董蕊[1]2003年在《人表皮干细胞的体外培养及在组织工程皮肤构建中的应用研究》文中提出口腔黏膜和覆盖于体表的皮肤由表皮和真皮组成，并借助皮下组织与深部组织相连，处于最外层的表皮属于复层鳞状上皮。表皮终生处于增殖、分化及脱落的不断更新之中，这是由于其中的表皮干细胞不断增殖分化所致，且表皮干细胞的增殖分化与外层终末分化细胞的不断脱落保持动态平衡，而这种平衡是维持口腔黏膜和皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本条件。目前较统一的观点认为表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能力，且可分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能，并可形成克隆。随着发育生物学的发展，研究者发现表皮干细胞在受损皮肤功能与结构重建中也具有重要作用。而各种原因所致皮肤缺损的修复是临床常见问题，近年来，随着组织工程技术的发展，研制人工皮肤替代物成为研究热点，但存在种子细胞增殖的有限性等问题。如果能在体外成功培养表皮干细胞，对于组织工程皮肤种子细胞的研究也极有意义。另外，由于表皮干细胞在机体中终身存在，因而成为遗传性皮肤病的基因治疗的靶向细胞，并且相关的研究涉及到各个方面。 本研究在体外成功筛选、培养出表皮干细胞，并将其应用于全层组织工程皮肤的构建。实验主要包括以下内容： 1．表皮干细胞在成人及胎儿不同部位皮肤中分布的比较：检测表皮干细胞相对特异性分子—角蛋白19(cytokeratin 19，Ck19)及整合素β1在胎儿及成人不同部位皮肤中的表达，比较表皮干细胞在成人及胎儿皮肤中分布的差异，并进行定位。结果表明表皮干细胞分布于人类皮肤的表皮基底 第四军匠大学硕士学位论文层及部分毛囊细胞中，在胎儿皮肤中该细胞数量比成人多，说明该类细胞随年龄逐渐减少的生物学改变，也反映了皮肤的生理性变化。 2．角肮细胞长期培养过程中角蛋白19表达的分析研究：分析实验室条件下人角肮细胞长期体外培养过程中有无表皮干细胞的存在，观察角肮细胞体外的生长过程。所用的组织分离方法可得到包括表皮干细胞在内的几乎全部数目的表皮基底层细胞，为进行表皮干细胞的分离及筛选奠定实验基础。 3．人表皮干细胞体外筛选及鉴定的实验研究：探讨体外筛选及鉴定表皮干细胞的方法。利用ESC对胞外基质的快速劲附性，选择不同时间点虱附的细胞分为叁组（5。in、20。in、60 min组），并以不进行筛选的细胞作对照组。体外培养扩增后，以ESC的相对特异性标识分子pl整合素、Cklg的单克隆抗体，用免疫组化方法对各组细胞进行鉴定，利用图像分析系统测其平均灰度值，进行统计学分析。并用透射电镜对各组细胞检测。结果表明利用胞外基质筛选的5 min组细胞处于幼稚状态，并有强的克隆形成能力，符合预期的ESC特点。因而，可以利用ESC对胞外基质的快速瓢附性对其纯化筛选，同时利用pl整合素及Ck19单抗加以鉴定。 4．表皮干细胞在不同培养基中生长状态的观察研究：配制FAD、FAD卜X FADZ什＊ FAD3什X KSFM等 5种不同的培养基，同时应用同一个体的成纤维细胞经丝裂霉素处理后作滋养层，培养人表皮干细胞，通过细胞曲线、MTT检测观察细胞的生长状态。结果显示细胞在FAD组中生长良好，而加入bFGF可以进一步改善细胞的生长状态。 5．表皮千细胞生物学性状的初步探讨：在体外培养扩增表皮干细胞后，利用透射电镜、流式细胞仪分析、BrdU检测观察细胞的生长状态，结合流式细胞仪分析来观察细胞的周期变化。结果表明表皮干细胞在体外培养过程中，呈典型的克隆性生长；在稳定状态下是一种处于静止期的幼稚细胞，大部分处于 G。／G；期。 3 第四军医大学硕士一位论文 6．表皮干细胞在构建组织工程皮肤中的应用：用表皮干细胞和同一个体的真皮成纤维细胞构建组织工程皮肤。分为3组，一组单纯利用表皮干细胞；一组表皮干细胞和未经筛选的角肮细胞按一定比例混合；同时单纯用角肮细胞作为对照组。通过HE染色、免疫组织化学方法对组织工程皮肤进行检测，观察构建皮肤的异同。结果显示利用表皮干细胞可形成全层表皮，且仍有大量表皮干细胞的存在，形成基底层；利用混合细胞，构建的皮肤中表皮层明显多于其它组，且有基底层的形成，效果较好。
