论文摘要
口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病。机体的天然免疫反应和接种疫苗后产生的适应性免疫应答是抵抗病原菌感染的重要防线。然而,FMDV变异快,血清型众多,且各血清型之间缺乏交叉保护,给FMD的防控增加了难度。因此,天然免疫应答在抵抗FMDV感染过程中至关重要。FMDV在长期增殖过程中已经进化多种策略抑制宿主的天然免疫应答,促进自身复制。例如,FMDV可通过多种途径拮抗TLRs和RLRs受体介导的天然免疫信号通路。NOD2信号通路是2009年发现的在抗病毒感染中发挥重要作用的天然免疫路径,NOD2蛋白及其下游RIP2蛋白是该通路中独特的分子,本实验室前期研究揭示了FMDV抑制NOD2信号通路的分子机制,然而RIP2在FMDV感染过程中发挥的作用仍不清楚。因此,本研究主要以FMDV与RIP2调控的天然免疫信号通路为切入点,探讨FMDV拮抗RIP2抗病毒作用的机制。具体内容如下:（1）利用荧光素酶报告系统证实RIP2可影响FMDV诱导的IFN-β和NF-?B信号通路。下调RIP2蛋白表达水平后,FMDV诱导的IRF3和P65的磷酸化及下游抗病毒分子IFN-β、ISG15、IL1β和CCL3L1的mRNA表达水平均明显降低。（2）在PK15细胞中过表达不同浓度的RIP2质粒或利用siRNA下调RIP2蛋白表达水平后,接种FMDV,检测FMDV的RNA水平、VP1蛋白及病毒滴度,结果显示RIP2蛋白具有抑制FMDV复制的功能。（3）在PK15细胞中感染FMDV,检测RIP2的蛋白和mRNA水平的变化,结果表明FMDV感染降低了RIP2的蛋白表达水平,但对其mRNA水平的表达是上调的。另外,FMDV感染也降低了RIP和RIP3的蛋白表达。（4）将FMDV所有蛋白的真核表达载体质粒转染入PK15细胞,筛选抑制RIP2蛋白表达水平的病毒蛋白,结果显示2B、2C、Lpro和3Cpro蛋白具有抑制RIP2蛋白表达水平的功能,且呈现剂量依赖性;深入研究发现2B、2C、Lpro和3Cpro对RIP2蛋白表达水平的抑制不依赖于溶酶体、蛋白酶体和caspase途径。随后在PK15细胞中过表达2B、2C、Lpro和3Cpro的突变体质粒,检测抑制RIP2蛋白表达水平的位点,结果表明Lpro和3Cpro蛋白可通过自身的蛋白酶活性抑制RIP2蛋白水平的表达,2B蛋白的105-114和135-144段氨基酸是降低RIP2蛋白表达水平所必须的,2C蛋白的1-61段氨基酸是降低RIP2蛋白表达水平所必须的。免疫共沉淀试验表明FMDV 2C蛋白可与RIP2相互作用,2C的1-61段氨基酸是与RIP2互作所必须的。（5）为了探究FMDV 2C蛋白降低RIP2蛋白表达水平的机制,将2C质粒转染入PK15细胞中,检测PABPC1的蛋白表达水平。结果表明2C蛋白可降低PABPC1的蛋白表达水平,但对其mRNA水平没有影响。2C蛋白是通过1-61段氨基酸降低PABPC1的蛋白表达,且PABPC1蛋白水平的降低进一步引起了RIP2蛋白水平的降低,这揭示了2C蛋白降低RIP2蛋白表达水平的新机制。综上所述,本研究明确了宿主蛋白RIP2可影响FMDV诱导的信号通路,且RIP2蛋白抑制了FMDV的复制;证实了FMDV 2B、2C、Lpro和3Cpro蛋白具有拮抗宿主蛋白RIP2抗病毒的作用,并初步阐明了2B、2C、Lpro和3Cpro降低RIP2蛋白表达的机制。本研究揭示了FMDV抗宿主天然免疫的一种新机制,为综合防控FMDV提供了科学参考,也为新型疫苗的研制奠定了直接理论基础。
论文目录
摘要Summary英文缩略词表第一章 文献综述 1.1 口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）的概况 1.1.1 口蹄疫病毒的结构 1.1.2 FMDV的流行趋势及致病性 1.1.3 FMDV的防控及疫苗 1.2 天然免疫系统 1.2.1 TLRs介导的抗病毒天然免疫 1.2.2 RLRs介导的抗病毒天然免疫 1.2.3 NLRs介导的抗病毒天然免疫 1.2.4 胞浆DNA受体介导的抗病毒天然免疫 1.2.5 泛素化修饰调控的抗病毒天然免疫 1.2.6 磷酸化修饰调控的抗病毒天然免疫 1.3 FMDV调控宿主抗病毒天然免疫的研究 1.4 本研究的目的意义及研究内容第二章 RIP2 影响FMDV诱导的信号通路 2.1 材料与方法 2.1.1 细胞、病毒和工程菌 2.1.2 质粒和抗体 2.1.3 工具酶和主要试剂 2.1.4 主要仪器 2.1.5 主要试剂的配置 2.1.6 质粒的转化 2.1.7 质粒的大量提取 2.1.8 真核表达质粒和RNA的转染 2.1.9 细胞RNA的提取及cDNA反转录 2.1.10 实时荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction,qPCR） 2.1.11 细胞的冻存和复苏 2.1.12 FMDV的增殖 2.1.13 FMDV感染 2.1.14 