朱健生[1]2003年在《弓形虫微线体蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定》文中指出目的：从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因，亚克隆至真核表达载体，利用所得的重组蛋白，为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法：提取弓形虫速殖子总RNA，设计并合成引物，RT-PCR扩增TgMIC10编码基因，通过与线性克隆载体pGEM-T连接，经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后，将目的基因亚克隆入双表达载体pBK-CMV，将获得的pBK-CMV-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E.coli BL21，IPTG诱导表达，Western blot鉴定。结果：PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断，将重组质粒pGEM-T-TgMIC10、pBK-CMV-TgMIC10分别作EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切，均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断，对插入片断的测序结果表明，TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF)，编码198个氨基酸，理论分子量23kDa，与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫TgMIC10基因具有高度的同源性(99.5％)。表明TgMIC10基因的克隆和亚克隆均获成功，用IPTG诱导带有重组质粒pBK-CMV-TgMIC10的大肠杆菌，产物行SDS-PAGE，可得到一约21kDa融合蛋白，Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。
黄新明, 汪学龙, 沈继龙[2]2006年在《弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定》文中指出目的克隆、表达及鉴定弓形虫(RH株)微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因,为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,与克隆载体pGEM-T连接,经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后,亚克隆入表达载体pBK-CMV,IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21,Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,表明Tg-MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功,用IPTG诱导带有重组质粒pBK-TgMIC10的大肠杆菌,产物行SDS-PAGE,可得到一约21kDa融合蛋白,Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。
张燕丽[3]2009年在《弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及表达》文中研究指明弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可感染包括人在内的所有哺乳动物。弓形虫病可导致严重的公共卫生问题和广泛的经济损失。弓形虫微线体蛋白3(Microneme protein 3, MIC3)是一种分泌型黏附素,黏附在宿主细胞和寄生虫的表面,在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期均能表达。具有作为诊断和免疫的双重潜在价值。根据已发表的弓形虫RH株MIC3的基因序列设计引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增MIC3基因,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液及上清样品中各有一条约39.2 ku的条带,可被山羊抗弓形虫高免血清所识别,大小与预测值相符。表明真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间。免疫组小鼠血清特异性抗体较对照组差异极显着(P<0.01);攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长。表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用。本研究为弓形虫病诊断和疫苗研制提供了候选抗原。
王海礁[4]2011年在《双抗体夹心ELISA法检测弓形虫循环抗原的方法建立》文中研究指明弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,可以感染多种哺乳动物。人类感染主要通过未煮熟的或生的含有速殖子或缓殖子的肉(如猪肉,羊肉),或者通过食物、水,以及未洗的由猫排泄的包囊污染的蔬菜。怀孕前妇女感染弓形虫通常不会遗传给胎儿;然而,如果感染发生在怀孕期间,病原体可传播给胎儿。在胎儿和新生儿中弓形虫病以各种不同形式出现,例如脑积水,脉络膜视网膜炎,颅内钙化,肝脾肿大,血小板减少,头小畸形,抽搐,发热等。然而,大多数新生儿的感染在出生时是没有症状的。先天性弓形虫感染的风险在早期妊娠要比晚期妊娠低,但先天感染的严重性更高,在怀孕期间获得的感染对胎儿会产生严重的后果。因此,弓形虫病是一个主要的公共健康问题。MIC10属于微线体蛋白家族并且由弓形虫速殖子微线体细胞器分泌。成熟的MIC10,其作用未知,是一18KDa蛋白,在速殖子要比缓殖子优先表达并且由虫体优先释放。与其他微线体蛋白不同,MIC10缺乏跨膜域,可以绑定宿主细胞受体,因此MIC10能够从组织中的感染部位扩散并且很容易成为循环抗原。本研究经过体外培养弓形虫得到弓形虫虫体后,提取弓形虫DNA。将弓形虫DNA作为模板,进行PCR扩增,得到MIC10A,MIC10B和MIC10C叁段序列。经过克隆、表达、纯化,得到重组蛋白MIC10A-His、MIC10B-His和MIC10C-His。利用重组蛋白MIC10A-His和MIC10B-His免疫新西兰大耳兔,制备多克隆抗体。通过常规的纯化方法,即亲和层析法纯化抗血清,得到多克隆抗体。将兔抗MIC10A作为包被抗体,生物素标记的兔抗MIC10B作为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法检测弓形虫循环抗原MIC10C,初步得到了具有一定特异性和敏感性的检测方法。
