12.28±2.51)%、(26.25±2.48)%;KGHV400 感染的 U251细胞对照组在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(27.27±3.24)%、(43.32±1.7)%;未感染重组腺病毒的U251细胞在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(39.54±1.38)%、(89.48±0.24)%;(4)MTT比色实验结果显示实验组KGHV500感染的U251细胞在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为0.56±0.026、0.24±0.021、0.16±0.029、0.11±0.032、0.06±0.033。对照组 KGHV400感染的U251细胞在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为0.58±0.033、0.57±0.05、0.60±0.078、0.84±0.023、0.99±0.057。未感染重组腺病毒的 U251 细胞在第 1、2、3、4、5 天时的吸光度分别为 0.59±0.025、0.67±0.038、0.81±0.06、1.15±0.083、1.37±0.18,结果显示KGHV500能够明显抑制人脑胶质瘤U251细胞的活力;(5)Transwell侵袭小室实验显示KGHV500能明显抑制人脑胶质瘤U251细胞的侵袭能力,感染20小时后,实验组KGHV500感染的U251细胞侵袭至微孔膜下层的细胞数为1.75±1.03;对照组KGHV400感染的U251细胞侵袭至微孔膜下层的细胞数为16.83±2.54,对照组未感染重组腺病毒的U251细胞在20小时后侵袭至微孔膜下层的细胞数为144.50±29.12;(6)TUNEL凋亡实验显示实验组KGHV500感染脑胶质瘤U251细胞后,细胞凋亡率为(73.10±3.14)%;对照组KGHV400感染脑胶质瘤U251细胞后,细胞凋亡率为(18.46±2.32)%;对照组未感染重组腺病毒的脑胶质瘤U251细胞凋亡率为(1.44±0.03)%,结果表明KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞有明显的促凋亡作用。叁、分离人外周血单个核细胞:经多种细胞因子共培养诱导成CIK细胞;CIK细胞经免疫组织化学鉴定,其表面CD3、CD56蛋白的双阳性率约30%,鉴定其确为CIK细胞,CIK细胞表面CD46阳性率约100%,且阳性定位于CIK细胞膜;免疫组化Envision法检测KGHV500对CIK细胞的感染效率约为90%;透射电镜观察感染了重组腺病毒KGHV500、KGHV400的CIK细胞,可见CIK细胞膜表面黏附有腺病毒颗粒。四、(1)建立人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤模型;(2)分组尾静脉进行注射治疗:实验组尾静脉注射KGHV500+CIK,对照组分别尾静脉注射KGHV400+CIK细胞、KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液;(3)动态监测各组裸鼠生长状态及移植瘤大小,肿瘤生长曲线显示在尾静脉注射治疗后的第34天,上述五组的移植瘤体积(mm3)分别达到350.30±93.30、1111.80± 145.23、1650.00±241.91、2325.30±332.04、3222.60±407.27,实验组移植瘤组织生长缓慢,而对照组移植瘤组织生长较快;(4)HE可见实验组与对照组移植瘤组织无明显形态学差异;(5)实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500的裸鼠在治疗后第1、3、5、7天分别处死的裸鼠的移植瘤组织腺病毒六邻体和单链抗体的表达随着时间而逐渐表达增强,实验组的阳性强于对照组;(6)实验组裸鼠在脾脏、肾脏、肝脏中检测到不同程度的腺病毒及单链抗体阳性表达,心脏、肺、胃、胰腺、大肠、小肠和脑组织中未发现腺病毒阳性表达;而对照组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、大肠、小肠的腺病毒六邻体表达均可检测到阳性表达;(7)Western Blot检测实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500组裸鼠的移植瘤组织及各脏器组织中的单链抗体的表达情况,结果显示:实验组中移植瘤组织中有较强的抗p21Ras单链抗体表达,其中脾脏、肝脏和肾脏也有一定量的单链抗体表达,心脏、肺、胃、胰脏、脑、大肠、小肠中没有单链抗体的表达。对照组中除脑组织外,皆有单链抗体表达;(8)TUNEL凋亡实验显示实验组尾静脉注射KGHV500+CIK、对照组分别尾静脉注射KGHV400+CIK、重组腺病毒KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液,各组的细胞凋亡率分别为(78.20±3.52)%、(27.23±3.21)%、(20.47±1.04)%、(8.83±0.78)%、(2.10±0.99)%;(9)RT-qPCR检测各组治疗后期的移植瘤组织中的的凋亡基因表达,实验组中促凋亡基因Caspase-3、Caspase-7、p53均表达量较高,而抗凋亡基因Bcl-2、Survivin的表达较低,显示CIK细胞携带KGHV500可明显促进裸鼠移植瘤的凋亡。[结论]体外实验结果表明肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500可明显抑制U251脑胶质瘤的迁移、侵袭能力并抑制脑胶质瘤细胞的活力,且促进脑胶质瘤细胞凋亡。体内实验中,肿瘤生长曲线显示CIK携带KGHV500对脑胶质瘤移植瘤有明显的生长抑制作用;且CIK细胞携带KGHV500可有效地靶向移植瘤组织。体内和体外实验证实CIK细胞和KGHV500共同介导抗p21ras单链抗体治疗脑胶质瘤移植瘤的有效性和较好的靶向性。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2018-05-01）
