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安琪酵母乙醛脱氢酶的酶学性质研究

2020-12-08阅读(207)

安琪酵母乙醛脱氢酶的酶学性质研究

论文摘要

乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）是人体中分解乙醛的酶,能催化许多脂肪族和芳香族的醛类,反应生成相应的酸,以此降低体内醛类物质在人体内的毒性。目前,ALDH主要是从动植物细胞中分离获取,高成本、低产量,ALDH很难大规模生产。由于自然界,微生物具有容易培养、周期快等特点,有望成为获取ALDH的新型原料。（1）在加入1μL1mg/mL纤维素酶的前提下,采用盐碱混合破壁法提取安琪酵母ALDH,通过单因素实验,发现当破壁温度为70℃,破壁时间为4.5 h,料液比（酵母浓度）为20%,NaCl/NaOH为1:3时,酵母ALDH的破壁率较高,所得酶活也较高,为2.85 U/mL。在单因素实验的基础上,进行了响应面分析,得到最佳提取工艺条件:破壁温度74℃,破壁时间5 h,料液比22%,NaCl/NaOH=1:3,酵母ALDH的破壁率为96.20%,酶活为2.99 U/mL。由P值得出影响酵母ALDH破壁率与酶活显著性程度为浓度>时间>温度>NaCl/NaOH。（2）ALDH经过初级纯化后,在硫酸铵饱和度75%时,酶活最高,在此基础上采用双水相方法对ALDH进行细纯化,通过单因素实验,发现用相对分子质量为2000的聚乙二醇（PEG）,pH为8,NaCl浓度为1%,NAD+浓度为0.15 mol/L时,酵母ALDH的纯化倍数和回收率分别达到3.1和43%。在单因素实验的基础上,进行正交实验,得到双水相方法萃取的最优组合:采用PEG2000,pH为8,NaCl浓度1%,NAD+浓度0.15mol/L。极差分析结果表明,影响ALDH纯化倍数和回收率的显著性程度为PEG2000>pH>NAD+>NaCl。（3）在EMBL数据库对酵母的ALDH进行搜索,结果显示该酶由四个亚基组成（2个α由500个碱基组成。2个β由501个碱基组成）,其活性中心在α亚基上,活性中心（Cys-302）的附近序列（Gln-Gly-Gln-Cys）高度保守;进一步用SDS-PAGE对纯化到的酵母ALDH进行分子量测定,电泳条带显示为两条,分子量分别为54 kD和49 kD,结合EMBL数据库搜索结果,计算得出ALDH的分子量为206 kD.（4）对影响酵母ALDH活性的因素进行了研究。发现在25℃,pH7的条件下,酶活最高;Na+、Ca2+和硫脲对该酶具有抑制作用,其中,硫脲的浓度与抑制效果呈正相关。Zn2+浓度在低于25 mmol/L的情况下,对酶起微弱的激活,在25 mmol/L125 mmol/L的情况下,对酶属于抑制作用;K+、Mg2+、二硫苏糖醇（DTT）和乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶具有激活作用,其中,K+和Mg2+对该酶活性的提高较弱;DTT和EDTA能够显著提高该酶的活性,其中DTT浓度为75 mmol/L时,能将ALDH酶的活力提高。而抗坏血酸则对ALDH的活性基本没有影响。（5）由于酵母ALDH分子量较大,不利于人体的吸收,需要对其进行有限水解修饰。首先在NCBI数据库下载酵母ALDH的氨基酸序列,通过ExPasy软件进行了Peptide Cutter分析,发现该酶的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lyr）位点相对较多,结合其活性中心为（Cys-302）,其附近的高度保守序列为Gln-Gly-Gln-Cys,因而选用胰蛋白酶进行有限水解修饰,其水解位点较多,酵母ALDH在α肽链能被水解成54段肽链,且不会对活性中心造成破坏。然后用单因素实验探讨了水解条件,发现温度为39℃,反应时间为7 h,pH为7,胰蛋白酶浓度为30 mg/mL时,水解效果较好,此时ALDH酶活为0.89 U/mL。进一步用正交分析得出因素显著性顺序为胰蛋白酶浓度>pH>温度>时间。（6）为了使酵母ALDH的酶活更加稳定并广泛应用,对其进行了海藻酸钠-戊二醛-活性炭固定化实验,单因素实验研究发现,海藻酸钠浓度为3%,戌二醛1%,交联2 h,固定2.5 h,固定化效果较好,进一步进行了响应面分析,得出最佳工艺条件为海藻酸钠3%,戊二醛浓度1%,交联时间2 h,固定化时间2.4 h。此时酵母ALDH的活性为3.34U/mL。由P值可以得出因素显著性顺序为:固定化时间>海藻酸钠浓度>交联时间>戊二醛浓度。固定后的酵母ALDH在胰蛋白酶的作用下,可以保持酶活,在弱碱性环境中酶活几乎不受影响。综上所述,通过破壁、纯化鉴定、酶活性质、水解修饰和固定化研究,探索安琪酵母ALDH的酶学性质,为ALDH的理论和应用研究提供依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 引言
  •   1.2 乙醛脱氢酶的种类
  •   1.3 乙醛脱氢酶的结构
  •   1.4 乙醛脱氢酶的应用
  •     1.4.1 在解酒方面应用
  •     1.4.2 在医学方面的应用