郑斌, 詹希美[5]2005年在《弓形虫微线体蛋白的研究进展》文中进行了进一步梳理弓形虫入侵宿主细胞是多步骤的过程。首先是虫体识别、黏附宿主细胞,然后虫体穿透入细胞完成入侵过程。当虫体与细胞接触时,微线体蛋白释放到虫体外,一部分微线体蛋白具有与真核细胞黏附分子相似的结构域———黏附区域,通过不同的黏附区域,微线体蛋白发挥其识别、黏附宿主细胞的作用;另一部分微线体蛋白不含黏附区域,但在虫体不同阶段表达量存在差异,可作为诊断抗原来鉴定急性和隐性弓形虫病。该文对已发现的微线体蛋白的基因序列、蛋白结构及特性作一综述。
张松涛, 汪学龙, 沈继龙[6]2006年在《弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析》文中研究说明目的从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因并进行克隆,为利用其表达的重组蛋白建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实。结果PCR法扩增出了一个大小约597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-TgMIC10作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF),编码198个氨基酸,理论分子量23kDa,与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫Tg-MIC10基因具有高度的同源性(99.5%)。结论本实验成功地克隆了TgMIC10编码基因,为进一步研究提供了条件。
赵东岳[7]2013年在《弓形虫B1等基因Real-time PCR与截短SAG2基因克隆、表达及ELISA建立》文中研究表明选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作real-time PC R检测靶基因,建立检测弓形虫的叁重SYBRGreen I实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品；将构建3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行叁重SYBRGreenI实时荧光定量PCR。529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为86.5±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃。构建的叁重SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2℃、78.9℃和83.3℃,阴性对照无扩增曲线。敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为173copies/μL、 123copies/μL、和135copies/μL; Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.3%. ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P<0.01)。建立弓形虫叁重SYBRGreenI荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性,可为临床弓形虫的诊断提供科学依据。克隆RH株弓形虫截短的表面抗原SAG2基因,并在大肠杆菌内进行高效表达及纯化可溶性GST-SAG2t用于制备检测猪血中抗弓形虫抗体的ELISA试剂盒。PCR扩增弓形虫RH株基因组中长度为438bp的去掉信号肽和C-末端的SAG2基因,亚克隆至原核表达载体PGEX-4T-3后转化到大肠杆菌DH5a内表达,并对表达条件进行优化,Western-blotting和ELISA分析纯化蛋白的免疫原性。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明表达GST-SAG2t蛋白分子量在41Ku左右并且具有免疫原性。在IPTG终浓度为0.5mM、诱导时间4h、诱导温度25℃的条件下,每升培养菌液可纯化出40mg的可溶性GST-SAG2t蛋白。ELISA反应条件优化的最佳抗原包被浓度2.0μg/mL,最佳阴阳性血清稀释比例为1：100。根据已经建立的rELISA方法与反应条件,确定阴阳性临界值为0.1780。交叉试验表明ELISA法具有良好的特异性。rELISA方法批内、批间OD值的变异系数在1%-9%。用本方法和试剂盒共同检测90份猪血清,阴阳性符合率皆为97.14%,截短的SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫原性,并建立了一种快速、准确的ELISA检测方法。
参考文献：
[1]. 弓形虫微线体蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定[D]. 朱健生. 安徽医科大学. 2003
[2]. 弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定[J]. 黄新明, 汪学龙, 沈继龙. 中国人兽共患病学报. 2006
[3]. 弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及表达[D]. 张燕丽. 甘肃农业大学. 2009
[4]. 双抗体夹心ELISA法检测弓形虫循环抗原的方法建立[D]. 王海礁. 吉林大学. 2011
[5]. 弓形虫微线体蛋白的研究进展[J]. 郑斌, 詹希美. 国外医学(寄生虫病分册). 2005
[6]. 弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析[J]. 张松涛, 汪学龙, 沈继龙. 热带病与寄生虫学. 2006
[7]. 弓形虫B1等基因Real-time PCR与截短SAG2基因克隆、表达及ELISA建立[D]. 赵东岳. 福建农林大学. 2013
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