周冲,于峰,韩邦兴,周阳,刘黎琼[4]（2018）在《双特异性单链抗体BiTE的研究进展》一文中研究指出癌症是严重威胁人类生存的重大疾病。BiTE(bispecific T-cell engager)所代表的一类具有显着抗肿瘤效应的双特异抗体,能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞。BiTE由两个单链可变片段(scFv)组成,通过柔性融合接头串联连接。一个scFv识别T细胞表面蛋白CD3ε,而另一个scFv识别特异性肿瘤细胞表面抗原。BiTE的这种结构和特异性结合蛋白能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞而形成T细胞-BiTE-肿瘤细胞复合物,诱导免疫突触形成,刺激T细胞活化,产生杀伤肿瘤的细胞因子。近年来,BiTE在抗肿瘤研究中取得了显着进展,在临床上取得了理想的治疗效果。因此,对BiTE的结构、作用机制、临床应用以及创新性运用进行阐述。(本文来源于《生物学杂志》期刊2018年04期）
王慧敏[5]（2017）在《甲基对硫磷特异性单克隆抗体和单链抗体的制备及应用》一文中研究指出甲基对硫磷(O,O-dimethyl-O-4-nitrophenyl phosphorothioate,PM)是一种高毒有机磷酸酯类农药,主要用于防治棉花、水稻、果树害虫。甲基对硫磷在食品中的残留会通过食物链进入人体,对神经系统、内分泌系统、免疫系统及生殖系统等产生毒害作用。为保障食品安全,建立快速、简单、准确的甲基对硫磷残留检测方法是非常必要的。相对于传统的酶抑制法、仪器分析法等,酶联免疫吸附测定(ELISA)具有操作简单、成本低廉、特异性强、可批量检测多个样品等优势。本研究制备了甲基对硫磷特异性单克隆抗体和单链抗体,并使用制备的单克隆抗体和单链抗体分别建立了甲基对硫磷的免疫检测方法。主要研究结果如下:(1)首先,使用甲基对硫磷特异性免疫原免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合,杂交瘤细胞筛选及腹水的制备和纯化获得了甲基对硫磷特异性单克隆抗体(PM-4G6)。(2)利用改进的高碘酸钠法将单克隆抗体(PM-4G6)与辣根过氧化物酶(HRP)偶联,获得酶标抗体(PM-4G6-HRP)。分别利用PM-4G6和PM-4G6-HRP建立了甲基对硫磷的的间接竞争酶联免疫吸附测定法(IC-ELISA)和直接竞争酶联免疫吸附测定法(DC-ELISA)。在最佳分析条件下,IC-ELISA的检测限(LOD,IC10)为0.6ng/m L,半抑制浓度(IC50)为6.6ng/m L,线性检测范围是1.4-28.0ng/mL;DC-ELISA的检测限为0.6ng/m L,IC50为3.6ng/m L,线性检测范围是1.2-12.4ng/mL。交叉反应测定结果表明所建立的ELISAs除了与杀螟硫磷、对硫磷、甲基对氧磷、对氧磷这4种农药有一定的交叉反应外,与其余用于分析的农药无明显交叉反应,对甲基对硫磷的特异性较好。(3)采用样品添加回收实验对建立的检测方法进行评价。对面粉和大米样品的甲基对硫磷添加回收实验结果显示,IC-ELISA的加标回收率在85.2%-128.9%之间,变异系数范围为2.6%-7.1%;DC-ELISA的加标回收率在101.9%-116.3%之间,变异系数范围为3.8%-10.6%。结果证明了这两种方法在样品中应用具有较高的可靠性。(4)使用甲基对硫磷特异性免疫原免疫BALB/C小鼠,成功构建了甲基对硫磷的噬菌体单链抗体库。通过固相淘选和噬菌体单克隆筛选,获得两种不同的甲基对硫磷单链抗体PM-30和PM-25,其中PM-30的灵敏度较高。将PM-30的基因插入到pET-28a(+)载体,并转化E.coli BL21(DE3),进行原核表达。最佳表达条件为25℃,0.1mmol/L IPTG条件下诱导表达8h。表达后利用生物素连接酶(BirA)对单链抗体进行生物素化,经纯化,生物素化单链抗体产量可达59.2±3.7mg/L。(5)使用获得的生物素化PM-30单链抗体建立了甲基对硫磷的IC-ELISA检测方法。经测定,在最佳分析条件下,IC-ELISA的检测限为0.9ng/m L,IC50为14.5ng/m L,线性检测范围是5.9-191.4ng/m L。交叉反应测定结果显示该方法除了与对硫磷、杀螟硫磷、甲基对氧磷3种农药有较弱的交叉反应外,与其余用于分析的农药无明显交叉反应,对甲基对硫磷的特异性较好。(本文来源于《山东农业大学》期刊2017-05-10）
陆礼[6]（2017）在《抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究》一文中研究指出目的采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体(CD40×HER2 Single chain Diabody,CD40×HER2 Sc Db),并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。方法使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选,并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 Sc Fv克隆。以此为模板,PCR扩增获取CD40 Sc Fv的重链可变区(heavy chain variable,VH)及轻链可变区(light chain variable,VL)序列,通过重迭PCR(Overlap Extension OE-PCR)将CD40 Sc Fv的VH及VL分两步与HER2 Sc Fv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 Sc Db序列全长,DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2Sc Db序列及p ET28a原核表达载体的酶切并构建p ET28a-CD40×HER2 Sc Db原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,超声裂解诱导菌体,Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 Sc