蛋白质免疫印迹（Western blot,WB） 2.1.15 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP） 2.1.16 双荧光素酶报告基因的检测 2.1.17 数据统计分析 2.2 结果 2.2.1 FMDV感染激活RIP2 介导的信号通路 2.2.2 RIP2 影响FMDV诱导的P65和IRF3 的磷酸化 2.2.3 RIP2 影响FMDV诱导的下游抗病毒基因的表达水平 2.3 讨论第三章 RIP2对FMDV复制的影响 3.1 材料与方法 3.1.1 细胞、病毒和工程菌 3.1.2 质粒和抗体 3.1.3 工具酶和主要试剂 3.1.4 主要仪器 3.1.5 主要试剂的配置 3.1.6 质粒的瞬时转染（Lipofectamine3000） 3.1.7 病毒滴度 3.1.8 细胞RNA的提取及cDNA反转录 3.1.9 实时荧光定量PCR（qPCR） 3.1.10 数据统计分析 3.2 结果 3.2.1 过表达RIP2 抑制FMDV复制 3.2.2 小RNA干扰RIP2 蛋白表达水平后促进FMDV复制 3.3 讨论第四章 FMDV感染降低RIP2 的蛋白表达水平 4.1 材料与方法 4.1.1 细胞与病毒 4.1.2 抗体 4.1.3 工具酶和主要试剂 4.1.4 主要仪器 4.1.5 细胞RNA提取及反转录 4.1.6 实时荧光定量PCR（qPCR） 4.1.7 蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB） 4.1.8 数据统计分析 4.2 结果 4.2.1 FMDV感染上调RIP2 mRNA表达水平 4.2.2 FMDV感染降低RIP2 蛋白表达水平 4.2.3 FMDV感染降低RIP和 RIP3 蛋白表达水平 4.2.4 EV71感染降低RIP2蛋白表达水平 4.3 讨论第五章 FMDV降低RIP2 蛋白表达水平的机制 5.1 材料与方法 5.1.1 细胞与病毒 5.1.2 质粒与抗体 5.1.3 工具酶和主要试剂 5.1.4 主要仪器 5.1.5 细胞RNA提取及反转录 5.1.6 实时荧光定量PCR（qPCR） 5.1.7 MTS实验 5.1.8 主要试剂的配制 5.1.9 蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB） 5.1.10 数据统计分析 5.2 结果pro和3Cpro蛋白降低内源性RIP2 蛋白表达水平'> 5.2.1 FMDV2B、2C、Lpro和3Cpro蛋白降低内源性RIP2 蛋白表达水平pro和3Cpro不降低RIP2 mRNA水平'> 5.2.2 FMDV2B、2C、Lpro和3Cpro不降低RIP2 mRNA水平 5.2.3 FMDV2B降低RIP2 蛋白表达水平的机制 5.2.4 FMDV2C降低RIP2 蛋白表达水平的机制pro和3Cpro降低RIP2 蛋白表达水平的机制'> 5.2.5 FMDV Lpro和3Cpro降低RIP2 蛋白表达水平的机制 5.3 讨论第六章 FMDV2C与 RIP2 相互作用 6.1 材料与方法 6.1.1 细胞、病毒和工程菌 6.1.2 质粒和抗体 6.1.3 工具酶和主要试剂 6.1.4 主要仪器 6.1.5 主要试剂的配置 6.1.6 免疫共沉淀实验 6.2 结果 6.2.1 FMDV2C与 RIP2 外源性互作 6.2.2 FMDV2C与 RIP2 内源性互作 6.2.3 FMDV2C与 RIP2 的互作位点 6.3 讨论第七章 FMDV2C降低RIP2 蛋白表达水平的机制 7.1 材料与方法 7.1.1 细胞与病毒 7.1.2 质粒与抗体 7.1.3 工具酶和主要试剂 7.1.4 主要仪器 7.1.5 RNA的转染 7.1.6 细胞RNA提取及反转录 7.1.7 实时荧光定量PCR（qPCR） 7.1.8 蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB） 7.1.9 数据统计分析 7.2 结果 7.2.1 FMDV2C降低PABPC1 的蛋白表达水平 7.2.2 FMDV2C降低PABPC1 蛋白表达水平的位点 7.2.3 PABPC1 蛋白干扰后抑制了RIP2 的蛋白表达水平 7.3 讨论全文结论参考文献致谢作者简介导师简介
文章来源
类型: 博士论文
作者: 薛巧
导师: 曾巧英,郑海学
关键词: 口蹄疫病毒,天然免疫
来源: 甘肃农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 甘肃农业大学
分类号: S852.4
DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000244
总页数: 118
文件大小: 4528k
下载量: 33
相关论文文献
标签：口蹄疫病毒论文; 天然免疫论文;
口蹄疫病毒感染拮抗宿主蛋白RIP2抗病毒反应的机理研究
下载Doc文档