  •     1.4.3 在食品方面的研究
  •   1.5 本论文的立题依据和主要研究内容
  •     1.5.1 立题依据
  •     1.5.2 主要研究内容
  • 2 安琪酵母破壁提取乙醛脱氢酶的工艺研究
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与仪器
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 实验仪器
  •     2.2.3 实验试剂
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 酶活测定体系
  •     2.3.2 实验过程
  •     2.3.3 单因素实验
  •     2.3.4 响应曲面实验设计
  •   2.4 结果与分析
  •     2.4.1 单因素分析
  •     2.4.2 响应曲面法
  •   2.5 本章结论
  • 3 安琪酵母乙醛脱氢酶的双水相萃取
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与仪器
  •     3.2.1 实验仪器
  •     3.2.2 实验试剂
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 蛋白质标准曲线的绘制
  •     3.3.2 ALDH的初级纯化
  •     3.3.3 双水相体系的构建
  •     3.3.4 实验过程
  •     3.3.5 单因素实验
  •     3.3.6 正交验证实验
  •     3.3.7 SDS-PAGE鉴定
  •   3.4 结果与分析
  •     3.4.1 蛋白质标准曲线的绘制
  •     3.4.2 初级纯化结果
  •     3.4.3 双水相体系的构建
  •     3.4.4 单因素实验
  •     3.4.5 萃取的正交实验分析
  •     3.4.6 SDS-PAGE结果
  •   3.5 本章结论
  • 4 安琪酵母乙醛脱氢酶的激活和抑制
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与仪器
  •     4.2.1 实验仪器
  •     4.2.2 实验试剂
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 单因素实验
  •   4.4 结果与分析
  •     4.4.1 单因素实验
  •   4.5 本章结论
  • 5 安琪酵母乙醛脱氢酶的有限水解
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与仪器
  •     5.2.1 实验仪器
  •     5.2.2 实验试剂
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 实验过程
  •     5.3.2 单因素实验
  •     5.3.3 正交实验
  •     5.3.4 ALDH水解稳定性的测定
  •     5.3.5 ExPasy软件分析
  •   5.4 结果与分析
  •     5.4.1 单因素实验
  •     5.4.2 胰蛋白酶水解ALDH的正交实验分析
  •     5.4.3 水解稳定性结果
  •     5.4.4 ExPasy软件分析结果
  •   5.5 本章结论
  • 6 安琪酵母乙醛脱氢酶的固定化
  •   6.1 引言
  •   6.2 材料与仪器
  •     6.2.1 实验仪器
  •     6.2.2 实验试剂
  •   6.3 实验方法
  •     6.3.1 实验过程
  •     6.3.2 单因素实验
  •     6.3.3 pH和胰蛋白酶对固定化和游离酶的影响
  •     6.3.4 响应曲面实验设计
  •   6.4 结果与分析
  •     6.4.1 单因素实验
  •     6.4.2 pH和胰蛋白酶对固定化和游离酶的影响
  •     6.4.3 响应曲面法
  •   6.5 本章结论
  • 7 结论与讨论
  •   7.1 结论
  •   7.2 讨论
  • 参考文献
  • 在学期间的研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 闫晓鹃

    导师: 王文科

    关键词: 安琪,酶学性质,提取工艺,固定化,水解修饰

    来源: 山西师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 山西师范大学

    分类号: Q55

    DOI: 10.27287/d.cnki.gsxsu.2019.000470

    总页数: 73

    文件大小: 9398K

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