Db,并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞,流式细胞术检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同,实验分为:生理盐水(Normal Saline,NS)对照组;单纯肿瘤抗原负载(Ag)组;Ag+CD40×HER2 Sc Db组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1,CCK8检测CD40×HER2 Sc Db诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型,依据给予的不同干预,将模型小鼠随机分为:NS组;HER2 Sc Fv组;CD40×HER2 Sc Db1组(750μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(1.5mg/kg)及CD40m Ab(5mg/kg)组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线,ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片,HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系,细胞免疫荧光检测CD40×HER2 Sc Db对HER2的靶向功能,CCK8实验检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同,实验分组为:NS组;CD40 Sc Fv组(2.5μg/m L);HER2 Sc Fv组(2.5μg/m L);CD40×HER2Sc Db1组(2.5μg/m L);CD40×HER2 Sc Db2组(5μg/m L);曲妥珠单抗组(15μg/m L)。 构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型,依据给予的干预不同,将模型小鼠随机分为:NS组;CD40 Sc Fv组(150μg/kg);HER2 Sc Fv组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db1组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(300μg/kg);曲妥珠单抗组(1mg/kg)。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化,对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片,HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。结果固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第叁轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%,并筛选获取了8个潜在阳性克隆,梯度噬菌体ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明,8#克隆与CD40的亲和力最佳,其与BSA亲和力的比值>3,符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 Sc Fv的VH及VL片段,DNA电泳及测序结果表明CD40 Sc Fv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp,与预期大小相符,重迭PCR拼接获取的CD40×HER2 Sc Db基因序列长度为1464bp,与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果,蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带,其大小与预期相符,对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带,BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2Sc Db组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±3.2%92.3±2.8%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测Ag+CD40×HER2 Sc Db组DC细胞上清中的IL-12浓度为659.90±61.28 pg/m L,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与NS组及Ag组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Ag+CD40×HER2 Sc Db组T淋巴细胞对4T1细胞增殖的抑制率为75.65±2.53%,与Ag+TNF-α组相比,差异无统计学意义(P>0.05),与Ag组及NS组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db2组4T1肿瘤组织内IL-12及IFN-γ表达水平分别为448.85±51.10 pg/m L,273.44±44.60 pg/m L,与NS组及HER2 Sc Fv组相比,差异有统计学意义(P<0.05),与CD40 m Ab组相比,无统计学差异(P>0.05)。观察不同组小鼠4T1肿瘤体积的变化表明,CD40×HER2 Sc Db2组(1.5mg/kg)及CD40 m Ab(5mg/kg)均可显着抑制4T1肿瘤的体内增殖,二者的抑制效果无统计学差异(P>0.05)。免疫组化检测肿瘤组织Cleaved-Caspase-3的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db组4T1肿瘤细胞内Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。