吕淑坤[2]2012年在《表皮干细胞在组织工程创面修复中的应用》文中研究说明背景:随着细胞生物学、分子生物学技术、组织工程学的快速发展,探寻组织工程化皮肤创面覆盖物的"种子细胞"的研究逐渐增多。目的:总结表皮干细胞的生物学特性,探讨其在皮肤创面修复过程中的再生作用与临床应用价值。方法:应用计算机检索CNKI和Pub Med数据库中2002-07/2011-12关于表皮干细胞修复皮肤损伤研究的文章,以"表皮干细胞,创面修复,组织工程,皮肤"或"epidermal stemcells,tissue engineering skin,wound surface"为检索词进行检索。选择文章内容与表皮干细胞修复皮肤损伤研究进展有关的文章,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到129篇文献,根据纳入标准选择28篇文献进行综合分析。结果与结论:表皮干细胞是表皮发生、分化和创面修复的基础,其正常增殖分化是维持皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本要求,也是皮肤组织工程理想的种子细胞。对烧伤、创伤等大面积皮肤缺损的治疗,对皮肤疾病的细胞疗法、基因治疗等方面都有很好的应用前景。表皮细胞的体外培养是复合人工皮肤组织工程学研究的先决条件。随着对表皮干细胞分离、纯化和培养技术的不断完善,可达到迅速构建表皮层的目的。但表皮干细胞的应用研究仍需要进一步的探索。
史明艳[3]2006年在《山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究》文中研究说明组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立(1)将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养(DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基),5d后消化传代。(2)对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究(1)本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。(2)细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。
杨亚东[4]2005年在《表皮干细胞构建组织工程皮肤的初步研究》文中研究表明目的:应用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞(ESC),对分选的细胞进行培养、鉴定,并应用分选的ESC 作为种子细胞构建复方壳多糖组织工程皮肤的表皮,为研究ESC 的多向分化潜能和分化标志提供良好的实验模型,并力求获得生物学性能更佳的组织工程皮肤,为临床应用提供更理想的生物修复材料。应用基因转染技术以绿色荧光蛋白(GFP)对种子细胞进行标记,为研究组织工程皮肤种子细胞的存活情况和基因修饰打下基础。方法:对酶消化分离获得的表皮细胞,应用Ⅳ型胶原快速粘附法进行分选,并以角质细胞无血清培养基(K-SFM)进行培养,观察细胞生长状况及克隆形成情况;选择ESC 相对特异性标记分子β1 整合素、角蛋白19(CK19)的单/多克隆抗体,用免疫组化法对分选后的各组细胞进行鉴定;选择HMB45、S-100 特异表达作为标记物,鉴定分选所得细胞及组织工程皮肤中黑色素细胞(MC)存在及含量;在培养的种子细胞中分别转染GFP,观察转染的成功率,并应用转染后的细胞构建组织工程皮肤,观察组织工程皮肤在培养过程中GFP 的表达情况;对比研究ESC 作为种子细胞与未分选的表皮细胞作为种子细胞构建的组织工程皮肤的组织结构特性的差异。结果:1.利用ESC 对细胞外基质(ECM)的高粘附力,可以初步筛选ESC;所分选的细胞体外培养可形成明显的克隆;以0.2mg/ml 浓度粘附15 分钟组,β1 整合素、CK19 双标阳性的细胞占28.50%。