山东医学高等专科学校山东济南250002
【摘要】目的观察槲皮素对大鼠缺血再灌注NF-kB表达的影响及意义。方法将大鼠随机分成四组：肝损伤组（A组）、槲皮素干预组（B组）、假手术组（C组）、空白对照组（D组）。检测肝组织SOD（超氧化物歧化酶）活性、MDA（丙二醛)含量及TNF-α（肿瘤坏死因子-α)及IL-1（白细胞介素-1）含量；应用RT-PCR法检测肝组织中NF-kBmRNA表达量及应用Westernblot法检测肝组织中NF-kB含量。结果与A组比较，B组肝组织MDA含量降低及SOD活性升高(P<0.05)及肝组织TN-α和lL-1活性明显下降(P<0.05)；而且B组肝组织NF-kBmRNA表达量增强和NF-kB含量增加。结论槲皮素通过清除氧自由基来抑制NF-kB的表达，减少TN-α和lL-1生成，进而发挥保肝作用。
【关键词】肿瘤坏死因子-α和白介素-1；再灌注损伤；核转录因子；槲皮素
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofquercetinontheexpressionofnuclearfactor-kBafterhepaticischemia-reperfusioninjuryinrats.MethodsTheadultratswererandomlypidedintofourgroups：ischemia-reperfusiongroup(groupA)；quercetintreatinggroup(groupB)；shameoperationgroup(groupC)；controlgroup(groupD)；Theconcentrationofmalondialdehvde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)inthelivertissueweredetected．ThelivertissueweresampledtoobservetheexpressionofTNF-αandIL-1.Afterhepaticisehemiaandreperfusion，weanalyzedtheexpressionofNF-kBbythemethodsofWesternblotandRT-PCR.ResultsComparedwithAgroup，increasedactivityofSODanddecreasedMDAlevelwerefoundinBgroup(P<O.05)andtheexpressionsofTNF-αandIL-linthehepatictissueinBgroupsignificantlydecreased(P<O.05)，andtheNF-kBleveldecreasedaftertreatedwithquercetin．ConclusionQuercetininhibitstheexpressionofNF-kBandTNF-αandIL-1byeliminatingingoxygenfreeradicalsandhasprotectiveeffectsonhepaticischemiareperfusioninjury．
【Keywords】TumornecrosisfactorandInterleukin-1；Reperfusioninjury；NF-kB；Quercetin
氧自由基机制在肝脏缺血再灌注损伤中的作用已成共识，枯否细胞激活产生大量氧自由基和炎症介质被公认为是肝脏缺血再灌注损伤早期最主要的致伤原因[1]。在肝脏缺血再灌注过程中，氧自由基是NF-KB重要的激活剂[2]，而活化的NF-kB又可诱导细胞因子、趋化因子、免疫因子受体和转录因子等多种物质的表达。McCord[3]通过研究提出，过多的氧自由基在缺血冉灌注损伤中发挥重要作用。更有学者指出，氧自由基可能是肝脏缺血冉灌注损伤组织中最早出现和最重要的成分之一。槲皮素(Quercetin)属于黄酮类化合物,在自然界中广泛存在于各种蔬菜、水果及中草药中,具有抗氧化及清除氧自由基作用、调节免疫功能及抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗过敏和镇痛等作用，还具有抗血小板聚集、扩张冠脉、降低血压、调节血脂、保护心肌缺血再灌注损伤等多种生物活性及药理作用[4]。本实验通过观察槲皮素对肝缺血再灌注损伤NF-kB的表达影响，以探讨槲皮素在肝缺血再灌注损伤中的保护机制。