CCK8检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞增殖的抑制结果表明,CD40×HER2 Sc Db(5μg/m L)对T6-17的抑制率为86.89±6.35%,其与曲妥珠单抗(15μg/m L)的抑制率85.56±1.73%相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot检测不同干预组Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平,结果表明,CD40×HER2Sc Db、HER-2 Sc Fv及曲妥珠单抗均可抑制Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达,与NS组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠肿瘤组织HE染色结果表明,NS组细胞形态正常,细胞核完整,部分细胞可见核仁,细胞生长活跃,CD40×HER2 Sc Db和曲妥珠单抗组肿瘤组织细胞失去正常形态,核固缩核碎裂现象明显。结论通过对抗CD40噬菌体展示免疫文库的筛选,可成功获取抗CD40高亲和力单链抗体克隆。通过重迭PCR可成功获取CD40×HER2 Sc Db基因序列全长,通过IPTG诱导可成功于原核蛋白表达系统表达获取CD40×HER2 Sc Db蛋白,并通过蛋白复性获得功能性蛋白。CD40×HER2 Sc Db可通过促进DC细胞成熟,激活肿瘤特异性免疫,体外杀伤肿瘤,也可通过促进肿瘤特异性CTL在肿瘤组织巢集,通过激活肿瘤细胞内Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡,并通过上调组织内激活型免疫细胞因子激活肿瘤特异性免疫反应。CD40×HER2 Sc Db可通过与T6-17表面的HER2结合,抑制Akt、ERK1/2的磷酸化,抑制T6-17的体外增殖,同时也可在体内通过HER2靶向功能抑制T6-17细胞的增殖。(本文来源于《天津医科大学》期刊2017-05-01）
周新亮[7]（2017）在《CIK细胞和肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500共同介导抗p21ras单链抗体治疗肺癌的实验研究》一文中研究指出[目的]:肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,肺癌的治疗方法主要包括以下几种:外科手术、放疗、化疗、分子靶向治疗、生物治疗和中医中药治疗等。近年来,肿瘤靶向治疗在肺癌治疗中发挥越来越重要的作用,成为肺癌治疗的重要方法。Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路在肺癌的分化、增殖和死亡等过程中具有重要作用。而ras基因处于Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的中枢地位,被认为是Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路的上游开关,因此针对肺癌ras基因开发靶向药物已成为肺癌靶向治疗研究中的热点。我们实验室前期构建了肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500,KGHV500具有以下特点:①搭载了抗ras的单链抗体基因,能阻断ras信号通路,抑制ras基因高表达的恶性肿瘤增殖。②携带肿瘤特异性启动子hTERT和HRE,能在肿瘤细胞中复制而在正常细胞内不复制;③携带绿色荧光蛋白基因,便于观察病毒对肿瘤细胞的感染及其在肿瘤细胞内的增殖情况;④改造了纤毛蛋白基因,使之能够高效感染CIK细胞,利用CIK细胞作为体内载体,靶向肿瘤组织。前期实验证明KGHV500通过使用CIK细胞作为体内载体可以靶向肿瘤组织,有效抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长(未发表资料)。为了进一步确认KGHV500对其他肿瘤的靶向性与治疗效果,本课题使用人肺腺癌细胞株A549,通过体外实验研究KGHV500对A549细胞迁移、增殖和凋亡的影响,通过体内实验研究KGHV500对肺腺癌的靶向性与治疗效果,为肺癌的靶向治疗提供新的方法。[方法]:一.A549细胞ras基因状态及蛋白表达检测:1.提取A549细胞DNA,PCR扩增A549细胞ras基因12个外显子,测序检测A549细胞中ras基因状态。2.制作A549细胞爬片,免疫荧光检测ras蛋白在A549细胞中的表达量。3.制作A549细胞蜡块,检测A549细胞表面是否表达KGHV500的受体CD46,以确定KGHV500可以感染A549细胞。二.体外实验:1.重组腺病毒KGHV500扩增、纯化、TCID50测定病毒滴度,电镜观察KGHV500是否可以感染A549,KGHV500通过不同MOI值感染A549细胞以确定最佳感染MOI值。2.通过划痕、MTT和TUNEL实验检测KGHV500对A549细胞迁移、增殖和凋亡的影响。3.分离外周血中单个核细胞,诱导培养成CIK细胞并通过免疫组化鉴定表型,确定KGHV500感染CIK细胞的效率。叁.体内实验,1.用人肺腺癌细胞株A549建立裸鼠移植瘤模型。成瘤鼠分为5组,实验组尾静脉注射荷载KGHV500的CIK细胞,对照组有4组,分为单独注射KGHV500组、尾静脉注射的CIK细胞组、尾静脉注射荷载KGHV400的CIK细胞组和等量PBS组。2.游标卡尺每隔3天测量各组肿瘤体积的变化情况,观察KGHV500在体内对肺腺癌的治疗效果。3.分别在尾静脉注射后的第1天、第2天、第3天、第5天和第7天取实验鼠的肿瘤和主要脏器,免疫组化检测腺病毒的表达来研究KGHV500对肺腺癌裸鼠移植瘤的靶向性和安全性。4.分别在尾静脉注射后的第1天、第2天、第3天、第5天和第7天取实验鼠的肿瘤组织,免疫组化和WB检测单链抗体在肿瘤组织中的表达来研究单链抗体基因在肺腺癌裸鼠移植瘤中的持续表达情况。5.选取实验鼠的肿瘤组织,通过Tunel实验检测各组肿瘤组织的凋亡情况。[结果]:一.通过序列比对发现A549细胞为k-ras基因突变型,且高表达ras蛋白。A549细胞膜表面CD46的表达率接近100%,说明KGHV500可以高效感染A549细胞。二.在体外实验中,KGHV500纯化后测得滴度为5.0×109pfu/ml。