导读:本文包含了转座活性论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪,反转录转座子,LINE,SINE
转座活性论文文献综述
陈才[1]（2019）在《猪转座组注释、活性分析及其对基因组、转录组和功能基因的影响》一文中研究指出近几十年来,大量生物基因组注释研究表明,转座元件(Transposableelements,TEs)或转座子(Transposons)及其可识别的残余成分,也称为转座组(mobilome),在原核生物和真核生物中广泛分布,对生物的基因组和基因进化发挥重要作用,转座子已成为后基因组时代的研究热点。但关于猪基因组中转座成份的注释还比较粗略,遗漏了大量信息,缺乏对猪转座组的多样性、进化、转录和转座活性及其对功能基因影响等信息的系统解读。同时转座子插入多态分子标记在猪等家畜中研究报道很少,其研究的深度和广度还远不及人类、小鼠和植物。基于此,本论文主要开展了以下研究工作:1.使用多个软件重新挖掘猪基因组中的反转录转座子,并进行了系统分类、进化动力学和插入年龄分析,构建了新的猪重复序列数据库;2.利用新构建的猪重复序列数据库,对猪基因组和转录组进行重新注释,揭示其对基因组和转录组的影响;3.根据RepeatMasker注释结果,探究了转座组对宿主基因(蛋白质编码基因和lncRNA基因)的影响;4.对年轻反转录转座子进行了转录活性、启动子活性和转座活性检测研究;5.以SINE为例,系统解析了转座子插入多态对基因外显子结构变异的影响;6.以生长发育重要候选功能基因GHR为例,系统研究了转座子插入多态对其结构变异的影响及其与表型的关联性。主要结果如下:1.从猪基因组中共鉴定到5937条L1序列,分为四个家族(L1A、L1B、L1C和L1D),53个亚家族。分析表明猪L1具有典型的哺乳动物L1的结构(5'UTR、ORF1、IGR、ORF2和3'UTR),总长度在5837bp到8822bp之间,5'UTR的长度变异较大,在551bp到3254bp之间,大多亚家族的IGR较长(390bp到529bp)。两个ORF比较保守,分别为900bp左右和3800 bp左右。四个家族呈现出不同的进化模式,每一个家族主导一个特定时期的进化活动,结合年龄分析表明,它们较其他LINE年轻,L1D是最年轻的一个家族,L1D1-7代表了最年轻的七个L1D亚家族。在L1D家族中共鉴定到98条结构完整的L1拷贝,含能够编码L1蛋白的两个ORF,可能具有转座活性。2.根据SINE序列的长度、相似性及结构特征,将其分成叁个家族(SINEA、SINEB和SINEC),25个亚家族,均属于tRNA起源。叁个SINE家族的长度差异明显,SINEA的长度在250 bp左右(不含polyA尾),而SINEB和SINEC相对短一些,分别为200 5p左右和120 bp左右。在基因组进化过程中,SINE呈现出叁个扩增波,每个扩增波对应一类SINE转座子家族。年龄分析表明SINEA是最年轻的家族,其中SINEA1、SINEA2、SINEA3代表最年轻的叁个SINE亚家族。3.ERV是LTR类反转录转座子的主要成员,分为18个家族,大多数ERV家族相对较为古老且已失去转座活性,长度大多分布在8.5kb到11 kb之间。而ERV6在近1000万年仍然比较活跃,插入年龄分析表明,ERV6是最年轻的家族,被进一步分为两个亚家族(ERV6A和ERV6B),各包含1个能编码含gag、pol和env的长肽的拷贝,可能具有转座活性。4.转座组注释结果表明,反转录转座子占基因组的37.13%(929.09MB),其中LINE、LTR和SINE分别占基因组的18.52%、7.56%和11.05%。DNA转座子相对而言非常少,仅占基因组的1.99%。最年轻的七个L1亚家族(L1D1-7)只占基因组的0.17%。最年轻的叁个SINE亚家族(SINEA1-3)仅占0.63%,而其中最年轻的两个ERV亚家族(ERV6A和ERV6B)仅占基因组的0.02%。5.通过生物信息分析,超过80%的蛋白编码基因和1ncRNA基因含有转座子的插入,约一半的蛋白编码基因(44.30%)和四分之一(24.13%)的1ncRNA基因含有年轻反转录转座子的插入,并且约一半的蛋白编码基因(43.78%)与反转录转座子产生融合转录本。进一步分析发现,反转录转座子在蛋白编码基因和1ncRNA基因及其他们的转录本中的含量、插入位置和插入方向存在明显的偏好性。6.通过反转录转座活性实验验证了猪基因组中年轻L1具有转座活性。