2.Ⅳ型胶原快速粘附法分选的细胞中含有较多的MC,MC 在K-SFM 培养基中可以继续生长并增殖,分选的细胞培养14 天后作为种子细胞所构建的组织工程皮肤中仍然含有较多的MC。3.对种子细胞进行了成功转染GFP,阳性率较高,构建的组织工程皮肤中仍然可以观察到GFP 的表达。4.经分选的ESC 构建出来的组织工程皮肤,表皮生长较对照组好,表皮颜色较深,组织切片见其表皮层更厚,表皮结构更完善,表皮与真皮的结合更加紧密。结论:1.Ⅳ型胶原快速粘附法是一种初步分选ESC 的较好方法,可以得到含较高比例ESC 的增殖活力好的表皮种子细胞;2.分选所得的细胞培养后其中仍然含有
闫迎军[5]2007年在《应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤》文中认为皮肤软组织缺损是整形外科和烧伤外科经常遇到的问题，临床上通常采用自体皮肤或异体皮肤移植进行修复。然而，这一治疗过程存在着缺乏充足的自体皮源，供区继发性损伤大，异体皮肤移植引发免疫排斥反应等等众多缺点。近二十年来，随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展、高新技术的应用以及学科间的相互渗透，创伤修复与组织再生从基础研究到临床应用都获得了迅猛发展。各国学者相继探索了许多种组织工程皮肤的构建方法，从根本上为临床解决皮肤缺损的修复提供了崭新的思路。但是，目前很多组织工程皮肤产品仍不成熟，存在着皮肤耐磨性差、自体种子细胞来源缺乏、异体种子细胞诱发免疫排斥反应、培养耗时长、治疗费用昂贵等缺点。因此，有必要探索一种具有良好临床应用前景的组织工程皮肤构建方法。研究目的探索脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向表皮细胞定向分化的诱导培养方法，分析ADSCs诱导分化的表皮细胞是否具有干细胞的特性。观察人脱细胞真皮的超微结构特点，分析其做为组织工程皮肤支架材料的合理性。探索应用ADSCs源类表皮干细胞复合脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤的方法，观察该组织工程皮肤的组织结构特点与超微结构特点。应用构建的组织工程皮肤修复实验动物皮肤缺损，观察治疗效果与成活后的组织结构特点和超微结构特点。研究方法1、采用贴壁分离方法从脂肪抽吸液中分离出脂肪干细胞，培养扩增。在表皮细胞诱导培养基中诱导ADSCs向表皮细胞定向分化。分别检测诱导前、后细胞的表面抗原表型，细胞周期与CK5、CK10、CK19表达情况，并绘制细胞增殖曲线。在成骨细胞诱导培养基中进一步诱导ADSCs源表皮细胞向成骨细胞定向分化，对诱导后的细胞进行ALP染色和Yon Kossa染色检查。2、扫描电镜下观察人脱细胞真皮的超微结构。应用人ADSCs源类表皮干细胞复合人脱细胞真皮体外构建组织工程皮肤，对其进行组织学观察与超微结构观察。3、应用组织工程皮肤和脱细胞真皮修复裸鼠皮肤缺损，术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行基底膜糖原(PAS)染色检查和组织学观察，对DAPI标记的人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察。4、应用实验猪自体ADSCs源类表皮干细胞复合猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤，修复其背部正中线左侧皮肤缺损。以猪脱细胞真皮修复右侧皮肤缺损做为对照。术后观察皮肤缺损修复情况，对移植成活的组织工程皮肤进行组织学观察和超微结构观察。研究结果1、ADSCs向表皮细胞诱导分化，72小时后部分细胞由梭形变成圆形或椭圆形，7天后大部分细胞呈圆形或椭圆形，排列成铺路石状。诱导培养前、后的细胞增殖曲线均呈S型，但是诱导培养前ADSCs 7d时增殖达到顶峰，诱导培养后的细胞6d时增殖达到顶峰。诱导培养前87.42％的细胞处于G_0和G_1期，诱导培养后96.38％的细胞处于G_0和G_1期。