在电镜图中,我们可以在A549细胞核里观察到大量病毒颗粒,说明显示KGHV500可以感染A549细胞。经测定,KGHV500对A549细胞的最佳MOI值为100。划痕实验中,相比第0天,实验组48小时总迁移率为22.07%±1.26,而对照组为44.50%±0.71,P值<0.01,说明KGHV500能够显着抑制A549细胞株的迁移。MTT实验中,实验组A549细胞感染KGHV500后,A549细胞的吸光度从第一天到第二天略有上升,其后一直下降,第五天为0.08 土0.01。而在不加KGHV500的对照组中A549细胞的吸光度从第一天开始一直上升,第五天为1.05±0.07,对照组相比实验组有显着差异(p<0.01),表明KGHV500对A549细胞具有杀伤力,可以显着抑制A549细胞的增殖。Tunel实验中,实验组细胞凋亡率为81.6±7.2,对照组细胞凋亡率为7.4±1.2(P<0.01),说明KGHV500可以显着促进A549细胞的凋亡。叁.体内实验:肺腺癌裸鼠移植瘤成瘤率为74%。游标卡尺每隔3天测量肿瘤体积,结果表明从KGHV500+CIK组、KGHV400+CIK组,CIK组、KGHV500组到PBS组,肿瘤的增长率依次增大,KGHV500+CIK组的肿瘤组织大小无明显变化,而PBS组肿瘤体积增长了 10多倍。说明KGHV500+CIK可以显着抑制肺腺癌裸鼠移植瘤的生长。免疫组化检测KGHV500+CIK对肺腺癌裸鼠的靶向性显示:KHJV500+CIK组中,KGHV500第一天就到达了肿瘤组织,随着时间的推移,表达量呈上升趋势。单独注射KGHV500组的肿瘤组织中也能检测到腺病毒的表达,但量少且无规律性。在其他脏器中(心,肝,肺,肾,胃,胰,大肠,小肠),KGHV500+CIK组1-7天都没有发现KGHV500的存在,而单独注射KGHV500组的心,肝,脾、肺,肾,胃,胰,大肠,小肠在1-7天均可以检测到腺病毒的存在。说明KGHV500以CIK细胞作为体内载体可以靶向肿瘤组织,安全性良好。4.免疫组化检测单链抗体在裸鼠肿瘤组织中的表达情况显示,KGHV500+CIK组1-7天均有单链抗体的表达,且随着时间的推移表达量上升,说明单链抗体基因随着腺病毒的复制而表达。而单独注射KGHV500组1-7天也能检测到单链抗体的表达,表达量先增加后减少,说明单链抗体基因能够随着腺病毒的复制而表达。WB检测单链抗体在裸鼠肿瘤组织中的表达情况显示,KGHV500+CIK组只有在肿瘤和脾脏中检测到单链抗体的表达,而KGHV500组在除了脑的其他组织中均可以检测到单链抗体,且单链抗体在KGHV500+CIK组肿瘤组织中的表达量大大高于KGHV500组。5.TUNEL实验显示,KGHV500+CIK组、KGHV400+CIK组、CIK组、KGHV500组和PBS组的凋亡率分别为96.9±23.4、80.3±16.48、37.3±12.3、11.5±1.2 和 1.3±0.3,KGHV500+CIK 组凋亡细胞数明显多于单独注射PBS的对照组(p<0.01),说明KGHV500+CIK可以促进肺腺癌的凋亡。[结论]:综上所述,通过体外实验,我们证明了肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500可以抑制肺腺癌A549细胞株的增殖和迁移,促进A549的凋亡。体内实验证明了KGHV500可以利用CIK细胞靶向肿瘤组织,抑制肿瘤的生长,具有安全性和治疗效果。本课题同时将肿瘤特异性增殖腺病毒、CIK细胞和p21Ras单链抗体各自的抗肿瘤活性协同起来,提高了对裸鼠肺腺癌移植瘤的抑制效果,为ras基因驱动肿瘤的靶向治疗奠定了实验基础。(本文来源于《昆明理工大学》期刊2017-05-01）
周寒静[8]（2017）在《HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对HEP2细胞放射增敏的实验研究》一文中研究指出目的利用噬菌体肽库技术,制备人源化HIF1α喉癌单链抗体,检测抗体性能,并研究其对HEP2细胞放射敏感性的影响,为喉癌靶向治疗和放射增敏研究提供实验室数据。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RT-PCR和重迭延伸PCR(SOE-PCR)扩增得到可变区基因片段。将扩增片段重组到噬菌体载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库。先后以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行免疫亲和富集,制备HEP2细胞特异性HIF1α单链抗体scFv。SDS-PAGE电泳检测单链抗体scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK8检测scFv联合6MV-X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放射线辐照存活曲线。结果成功制备HIF1α人喉癌单链抗体scFv;SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且分子量约为34 kDa;Western blot实验表明其能下调HEP2细胞中HIF1α蛋白的表达;ELISA实验检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率为79%;细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合。CCK8检测结果显示scFv联合6MV-X线照射后,HEP2细胞存活率较单纯X线照射组明显降低(P<0.05);克隆形成实验结果显示scFv干预后,HEP2细胞对放射辐照的增敏比SER为1.89。结论成功构建了人源喉癌噬菌体单链抗体库,并筛选出能与HIF1α蛋白特异性结合的单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放射线的敏感性,为喉癌的靶向治疗和放射增敏研究提供了新的思路。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2017-05-01）