1、材料和方法
1、材料实验动物wistar实验用雄性大鼠，体重200-250克/只（由重庆医科大学动物实验中心提供）；槲皮素（购自安徽甙尔天然有机化合物信息中心）；二甲基亚砜(DMSO,Sigma公司)；NF-kB蛋白的第一抗体为鼠抗人抗体和抗β-actin抗体(美国SantaCruse公司)，羊抗鼠二抗购自晶美公司；TNF-α（肿瘤坏死因子-α)及IL一1（白细胞介素-1）酶联免疫试剂盒购自中国晶美生物工程公司；Marker和Trizol试剂为北京鼎国公司；引物合成为上海博亚生物技术公司；first
strandcDNASynthesisKitforRT-PCR和PCR扩增试剂均为Roche公司；优质胎牛血清购于HyClone公司；SOD（超氧化物歧化酶）及MDA（丙二醛)检测试剂盒购自中国南京建成生物制品有限公司。
2、方法
2.1将大鼠随机分为四组：肝损伤组（A组）：阻断大鼠肝左、中叶肝蒂，造成肝脏缺血；干预组（B组）：干预组给予槲皮素（应用二甲基亚砜溶解）空腹灌胃，给入剂量为40mg/kg[5],其余处理与肝损伤组相同；假手术组（C组）：给予开腹及暴露肝蒂处理，不阻断肝脏血流；空白对照组（D组）：仅应用DMSO（二甲基亚砜）直接灌胃。D组DMSO用量与干预组所用DMSO溶解的槲皮素量相等，而假手术组和肝损伤组以等量生理盐水灌胃，持续时间为15天。
2.2制备动物模型：实验大鼠用1％戊巴比妥钠，按50mg/kg体重腹腔注射麻醉后，显露肝脏，分离肝脏左、中叶肝蒂，用无创血管夹夹闭通向左、中肝叶的血流，造成约70％的肝脏缺血1小时，松夹恢复血流即进行再灌注4小时，术中不阻断右叶肝血流，以防门静脉及胃肠道淤血,最后关腹。其中槲皮素干预组末次灌胃于手术前1小时进行，各实验组灌注完成后取左叶肝组织待测。
2.3肝组织中TNF-a和IL-l含量的检测：将肝组织加入PBS缓冲液制备成匀浆，离心取上清液，应用酶联免疫吸附法检测肝组织TNF-a、IL—l含量；用比色分析方法检测肝组织SOD、MDA水平，以上实验均按说明书操作。
2.4RT-PCR检测肝组织中NF-kBmRNA表达：根据GenBank中NF-kB基因序列设计引物，由上海生工公司合成，上游引物序列:5’-CGATGCATCCACAGCTTCCAG-3’，下游引物序列：5’-GAAGCTGCATGGACACTCGCA-3’,产物为483bp；β-actin上游引物序列：5’-CATGAAGATCCTGACCGAGCG-3’，下游引物序列：5’-TCAGCAATGCCTGGGTACATG-3’,产物为358bp。按说明书应用Trizol法抽提总RNA，在逆转录酶、42℃60min，95℃5min作用下合成cDNA；PCR反应体系每管50μl，扩增条件为：95℃3min，94℃1min,65℃55s，72℃1min，30个循环，然后72℃10min延伸，扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，观察成像结果。
2.5Westernblot技术检测肝组织NF-kB蛋白的表达：将肝组织加入蛋白裂解液充分裂解，机械制备成匀浆，然后于4℃、12000转/min离心10分钟,蛋白提取物经定量后,取50μg在SDS-PAGE凝胶上电泳，然后电转膜到醋酸纤维素膜上，封闭2小时后，分别加入NF-kB和β-actin一抗，在4℃条件下过夜,充分用PBS漂洗3次,每次10分钟,再加入辣根过氧化物酶标记的二抗震荡孵育2小时，洗去未结合的二抗，滴加ECL化学发光试剂，X光片曝光显影。