诱导培养后，少数细胞CK5免疫荧光染色呈阳性，部分细胞CK19免疫荧光染色呈阳性，CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞CK10、CK19在mRNA水平的表达呈阳性。诱导培养后传代10次的细胞形态无明显改变，X-Gal染色呈阴性，细胞染色体数目2n=46，核型为女性正常核型(46，xx)。裸鼠皮下注射诱导培养后传代10次的细胞，2个月后无瘤体形成。ADSCs源表皮细胞向成骨细胞诱导分化后，ALP染色和Yon Kossa染色显示为阳性。2、人脱细胞真皮基底膜面与真皮面均为多孔结构，基底膜孔隙直径为31.03～82.76um(51.72±15.64um)，真皮孔隙直径为115.38～192.31um(143.27±23.95um)。对体外培养3天的组织工程皮肤进行扫描电镜观察，可见大量人ADSCs源类表皮干细胞粘附于脱细胞真皮基底膜上，细胞呈圆形、椭圆形，直径为75.62～107.86um(87.11±11.46um)，显着小于脱细胞真皮基底膜孔隙直径。组织学观察发现，体外培养2周的组织工程皮肤与正常皮肤的组织结构特征相似，仅缺少角质层。3、术后1个月，实验组裸鼠背部移植的组织工程皮肤成活良好，但表皮较薄弱，色泽与周围正常皮肤相似。PAS染色可见表皮层和真皮层之间有呈深红染色、呈波浪状连续存在的基底膜。术后2个月，光镜下可见组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿。应用DAPI标记人ADSCs源类表皮干细胞进行示踪观察，术后1个月可见表皮深层有2～3层较强荧光显色的细胞，术后2个月可见表皮深层有5～6层较弱荧光显色的细胞。对照组裸鼠术后1个月时背部创面未愈合，仍覆盖薄层痂皮，创缘轻度收缩。4、术后1个月，实验猪背部正中线左侧移植的组织王程皮肤成活良好，表皮角化明显，色素缺失；正中线右侧移植的猪脱细胞真皮形成肉芽组织，局部结痂，创缘收缩明显。组织学观察可见，实验侧组织工程皮肤的结构与正常皮肤相似，真皮内无表皮样囊肿，表皮层与真皮层之间可见呈犬牙交错样相接的表皮突和真皮乳头；对照侧猪脱细胞真皮则转化为肉芽组织，其表面无表皮层覆盖。超微结构观察可见，在成活的组织工程皮肤基底膜与基底层细胞之间有半桥粒连接形成；表皮细胞的胞质中有角蛋白丝，成束状排列：相邻的表皮细胞之间形成桥粒连接。研究结论1、ADSCs具有易于获取，能够在体外大规模培养和扩增，性质稳定，多潜能分化，培养扩增不需要大量的血清等优点，是组织工程研究中良好的种子细胞来源。2、ADSCs在体外诱导培养体系中能够向表皮细胞分化，部分细胞具备了表皮干细胞的一些特征，我们将其暂时命名为“ADSCs源类表皮干细胞”。ADSCs源类表皮干细胞在实验动物体内能够复层生长，形成表皮样结构。3、本研究中，诱导ADSCs向表皮细胞分化的体外诱导培养体系具有安全性。4、脱细胞真皮基底膜具有良好的细胞粘附性。基底膜与真皮均为多孔结构，基底膜和真皮的孔隙直径接近于支架材料促进表皮组织和真皮组织再生的最佳孔隙直径。5、脱细胞真皮的结构特点有利于移植部位周围的成纤维细胞和血管内皮细胞移行进入并增殖，体外构建组织工程皮肤时不需在真皮层内复合成纤维细胞。这既降低了构建组织工程皮肤的复杂性和经济成本，同时还提高了安全性。6、本研究中构建的组织工程皮肤具有生物活性，移植于实验动物体内后能够转化为组织结构合理的皮肤组织，未观察到表皮样囊肿形成。7、本研究中构建的组织工程皮肤性状稳定，可以有效地修复实验动物皮肤缺损，具有良好的临床应用前景。