实验证明无论以自身的5'UTR作为启动子还是替换为CMV启动子,都能够在HeLa细胞中发生反转录转座,但转座活性显着低于人的L1(p<0.01)。当把猪L1的IGR替换为人L1的IGR时,猪L1的转座活性显着提高(p<0.05)。7.通过双荧光素酶报告系统证实,来自L1D1、L1D2和L1D7的叁条正向5'UTR和一条来自L1D2的反向5'UTR在不同细胞系中检测到弱启动子活性。ERV6B的正向LTR呈现出较高的启动子活性,而ERV6A的正向LTR和ERV6B的反向LTR呈现出中等启动子活性,ERV6A的反向LTR在本次研究中未检测到启动子活性。8.叁类年轻反转录转座子在多个组织和细胞系中均检测到正反向转录产物。在除生殖器官外的各组织和细胞系中呈现出相似的转录模式并且均有反向转录产物,而在生殖器官中呈现出不同的转录模式,在睾丸中L1的ORF1、ORF2,ERV的gag、pol和env的正向转录以及ERV的LTR的反向转录受到抑制,但可以清楚的检测到L1的5'UTR的反向转录产物。另外,SINE在卵巢中正反向均检测到转录,但在睾丸中却未检测到转录。在大脑和小脑中观察到较高的ERV6-LTR的反向转录水平。9.SINEA、SINEB和SINEC叁个家族在基因组中的插入位点总数为1204691个,其中在基因的外显子区共鉴定到24024个插入位点,其中在编码区(CDS)共鉴定到792个,非编码区23232个,对应约30%的基因。通过比较不同年龄的SINE插入位点多态频率,发现越年轻的SINE亚家族,多态频率越高。对外显子区最年轻的叁个亚家族(SINEA1-3)插入位点进行全面比对分析和实验验证,最终筛选出151个多态位点,多分布在非编码区。10.GHR基因及其侧翼区的转座子注解后发现含有155个转座子插入,绝大部分为反转录转座子(152/98.06%),对应25.63%的序列。其中SINE类转座子最多,有74个,而其中68个来自最年轻的家族SINEA,对应5.64%的序列。对获取的15条来自不同品种基因组的GHR基因及侧翼序列比对后发现34个长度超过50 bp的结构变异,且全部为转座子插入多态引起。选取部分转座子引起的结构变异位点进行实验验证,获得5个转座子插入多态位点,其中1个在大白群体中检测后发现纯合转座子插入基因型(SINE+/+)的个体的校正背膘厚显着小于纯合无插入基因型(SINE-/-)的个体。研究对猪基因组中转座成份进行了系统的挖掘、分类、进化分析、活性分析和注解,并系统评估了转座组对基因组、转录组和功能基因的影响,并进行了分子标记挖掘及应用评估,研究结果为更加全面、深刻的认识和理解猪转座组提供了实验依据和理论基础,并为开发猪基因组新型分子标记,进行重要经济性状的精细定位提供参考。(本文来源于《扬州大学》期刊2019-04-12）
侯菲[2]（2018）在《蔷薇目7个物种间LTR反转录转座子水平转移的鉴定以及转座活性分析》一文中研究指出水平转移(Horizontal transfer,HT)是在不同物种之间所进行的遗传物质交流的方式,在物种进化中扮演着重要角色。转座子(Transposable element,TE)是一段可以在宿主基因组中自由移动的DNA序列,随着基因组时代的到来,研究发现转座子广泛的存在于真核生物基因组中,是基因组的重要组成成分。LTR(Long terminal repeat)反转录转座子,属于RNA介导的反转录转座子(Class I)的主要类型,以“复制—粘贴”的形式进行转座,影响着物种基因组的大小和结构。转座子的水平转移(Horizontal transposable element transfer,HTT)在物种基因组组成、进化等方面都发挥着重要作用,被认为是推动生物革新的重要动力。基于蔷薇目中许多物种已完成全基因组测序,以及转座子水平转移鉴定方法的成熟,研究蔷薇目物种间LTR反转录转座子水平转移以及对转座活性进行分析,可以更好的揭示LTR反转录转座子水平转移对蔷薇目物种基因组大小和组成的影响,诠释蔷薇目物种间的进化关系。