白双[9]（2017）在《CIK细胞和Ad5/F35肿瘤特异性增殖腺病毒共同介导抗p21Ras单链抗体治疗结直肠癌的实验研究》一文中研究指出[目的]结直肠癌是全球范围内最常见的恶性消化道肿瘤之一。目前的治疗措施是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗,对于早期的结直肠癌有较好的治疗效果,但中晚期结直肠癌的复发率和死亡率仍居高不下,迫切需要研究建立疗效好、特异性高的治疗技术。靶向治疗是近些年来发展较快的肿瘤治疗技术,也是今后的重要发展方向。本实验室前期在国家自然科学基金面上项目和云南省科技攻关项目的支持下,构建了抗p21Ras细胞内抗体,旨在阻断Ras信号传导通路,靶向治疗Ras基因高表达的肿瘤。研究显示,该抗体对高表达p21Ras的人肿瘤细胞系及其裸鼠移植瘤有明显生长抑制作用。但由于该抗体使用的是复制缺陷型腺病毒,没有自我增殖能力和肿瘤靶向性。因此,本实验室对野生型Ad5腺病毒载体进行基因工程改造,用肿瘤双特异性启动子hTERT和HRE替换腺病毒复制必需区E1A区和E1B区启动子,使其赋予肿瘤细胞特异性复制能力;用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒的纤毛蛋白,使其可感染CIK细胞,具有肿瘤靶向性,获得具有靶向性的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400;最后在KGHV400中插入p21Ras单链抗体基因即获得本研究所使用的既具有靶向性又携带抗p21Ras单链抗体治疗基因的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500。前期的实验研究显示,该病毒在乳腺癌的治疗中具有一定的疗效。本次研究的主要目的是:1、构建含抗p21ras单链抗体治疗基因的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500;2、通过体外实验,研究KGHV500对人结直肠癌细胞SW480的影响;3、通过体内实验,研究KGHV500联合CIK细胞共同介导抗p21Ras单链抗体治疗结直肠癌的效果和安全性。最终实现抗p21ras单链抗体在结直肠癌细胞中的持续、安全表达,为结直肠癌的靶向治疗提供新方法。[方法]一、重组腺病毒KGHV500的包装、扩增和纯化:将本实验室前期构建的腺病毒穿梭质粒pXC1-hTERT-ScFv-HRE与骨架质粒pBHGE3-F5/35在低代次HEK293细胞内进行同源重组,包装成为携带有抗p21Ras单链抗体基因的重组腺病毒KGHV500。体外大量扩增该重组腺病毒,双重氯化铯密度梯度离心进行腺病毒的纯化,TCID50法测定该病毒的滴度。二、体外实验:1、KGHV500感染SW480细胞:首先检测结直肠癌SW480细胞表面是否表达KGHV500的受体CD46,以确定KGHV500可以感染SW480细胞。通过透射电镜观察,检测KGHV500可否成功感染上SW480细胞,之后用不同MOI值的重组腺病毒感染高表达p21Ras的结直肠癌细胞SW480,确定KGHV500感染SW480的最佳MOI值。2、检测KGHV500对肿瘤细胞SW480的影响:通过MTT实验、Transwell侵袭小室实验、细胞划痕实验以及TUNEL凋亡检测等方法分别对感染KGHV500后的肿瘤细胞杀伤、侵袭、迁移和凋亡的变化情况进行检测。3、CIK细胞装载KGHV500:分离人外周血单个核细胞,体外经细胞因子诱导成为CIK细胞,与携带治疗基因的的重组腺病毒KGHV500共培养,并进行感染效率的测定。叁、体内实验:用人结肠癌细胞系SW480建立结直肠癌裸鼠移植瘤模型,分为5组:尾静脉注射搭载KGHV500的CIK细胞组、尾静脉注射搭载KGHV400病毒(无抗p21ras单链抗体基因)的CIK细胞组、尾静脉注射CIK细胞组、尾静脉注射KGHV500组和尾静脉注射PBS组。体内实验内容主要分为两个方面:1、每隔3天测量荷瘤鼠肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,评价携带p21ras单链抗体基因的KGHV500联合CIK细胞在体内对结直肠癌的治疗效果;2、治疗第1d,2d,3d,5d和7d的颈椎脱臼处死裸鼠,取肿瘤组织和主要脏器进行免疫组织化学检测,并通过Hscore评分和阳性细胞百分数评估腺病毒和单链抗体在肿瘤组织的表达状况,此外,还将通过蛋白免疫印迹实验来研究KGHV500联合CIK细胞在体内的治疗安全性。[结果]体外培养扩增重组腺病毒KGHV500,经过双重氯化铯密度梯度离心纯化,最终的病毒滴度为5.0×109pfu/ml。体外实验结果显示,结直肠癌细胞SW480表面有大量CD46蛋白表达(KGHV500受体)。透射电镜观察结果显示,KGHV500可成功感染SW480细胞,并且经测定,KGHV500感染SW480细胞的最佳MOI值为100。细胞划痕实验显示,当KGHV500感染结直肠癌SW480细胞之后,24h时细胞划痕迁移百分比为(1.89±3.41)%,48h时为(8.71±4.04)%。对照组24h时细胞划痕迁移百分比为(10.52±1.40)%,48h时为(22.58±4.21)%。实验组与对照组相比差异显着,具有统计学意义(P<0.05),表明KGHV500可有效抑制SW480细胞的迁移能力。Transwell侵袭小室实验显示,实验组重组腺病毒KGHV500感染SW480细胞之后,转移到微孔下层的细胞数目比对照组少很多,实验组细胞侵袭个数为27±8.73,而对照组为151.57±29.90,两组相比具有显着的统计学意义(P<0.01),表明重组腺病毒KGHV500可有效抑制结直肠癌细胞的侵袭能力。MTT实验显示,当结直肠癌细胞SW480感染上KGHV500之后,在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为1.64±0.13,1.45±0.15,1.11±0.23,0.90±0.12和0.49±0.12。对照组为1.68±0.13,1.80±0.08,1.71±0.14,1.95±0.13和1.91 ±0.18。实验组随着时间的推移吸光度越来越低,而对照组肿瘤细胞的吸光度一开始有上升的趋势,后来逐渐趋于平稳。结果表明KGHV500对SW480细胞具有一定的杀伤能力。