林尊文[6]2009年在《应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤及移植实验》文中指出目的:采用体外分离培养的人表皮干细胞和间充质干细胞为种子细胞,复合脱细胞真皮支架体外构建复合皮肤,并移植修复兔背全层皮肤缺损创面,观察创面修复情况,探讨其在全层缺损创面修复的可行性,为其进一步的临床应用奠定基础。方法:取烧伤整形患者植皮手术剩余皮片标本,经胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原差速粘附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成的人表皮干细胞培养基进行体外培养。观察细胞形态及生长情况。均以角质细胞作对照。取骨髓穿刺所得人健康骨髓,密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞。以含20%胎牛血清、低糖DMEM作为培养基进行体外培养。观察细胞形态及生长情况。将间充质干细胞、表皮干细胞分别接种于脱细胞真皮上,体外构建复合皮肤。在新西兰白兔背部制作4个全层皮肤缺损模型并随机分组,分为A、B、C、D四组,A、B、C叁组分别用间充质干细胞、表皮干细胞与脱细胞真皮构建复合皮、表皮干细胞和脱细胞真皮构建复合皮、脱细胞真皮,D组空白创面,观察全层皮肤缺损创面愈合情况。各组分别于术后15天和21天在部分创面取材行常规HE染色,观察各组创面愈合过程中的组织结构改建情况。结果:1、经Ⅳ型胶原差速粘附法分离、纯化的人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察见细胞呈明显克隆性生长并逐渐融合。透射电镜观察见细胞胞核大,胞浆少,核浆比例大,胞浆内细胞器少。2、利用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察见间充质干细胞呈长梭型生长并逐渐融合成放射状。透射电镜观察见细胞形态不一,多位圆形,可见核仁,胞浆比例大,胞质内有分泌小泡,细胞器较少,为低分化的幼稚细胞。3、用间充质干细胞与表皮干细胞所构建的复合皮肤、表皮干细胞构建的复合皮肤、单纯真皮移植覆盖修复兔背全层皮肤缺损创面,空白组用油砂布覆盖。术后创面愈合时间分别为:14.56±1.06d、16.21±1.32d、18.25±1.16d、23.0±1.37d,组间比较差异有显着性意义(P<0.05)。常规HE染色观察创面的改建情况显示:(1)A、B两组创面15d后,可见创面已上皮化,细胞分层明显,术后21d后两组创面胶原排列趋于规则,而C、D两组创面15d后创面上皮化不明显,可见许多炎性细胞,21d创面表皮层上皮化不如A、B两组;(2)同一时间比较,含有间充质干细胞的A组创面见许多毛细血管、成纤维细胞数量增加,肉芽组织形成丰富,较其他组创面新生血管明显。结论:利用Ⅳ型胶原差速粘附法可以用于表皮干细胞的分离纯化;利用密度梯度法分离培养的间充质干细胞,生长良好、细胞活力较好。体外应用表皮干细胞、间充质干细胞接种于脱细胞真皮构建的复合皮肤移植修复兔背全层皮肤缺损创面时,可促进创面上皮化,加速新生血管形成及加速创面的愈合和改建,提高创面愈合质量。
杨青[7]2012年在《毛囊干细胞和表皮干细胞生物学特性的比较研究》文中指出目的：1、建立高效、快速的兔FSCs (Follicle stem cells, FSCs)和ESCs (Epidermal stem cells, ESCs)分离、培养技术,进行原代与传代细胞的培养。2、观察体外培养的兔FSCs和ESCs生物学特征、细胞周期,并比较两种细胞的差异。3、体外分离、培养人FSCs和ESCs,进行形态学观察。4、比较人FSCs和ESCs生物学特征。探讨更合适组织工程皮肤的种子细胞,为体外构建含有附属器官的人工皮肤和实现大面积皮肤损伤从结构修复到功能重建提供基础。方法：1、采用两步酶消化法从兔触须部和腹部皮肤分别获取FSCs和ESCs,进行原代与传代培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态。2、免疫组化检测兔FSCs和ESCs的表面标记物,β1整合素和角蛋白19(keratin19,K19)的表达差异。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。3、采用流式细胞仪分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs各周期细胞的分布；比较经传代后两种细胞的生物学活性。