本研究利用较为全面的生物信息学方法,对蔷薇目中已完成测序的7个物种分别为桑树(Morus notabilis)、大麻(Cannabis sativa)、枣(Ziziphus jujuba)、野生草莓(Fragaria vesca)、桃(Prunus persica)、苹果(Malus domestica)、梨(Pyrus bretschneideri)的LTR反转录转座子水平转移进行了鉴定,并分析了其在发生水平转移之后的转座活性,主要的研究结果如下:一、蔷薇目中7个物种间LTR反转录转座子水平转移的鉴定对蔷薇目中所选择的已完成全基因组测序的7个物种从基因组着手,鉴定每个物种的LTR反转录转座子,然后通过BLAST比对、SiLiX聚类、CD-hit一致性计算等一系列生物信息学分析方法,鉴定到71个候选的LTR反转录转座子水平转移家族;在这71个候选水平转移家族中鉴定到存在7个家族的LTR反转录转座子序列高度一致,反转录酶(Reverse transcriptase,RT)序列的一致性也明显高于保守基因序列的一致性,而且RT序列的Ka/Ks值与保守基因的Ka/Ks值均小于1,表明其在进化中受到纯化选择,而且我们进一步证明了LTR反转录转座子的系统发生关系以及分化时间均与物种关系存在明显的不一致,表明了在蔷薇目物种间确实发生了LTR反转录转座子的水平转移。最终我们将这7个家族作为在蔷薇目7个物种中鉴定到的LTR反转录转座子水平转移家族,其中存在2个LTR反转录转座子水平转移家族发生于桑树和枣树之间,分别命名为Mn.Zj.1、Mn.Zj.2,而其余5个水平转移家族发生于苹果和梨之间,依次分别命名为Md.Pb.1-5,且LTR反转录转座子发生水平转移的时间在桑树和枣、苹果和梨中分别约为9 Mya(Million years ago)和3 Mya.二、7个LTR反转录转座子水平转移家族的转座活性分析首先我们验证了在蔷薇目7个物种中已鉴定的7个LTR反转录转座子水平转移家族的LTR反转录转座子均具有完整的功能序列结构,然后通过对其拷贝扩增时间进行估计,来进一步证明LTR反转录转座子在发生水平转移之后在新的宿主基因组中是否仍然具有活性以及对水平转移发生的方向做合理的推测。研究结果发现在桑树和枣的两个家族Mn.Zj.1、Mn.Zj.2,在发生水平转移之后,两物种的拷贝的扩增时间均明显的低于水平转移发生的时间,表明LTR反转录转座子在两个宿主基因组中都存在活性,并且在Mn.Zj.1家族枣物种中,LTR反转录转座子的拷贝扩增时间比桑树拷贝扩增时间要晚,进一步推测LTR反转录转座子由桑树水平转移到枣。在苹果和梨两物种的LTR反转录转座子水平转移家族Md.Pb.1-5中,证明得到在Md.Pb.2、Md.Pb.3两个家族中,LTR反转录转座子在发生水平转移之后在宿主基因组中仍然是保持活性的,尤其是在Md.Pb.3家族中存在大量的拷贝扩增现象,而其余的家族均发生了沉默。LTR反转录转座子水平转移后在宿主基因组中发生的拷贝扩增现象,对物种基因组的组成、进化等均会产生深远影响。(本文来源于《西南大学》期刊2018-05-18）
张赞一[3]（2018）在《毛竹LTR反转录转座子-PHRE6的克隆与转座活性鉴定以及转座监测系统的构建》一文中研究指出长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的DNA序列,因两端具有长末端重复序列而得名。多数LTR反转录转座子能够感受外界环境的变化,具有转录激活特性和转座激活特性。本研究从毛竹基因组中克隆出一条完整的LTR反转录转座子,命名为PHRE6(Phyllostachys edulis retrotransposons 6),分析和鉴定了该转座子的结构特性,并观察了胁迫下的毛竹LTR转座子在RNA水平和DNA水平的变化来鉴定该转座子的活性。1.利用已公布的毛竹基因组数据库,通过LTR-STRUC软件查找基因组中具有完整结构的LTR转座子。依据结构域完整性和LTR同源性,选择了一个LTR转座子PHRE6。该转座子全长为5620 bp,核苷酸序列编码区含有4821 bp的开放阅读框,具有转座需要的GAG(Retrotransposon gag protein,GAG)和完整的Pol(Polymerase,Pol)保守结构域,具有PBS(Prime bingding site,PBS)、PPT(Polypurine tract,PPT)及两端的LTR序列;根据Pol编码区中INT(Integrase,INT)、RT(Reverse transcriptases,RT)、RH(Ribonuclease H,RH)、PR(Pepsin-like aspartate proteases,PR)的排列顺序,可以判断PHRE6属于LTR反转录转座子中的Ty1/Copia超家族;两端LTR序列同源性为99.08%,插入时间为34.62万年;LTR序列中含有糖代谢反应和胚乳表达的顺式调控元件以及光响应元件。2.