TUNEL凋亡检测实验结果显示,实验组病毒感染SW480细胞之后,细胞凋亡个数明显增多,凋亡百分比为(76.34士10.05)%,对照组没有感染病毒,几乎没有凋亡细胞,凋亡百分比为(96.68±1.25)%。实验组与对照组相比差异显着,具有统计学意义(P<0.01),证明该病毒可以明显促进结直肠癌SW480细胞的凋亡。此外,通过分离人外周血单个核细胞,体外经细胞因子诱导成为CIK细胞。经过检测发现CIK细胞膜表面CD46较为丰富,阳性率几乎达到100%。实现CIK细胞成功装载携带治疗基因的的重组腺病毒KGHV500,并发现KGHV500感染CIK细胞的效率为63.15%。体内实验显示,实验组尾静脉注射装载KGHV500的CIK细胞组经过治疗后肿瘤组织大小趋于平稳,增长不明显。而对照组肿瘤组织生长较快,其中PBS组的肿瘤体积生长最快,其次是尾静脉单独注射KGHV500组、单独的CIK细胞组和KGHV400+CIK细胞组。实验组与对照组相比,尾静脉注射装载KGHV500的CIK细胞使得肿瘤体积最小,增长最为不明显,表明重组腺病毒KGHV500和CIK细胞联合有明显地抑制肿瘤生长的作用。肿瘤组织TUNEL凋亡检测显示,实验组尾静脉注射KGHV500+CIK细胞组,细胞凋亡百分比明显多于其他组,为(75±16.68)%。对照组尾静脉注射KGHV400+CIK细胞组、单独的CIK细胞组和单独注射KGHV500组凋亡百分比依次降低,分别为(56± 10.52)%、(28±7.65)%和(23±8.76)%。空白组尾静脉注射PBS的裸鼠肿瘤组织中几乎没有凋亡细胞,细胞凋亡百分比为(5±3.36)%。由此证明携带抗p21Ras单链抗体的重组腺病毒KGHV500联合CIK细胞可以明显促进结直肠癌SW480细胞的凋亡。安全性检测结果显示实验组尾静脉注射携带KGHV500的CIK细胞的裸鼠,肿瘤部位检测到了大量腺病毒的表达,实验组肿瘤组织Hscore评分在第1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 62.72±6.78,130.25士22.58,179.53±42.58,200.07±48.63,250.67±52.68。阳性百分数分别为(15.52±6.59)%,(32.56±12.19)%,(42.53± 18.63)%,(60.07± 12.54)%,(78.67± 18.53)%。随着治疗时间的增加,腺病毒的表达量越来越高。另外,脾脏中发现少量腺病毒的存在,没有在其它脏器中检测到腺病毒的表达。而对照组尾静脉只注射KGHV500的裸鼠,肿瘤组织 Hscore 评分在第 1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 18.2±8.59,31.62± 15.86,65.73±28.59,100.52±32.86,180.65±23.58,阳性细胞百分比分别为(5.78±7.52)%,(12.57±8.46)%,(25.73±13.59)%,(39.52±14.56)%,(45.65±17.82)%,腺病毒的表达也呈现逐渐上升的趋势,但相对较弱。此外,在其心、肝、脾和肺等组织中均检测到了腺病毒的表达。由此表明,CIK细胞携带KGHV500在体内运输的安全性良好。此外,免疫组化结果显示,实验组肿瘤组织单链抗体的表达Hscore评分在在第1d、2d、3d、5d和7d时分别为31.47±8.78,100.84±12.60,130.47±42.54,177.47±35.48,220.59±46.28。阳性百分数分别为(16.48± 11.59)%,(42.54± 18.24)%,(45.67±8.15)%,(60.65± 12.12)%,(78.05±20.54)%。随着治疗时间的增加,单链抗体的表达量越来越高。而对照组尾静脉只注射KGHV500的裸鼠,肿瘤组织Hscore评分在第1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 12.24±2.59,28.44±14.60,50.95±11.92,83.25±32.20,130.64±40.23。阳性细胞百分比分别为(4.28±3.12)%,(12.54±8.50)%,(18.83±13.25)%,23.64± 15.21)%,(40.65± 19.20)%,单链抗体的表达也呈现逐渐上升的趋势,但相对较弱。Western blot的结果显示,实验组只有肿瘤部位和脾脏中存在单链抗体的表达,其余组织全部为阴性结果。而对照组尾静脉注射单独的KGHV500组的裸鼠,除了脑组织以外,均检测到了单链抗体的表达。[结论]1、通过构建重组腺病毒KGHV500,将其成功感染CIK细胞,实现了CIK细胞作为载体靶向运输携带抗p21ras单链抗体基因的KGHV500肿瘤特异性增殖腺病毒;2、通过细胞划痕、Transwell侵袭、MTT和TUNEL凋亡等体外实验,证实了重组腺病毒KGHV500可有效抑制肿瘤细胞SW480的生长、侵袭和迁移,促进肿瘤细胞凋亡;3、通过建立裸鼠结直肠癌移植瘤模型,体内有效性和安全性检测,证实了重组腺病毒KGHV500联合CIK细胞可以有效抑制肿瘤组织的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,并且治疗的安全性良好。本次研究通过靶向治疗、免疫治疗与基因治疗相结合的肿瘤治疗策略,为结直肠癌的治疗提供新方法。(本文来源于《昆明理工大学》期刊2017-04-01）
邵峦峦,徐超超,纪洪帅,毛伟平,王盈盈[10]（2016）在《抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定》一文中研究指出目的构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(sc Fv)库,并筛选出特异性高的抗体。方法从A549细胞的c DNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体p ET-28 a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠。从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重迭延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)、VH接头(VH-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物VH/Vκ。