4、用荧光定量PCR技术检测传代培养的FSCs和ESCs K19,βl整合素在mRNA水平上的表达差异。5、采用单细胞法和组织块法培养,分离培养人头皮来源的FSCs;分离培养人皮肤的ESCs,进行原代和传代细胞形态学观察。6、比较人FSCs和ESCs体外贴壁时间、细胞形态结构、生长曲线和细胞增殖活性的差异。结果：1、采用两步酶法成功地分离出兔的FSCs和ESCs,FSCs分离培养2天丌始有细胞贴壁,3天时贴壁的细胞有明显的聚集倾向,7天后克隆增大丌始融合,传代培养的FSCs贴壁迅速,细胞培养8天达到完全融合。ESCs培养10天细胞才有克隆样生长趋势;传代培养细胞贴壁缓慢,细胞培养2周80%融合。2、免疫组化染色结果显示,兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均阳性表达。FSCs和ESCs生长曲线的比较除第2天无明显的差异外,从第6天丌始FSCs的增殖活性明显高于ESCs,具有统计学意义(P<0.05),第10、14、18天FSCs的增殖活性逐渐增强,直到第26天,增殖活性开始下降；ESCs在第10天达到了增殖最高峰后细胞增殖活性迅速下降。FSCs显示出持续高增殖,其高增殖时间是ESCs的2倍。3、流式细胞仪分析细胞周期结果显示,传代培养的FSCs和ESCs随代次延长S期百分比和PI值均有下降,同代次细胞FSCsPI值大于ESCs。4、荧光定量PCR检测兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表达,显示FSCsβ1整合素和K19mRNA表达明显高于ESCs。5、“两步酶”分离法可获取大量人FSCs和ESCs;单细胞培养FSCs细胞大部分在24h内贴壁,传代细胞增殖迅速,3天左右达到80%以上融合。组织块培养5天可见细胞在组织周围爬出,细胞呈表皮样。生长迅速,15天时可见表皮样细胞周围出现成纤维样的细胞。ESCs培养3天时细胞多悬浮生长。传代细胞增殖缓慢,培养7天细胞达到80%融合。6、人FSCs和ESCs β1整合素、K19免疫染色均阳性。FSCs与ESCs生长曲线相比,FSCs具有更高的增殖活性且有一个相对较长高增殖活性的生长期。结论：1、“两步酶”消化法是一种安全、高效的FSCs和ESCs的分离方法。可在较短时间内为实验研究提供大量目标细胞。2、人和兔来源的FSCs与ESCs均表达表皮干细胞标志β1整合素和K19,且FSCs显示高表达。3、获取的FSCs和ESCs均具有较高的增殖能力,经体外培养的FSCs能在体外长时间扩增且细胞周期分布稳定。4、FSCs和ESCs均可以作为皮肤组织工程的种子细胞,FSCs不仅获取容易且具有更高的增殖活性和多分化潜能,对构建全层工程皮肤,FSCs更有优势。
陶克[8]2005年在《人胎儿皮脂腺细胞和汗腺细胞的体外分离培养和人胎儿表皮干细胞向毛囊、皮脂腺和汗腺诱导分化的初步研究》文中研究指明[研究背景] 烧伤后引起的局部或全身损害均与皮肤屏障的丧失有关,尽早封闭创面并最大可能地恢复功能与外观是烧伤治疗的主要目标。目前在烧伤的临床治疗中所广泛采用的自体断层皮片移植法虽然成功救治了众多患者,但也面临着严重烧伤时自体皮源不足、增加创面面积、移植后皮肤挛缩及缺乏皮肤附件等难题。皮肤组织工程技术为烧伤创面的修复提供了新的方法。目前研制开发的组织工程皮肤多以培养的角质形成细胞膜片或自体刃厚皮片为表皮层,以人工合成的真皮接种成纤维细胞或异体/异种脱细胞真皮为真皮层,其中部分已商品化并取得了较好的临床效果。但现有各类组织工程皮肤也面临着共同的难题,即均缺乏毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附件,无法构建“功能性组织工程皮肤”。皮肤及其附件(毛发、汗腺、皮脂腺等)均是由外胚层衍生而来,表皮干细胞作为皮肤组织特异性干细胞,具有无限增殖潜能及多向分化潜能,被认为是毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附属器发生、修复、改建的关键性源泉,理论上可以分化为皮肤的各种细胞成份和结构。因此,建立皮脂腺细胞、汗腺细胞体外培养模型,详尽地了解皮脂腺细胞、汗腺细胞体外培养生长特点,并通过模拟特定的微环境,调控表皮干细胞分化方向,在皮肤修复的同时能够诱导毛囊、皮脂腺和汗腺的发生,无疑是构建包含毛囊、皮脂腺和汗腺等皮肤附件的“功能性组织工程皮肤”的重要途径。研究表明脐带血