为了进一步确认PHRE6转座子的转录活性及组织特异性,通过荧光定量PCR检测了叁个结构域在毛竹根、笋以及叶片叁个不同组织及DNA甲基化抑制剂与四个胁迫处理下的毛竹实生苗(包括辐照、高温、低温、高盐处理)转录水平的变化,发现PHRE6在叶子中的表达量明显高于根和笋中的表达量;在叁个梯度的辐照处理后的表达量相对未经处理的野生型来说有所下调,在DNA甲基化抑制剂处理后和高温(42℃)、低温(4℃)、高盐(100mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L Na Cl溶液)胁迫处理下表达水平均有显着的提高,该结果能够说明PHRE6是一个具有转录活性的反转录转座子,可能参与毛竹逆境响应过程。3.为了进一步确认PHRE6转座子的转座活性,通过SYBR Green荧光定量PCR检测PHRE6在毛竹基因组中拷贝数的变化。研究发现:高温(42℃)、低温(4℃)、叁个梯度的高盐,50μmol/L、150μmol/L DNA甲基化抑制剂处理下拷贝数有增加。这些结果分析表明PHRE6转座子的转座活性能够在DNA甲基化抑制的情况下和一定胁迫下被激活。4.,本研究构建了一个酵母检测系统来研究LTR反转录转座子(PHRE2)的转座机制,相较于以往通过检测插入多态性,拷贝数等的方法更为直观。本方法是通过构建针一个携带编码区和一个携带有反向内含子的组氨酸报告基因的LTR的载体,将两个重组载体转化至酵母内,通过缺陷培养基的筛选来证明并筛选转座子的转座,并经过基因组高通量测序分析转座子在酵母基因组中的新的插入位点。综上,本研究从毛竹基因组中克隆出一条完整的LTR反转录转座子PHRE6,分析和鉴定了该转座子的结构和特性,并观察了胁迫下的毛竹LTR转座子在RNA水平和DNA水平的变化来鉴定该转座子的活性,结果说明PHRE6是一条具有潜在激活活性的LTR反转录转座子。同时构建更为准确直接的酵母监测系统鉴定LTR反转录转座子的转座活性。(本文来源于《浙江农林大学》期刊2018-04-01）
赵茜[4]（2018）在《密码子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及其酶活性研究》一文中研究指出转座子(transposon)是一类可以在基因组中改变插入位置的遗传因子,能够通过水平转移(horizontal transfer)的方式在自然界的不同物种间扩散传播。转座子所编码的活性转座酶能够启动其在生物体内的转座过程,然而脊椎动物中的一些转座子由于突变等原因大多数均已失去活性,成为了非自主性转座子,从而不能完成整个转座过程。2008年,在不同的金鱼品系中通过筛选,最终获得金鱼Tgf2转座子,它是继第一类具有自主转座活性的青鳉Tol2之后的第二类具有自主转座活性的转座子,属于hAT(hobo-AC-Tam)超家族。Tgf2转座子能够编码完整、具有自主转座活性的转座酶,在鱼类转基因、基因捕获等方面具有广阔的应用前景。本实验室从金鱼胚胎中分离得到了7种不同的Tgf2转座子mRNA转录本,同时得到了叁种氨基酸长度分别为686、650和577的Tgf2转座酶。目前这叁种长度的转座酶均已在E.coli中表达,为了进一步提高表达量及其表达稳定性,依据大肠杆菌对密码子的偏好性和简并性对686长度的转座酶密码子进行了优化。本研究目的则是利用pET28a(+)作为质粒载体,E.coli BL21(DE3)作为宿主菌,表达出密码子优化后的686长度Tgf2转座酶,并研究能够保存纯化后的转座酶稳定性的方法。同时用含有不同重复序列数目的探针研究其DNA结合活性及特异性,从而为构建具有更高活性的转座酶提供帮助。本实验主要分为四个部分。第一部分为重组表达载体的构建,首先依据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对金鱼Tgf2转座酶的密码子进行优化,优化后的Tgf2转座酶命名为Tgf2-TPase~(83)。用限制性内切酶Bam I和XholI分别对含有Tgf2-TPase~(83)基因序列的克隆载体和表达载体pET28a(+)双酶切,用T_4 DNA连接酶将它们连接起来。根据转座酶和载体的特点设计合适的引物,PCR检测,用基因测序方法鉴定连接后的序列,序列对比结果表明,重组表达载体pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)构建成功。第二部分为重组载体pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)的原核表达、纯化和质谱鉴定。