2.6统计学分析：全部数据以采用SAS（StasticalAnalysisSystem）软件进行分析，应用t检验，以±S表示，P<0.05有统计学意义。
3.结果
3.1RT-PCR检测肝组织NF-kBmRNA的表达:图1示大鼠再灌注4小时后，在A组和B组中，大鼠肝组织中均可见到NF-KBmRNA表达，但A组表达量最多，条带最亮，B组较模型组明显减弱，C组和D组均没有表达。
3.2Westernblot法检测NF-kB的蛋白表达:A组和B组均有NF-KB蛋白表达,但A组图像上蛋白条带较亮，B组较暗，C组、D组则没有蛋白表达，这与应用RT-PCR法检测mRNA的结果相一致。
3.3肝组织SOD活性及MDA含量变化：与C组、D组比较，A组SOD活性明显降低、MDA含量明显升高(P<0.05)；B组与A组比较，SOD活性升高、MDA含量下降，差异明显(P<0.05)。
3.4肝组织TNF-α及IL-1检测：表2结果显示A组TNF-α、IL-1水平明显高于C组、D组（P<0.01）；而B组肝组织TNF-α、IL-1水平明显低于A组，两者比较有统计学意义（P<0.05）。
4.讨论
缺血／再灌注损伤的确切机制目前尚未明了，其发生与氧自由基、钙超载及其引发的脂质过氧化反应等多种因素有关。在肝脏组织缺血/再灌注过程中，氧自由基是NF-KB重要的激活剂[2],而活化的NF-kB可上调多种前炎性细胞因子(如TNF-α，IL-1)的基因转录，而这些细胞因子产生后又可再次激活NF-KB，增强这些细胞因子的基因转录，放大其生物效应，形成NF-KB信号转导通路正反馈调控机制[6]。正是肝脏缺血再灌注时伴有NF-kB活性增高，并可诱发和加重组织的损伤[7]，所以有研究结果显示：抑制NF-kB活化，可以使多种致炎性细胞因子和趋化因子表达和释放减少，进而从上游阻断枯否细胞活化[8]，且阻断NF-kB的活性可明显减轻组织器官的再灌注损伤[9-10]。
槲皮素是一种天然黄酮类化合物，化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，在苹果、洋葱、茶叶和红酒中含量丰富，许多研究表明，槲皮素是很强的自由基清除剂[11]。氧化应激与炎症反应相互作用，活性氧不仅在氧化应激时会产生，在炎症反应过程中，通过激活转录因子，也会产生活性氧。因此，清除活性氧不仅对氧化应激有保护作用，并且有助于减轻炎症反应心[12]。缺血/再灌注过程产生大量的活性氧，同时导致多种抗氧化酶，如SOD、过氧化氢酶活性降低，肝组织中MDA含量增加，脂质过氧化程度加重[13]，使用自由基清除剂及抗氧化剂对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用[14]。本实验结果显示，槲皮素能提高缺血肝脏SOD活性及降低MDA的含量，表明槲皮素能提高机体抗氧化酶系统的活性，有助于消除活性氧，抑制脂质过氧化，减轻活性氧对肝脏的损害程度；同时研究还发现，槲皮素干预组肝组织中TNF-α和IL-1含量均较肝损伤组明显降低，说明槲皮素能显著降低TNF-α及IL-1在肝组织中的表达，从而减轻由TNF-α、IL一1介导的肝脏进一步损伤。与假手术组、空白对照组相比，大鼠肝脏缺血再灌注损伤后，通过Westernblot方法观察到RT-PCR法检测肝组织结果显示NF-kBmRNA表达水平显著升高，同时NF-KB蛋白的表达水平也显著升高。经40mg／kg剂量的槲皮素预处理15天后，与肝损伤组动物相比，预处理组大鼠肝脏组织中NF-kB的蛋白表达水平显著降低，同时，发现槲皮素预处理组动物的NF-kBmRNA表达水平也降低。
综上所述，槲皮素具有抗缺血再灌注损伤的作用，其机制可能是由于它的分子结构中具有清除自由基及稳定自由基中间体的酚羟基而起到广泛的抗氧化作用，从而阻止了NF-kB的活化，使炎性细胞因子分泌减少，抑制了中性粒细胞的浸润能力，对肝脏缺血再灌注损伤起到积极的保护作用。
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