杨学义[9]2004年在《表皮干细胞建系及重建角膜缘干细胞缺损眼表研究》文中研究表明自Bikenbach（1981）首次标记小鼠皮肤干细胞以来的二十余年间，科学家们对表皮干细胞进行了大量研究，但至今没有建立起表皮干细胞系的报道，从而制约了表皮干细胞研究的深入进行。开展分离纯化表皮干细胞建系及生物学特性研究，为表皮干细胞应于医学临床的组织工程及人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。该项研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的临床应用价值，为无数正受烧伤、刀伤、各种溃烂煎熬及因患有皮肤癌及顽固性皮肤病而感到绝望的病人带来新为生活的希望。寻找可替代角膜缘干细胞的理想种子细胞构建组织工程化上皮，是治疗因疾病及各种理化因素导致双眼角膜缘干细胞缺损（limbal stem cell deficiency，LSCD）而致盲的病人的首要选择。表皮和角膜均来自外胚层，表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）和角膜缘干细胞（limbal stem cells，LSCs）有相似的生物学特性。虽在胚胎发育过程中二者方向不同，但并不是不可逆的。本研究在总结、比较ESCs和LSCs生物学特性的基础上，借鉴成体干细胞可塑性的最新研究成果，提出以ESCs替代LSCs重建LSCD眼表的设想。进行了关中奶山羊表皮干细胞分离纯化、鉴定及体外诱导分化实验；以人羊膜为载体负载ESCs构建组织工程化角膜上皮，并进行了LSCD模型羊自体和同种异体移植。1 山羊ESCs的分离纯化取大小约0.5×0.5cm2山羊耳皮肤，切成0.2×0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿（φ=5.5cm）中，每皿3～4块，进行组织块培养，每2d换液。经3～4d后，从组织块边缘长出上皮样细胞贴附生长，7～12d后，上皮样细胞铺路石样生长，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈集落生长，约4.8d（n=11）后,这些集落直径达50μm～100μm，平均每组织块可得到原代克隆12.8个（n=11）。在解剖镜下挑取这些克隆，用0.25% Trypsin+0.02% EDTA进行适当处理，用玻璃细管将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养（已申报国家专利：200410025938.5），共传25代。经细胞形态学和动力学分析，单个干细胞培养9～12d可形成面积为0.8～1.5mm2 的全克隆，每个全克隆约有1500～2000个细胞。该类细胞直径约8～11um，分裂周期约28～30h，原代克隆形成率为58.9%。2 山羊ESCs鉴定免疫组化染色检测0~9代ESCs ，Oct-4、p63、K19、β1-integrin、α6-integrin、CD71、PCNA的表达特征。结果表明原代ESCs高表达 Oct-4，中度表达CD71、PCNA、K19，不表达β1-integrin、p63。Oct-4的表达随传代次数增加而下降，且需有滋养层细胞共培养维持；ESCs在明胶底物上单层生长时高表达p63、K19、β1-integrin、-<WP=7>α6-integrin、CD71、PCNA。单个ESCs分裂分裂2个细胞时，一细胞Oct-4阳性，另一细胞阴性，这可能与干细胞不对称分裂有关。单个ESCs在明胶上长期培养能形成与在体相似的表皮增殖单位，并有毛囊形成；在含成纤维细胞、骨髓间质干细胞的凝胶上培养85d构建人工皮肤，经自体移植可部分修复重建急性皮肤创伤，并有毛发形成。透射电镜观察显示，人工皮肤分化细胞间有桥粒相连，表皮与基底膜间形成半桥粒，组织切片显示有毛囊形成。