VH/Vκ与p UM19-T载体连接并转化至E.coli DH5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序。使用TNTT7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定。结果经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(VH/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp。经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力。结论成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示sc Fv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标sc Fv。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2016年09期）
双特异性单链抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的构建一种可以同时靶向抑制人类表皮生长因子受体2(HER2)和表皮生长因子受体(EGFR)分子的双特异性单链抗体,从而降低单一通路抑制而造成的耐药性,增强抗肿瘤效果。方法采用Overlap PCR法通过柔性肽(G4S)将曲妥珠单抗的可变区与西妥昔单抗连接,构建工程载体,并通过大肠埃希菌系统进行表达纯化,获得同时靶向HER2和EGFR的双特异性单链抗体;流式细胞术检测双特异性单链抗体对EGFR和HER2过表达的乳腺癌细胞BT474的结合能力;噻唑蓝(MTT)法检测单链抗体对BT474乳腺癌细胞的增殖抑制;建立BT474荷瘤小鼠动物模型,检测双特异性单链抗体的体内抗肿瘤活性;使用免疫组织化学检测单链抗体是否可以抑制表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化,并对肿瘤细胞增殖指标Ki-67进行检测。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达及镍柱纯化,成功获得双特异性单链抗体,经蛋白印迹法鉴定验证了双特异性单链抗体表达及装配正确。流式细胞术检测双特异性单链抗体与乳腺癌细胞BT474的结合率为53.3%,与曲妥珠单抗(69.0%)、西妥昔单抗结合率(60.3%)相当。MTT法中,与磷酸盐缓冲液(PBS)组相比,曲妥珠单抗组、西妥昔单抗组与双特异性单链抗体组对乳腺癌细胞BT474均有抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性。在蛋白水平为400nmol/L时,双特异性单链抗体组抑制率[(65.19±4.21)%]强于曲妥珠单抗组[(40.67±1.78)%]与西妥昔单抗组[(32.20±2.94)%]。通过裸鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤实验,双特异性单链抗体组在体内仍能发挥较强的抗肿瘤效果,高剂量组肿瘤抑制率可以达到(74.32±4.37)%,明显优于曲妥珠单抗组(44.83±6.02)%与西妥昔单抗组(39.44±8.75)%。通过免疫组织化学对给药后的肿瘤组织进行分析,与PBS组相比,双特异性单链抗组可以明显抑制BT474皮下移植瘤组织中p-EGFR、Ki-67的表达量。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了双特异性单链抗体。双特异性单链抗体具有良好的体内外抗肿瘤活性,有效抑制乳腺癌细胞BT474的体内外增殖,并通过免疫组织化学分析到双特异性单链抗体可以抑制EGFR的磷酸化并抑制肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤治疗提供了新的思路,有潜在的临床应用前景。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双特异性单链抗体论文参考文献
[1].祁麟,熊梦裳,林芳珍,卢杨,熊冬生.人AFP启动子操控的跨膜型抗CD3单链抗体构建及其在AFP阳性肝癌细胞中特异性表达[J].山东医药.2019
[2].郭艳,张长庆.靶向HER2/EGFR分子双特异性单链抗体的构建及其体内外抗乳腺癌的研究[J].检验医学与临床.2018
[3].杨妹.CIK细胞和肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500共同介导抗p21Ras单链抗体治疗脑胶质瘤的实验研究[D].昆明医科大学.2018
[4].周冲,于峰,韩邦兴,周阳,刘黎琼.双特异性单链抗体BiTE的研究进展[J].生物学杂志.2018
[5].王慧敏.甲基对硫磷特异性单克隆抗体和单链抗体的制备及应用[D].山东农业大学.2017
[6].陆礼.抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究[D].天津医科大学.2017
[7].周新亮.CIK细胞和肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500共同介导抗p21ras单链抗体治疗肺癌的实验研究[D].昆明理工大学.2017
[8].周寒静.HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对HEP2细胞放射增敏的实验研究[D].重庆医科大学.2017
[9].白双.CIK细胞和Ad5/F35肿瘤特异性增殖腺病毒共同介导抗p21Ras单链抗体治疗结直肠癌的实验研究[D].昆明理工大学.2017
[10].邵峦峦,徐超超,纪洪帅,毛伟平,王盈盈.抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志.2016
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