3 山羊ESCs体外诱导分化1）用2mM β-Me预诱导，1h后观察细胞呈圆形，有立体感。3h后从胞体长出细丝状突起，4h从胞体伸出的细丝更多更长，14h后，伸出的突起长出分枝，16h后改为正式诱导，正式诱导1h后，神经样纤维更长。48h后换神经细胞条件培养液，培养48h后，细胞连接呈网状，经免疫组织化学检测，诱导的神经细胞表达NSE、NF-200等神经细胞标志，诱导阳性率53.1%.2）3μmol 5-Aza处理ESCs20h，用含心肌条件培养基的培养液培养，16d后有双核成纤维样细胞，细胞聚集成团生长，19d后观察到管状肌肉样结构形成。22d观察到有一细胞团出现微弱收缩，经免疫组化染色细胞团表达α-actin和myoglobin。54d其余细胞团固定进行光镜、电镜观察。组织学检测，诱导的心肌细胞团有类似正常心肌细胞形态，电镜观察显示，细胞内糖原颗粒增多，有大量肌丝形成，但未观察到闺盘样结构。3）表皮干细胞在50μg/mL Vc 、50m mol/Lβ-磷酸甘油和1μmol/L地塞米松诱导20～24h后，细胞呈叁角形或多角形成骨样细胞。不再增殖形成上皮样干细胞克隆，BCIP/NBT底物系统染色为阳性反应，细胞呈淡紫色。在染色后培养物中，可观察到细胞的各种形态，细胞密度较大处重迭，生长的细胞多呈梭形，在细胞密度较小处，单个成骨细胞呈典型的叁角形或多边形，随着培养时间延长，细胞逐渐密集而重迭生长。21d时茜素红染色显示细胞结节阳性，表明所诱导的细胞有成骨细胞类似的形成钙沉淀的特征。扫描电镜观察细胞表面有明显的钙沉积。4 羊膜负载ESCs构建组织工程化角膜上皮表皮干细胞在羊膜上培养15～20min（37℃）就能贴壁，细胞仍呈圆形。低密度培养2~3d（1×105/ml），可见有界限清楚的克隆形成，5~7d细胞长成复层，经免疫组化染色，细胞层表面仍有p63，integrinβ-1阳性细胞。高密度时（1×107/mL），干细胞聚积生长而不分化，与表皮干细胞在3T3滋养层上生长行为类似。转为气液界面培养后，干细胞开始分化，叁周后形成由扁平多角形细胞构成的复层上?
杨丽, 苏宁, 李新实, 刘娟, 郑洪艳[10]2016年在《人皮肤表皮干细胞体外培养与应用研究进展》文中进行了进一步梳理人皮肤表皮干细胞是具有无限增殖潜能以及多向分化能力的专能干细胞,广泛存在于表皮基底层以及毛囊隆突部位。目前,表皮干细胞在分离、纯化、培养等领域都取得了一定进展。表皮干细胞的应用主要在皮肤创面的修复、组织工程皮肤的构建以及基因治疗等领域。本文从干细胞的来源、分离、纯化鉴定、培养与应用等方面进行综述。
参考文献：
[1]. 人表皮干细胞的体外培养及在组织工程皮肤构建中的应用研究[D]. 董蕊. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 表皮干细胞在组织工程创面修复中的应用[J]. 吕淑坤. 中国组织工程研究. 2012
[3]. 山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究[D]. 史明艳. 西北农林科技大学. 2006
[4]. 表皮干细胞构建组织工程皮肤的初步研究[D]. 杨亚东. 第叁军医大学. 2005
[5]. 应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤[D]. 闫迎军. 中国协和医科大学. 2007
[6]. 应用表皮干细胞、间充质干细胞构建复合皮肤及移植实验[D]. 林尊文. 南昌大学. 2009
[7]. 毛囊干细胞和表皮干细胞生物学特性的比较研究[D]. 杨青. 天津医科大学. 2012
[8]. 人胎儿皮脂腺细胞和汗腺细胞的体外分离培养和人胎儿表皮干细胞向毛囊、皮脂腺和汗腺诱导分化的初步研究[D]. 陶克. 第四军医大学. 2005
[9]. 表皮干细胞建系及重建角膜缘干细胞缺损眼表研究[D]. 杨学义. 西北农林科技大学. 2004
[10]. 人皮肤表皮干细胞体外培养与应用研究进展[J]. 杨丽, 苏宁, 李新实, 刘娟, 郑洪艳. 现代生物医学进展. 2016