本实验中选择BL21(DE3)作为表达的宿主菌,使得重组载体质粒在BL21(DE3)中表达,表达条件为温度30℃、IPTG浓度1.0 mM、诱导时间6 h、转速150 rpm,用SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。实验结果表明,在蛋白分子量大约为79.6 kDa处不但有相应的条带出现,而且表达后此处的蛋白条带有明显加深,所以目的蛋白表达成功。在SDS-PAGE中可以表达出可溶性蛋白,故我们采用反复冻融、超声破碎、离心取上清的方法用His Trap~(TM) HP柱子对重组蛋白纯化,分别用20 mM、40 mM、500 mM的咪唑对目的蛋白进行洗脱,将最终收集的纯化样品用SDS-PAGE分析,割胶并进行质谱鉴定。结果表明,密码子优化后的Tgf2-TPase~(83)表达量提高到了6.3%,纯度提高到了85%。同时,质谱结果表明,重组蛋白Tgf2-TPase~(83)即为金鱼Tgf2转座酶。第叁部分为重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的保存稳定性研究。本实验中选取了四种不同的保存方法,分别为:加入20%甘油、直接冻干、加入冻干保护剂8%蔗糖和4%甘露醇后冷冻干燥,均置于-80℃中进行保存。用质粒pTgf2-EF1α-EGFP检测分别保存7 d和14 d后Tgf2-TPase~(83)的DNase活性,用琼脂糖凝胶电泳检测,通过BandScan扫描,将质粒的变化情况进行量化处理,得到不同的消化速度。结果表明,以新鲜酶液的DNase活性作为对照,20%甘油有助于保存Tgf2-TPase~(83)酶活性,其他叁种保存方法都没有20%甘油的保存效果好。第四部分为重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性及其特异性研究。首先,对用20%甘油保存的Tgf2-TPase~(83)酶进行DNA结合活性研究;其次,金鱼Tgf2转座子的重复序列包括5’AGTAA3’和5’GTACT3’,我们从Tgf2转座子左臂末端设计了四种含有不同重复序列数目的探针,分别为P_H,P_(M1),P_(M2),P_L,其中探针P_L中包含有与原始重复序列不同的碱基为5’GGTAA3’。实验中我们用葡聚糖凝胶层析来判断Tgf2-TPase~(83)是否具有DNA结合活性,主要是根据蛋白与探针结合后的紫外吸收值是否有增加。同时,用蛋清溶菌酶作为阴性对照,判断Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是否具有特异性。结果表明,用20%甘油保存7 d、14 d、30 d时的Tgf2-TPase~(83)酶是具有DNA结合活性的;含有不同重复序列数目的探针与重组蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是不同的,重复序列数目越多,其结合活性越高。另外,阴性对照实验结果表明,Tgf2-TPase~(83)的DNA结合活性是具有特异性的。通过密码子优化后的Tgf2转座酶不仅增加了其表达量(>6.3%),而且纯化后其纯度(>85%)也得到了提高。采用原核表达系统获得的可溶性重组蛋白Tgf2-TPase~(83)不仅为鱼类转基因提供了更加有效的手段,而且也促进了转座子基因捕获、基因捕获和鱼类遗传育种等方面的应用。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2018-04-01）
司蕊蕊[5]（2017）在《金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及体外活性研究》一文中研究指出转座子是一类能够在基因组中移动的片段,其过程叫做转座。随着多个基因组测序计划的进行,原核和真核生物界陆续发现众多转座子,转座子因此被认为是自然界变异和进化的重要推动力之一。自主的DNA转座子能编码活性转座酶以介导转座过程,但由于受到来自宿主的钝化作用,到目前为止在自然界生物体内发现的具有天然活性的转座子很少,Tgf2是发现的第二个具有天然活性的脊椎动物转座子。Tgf2属于h AT超家族,它首先在我国的金鱼(Carassius auratus)中发现,能编码完整、具有活性的转座酶,能够介导转座,是有潜力的鱼类遗传学工具之一,因此在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释及育种等有的广泛的应用。本研究室得到的Tgf2转座子能够编码3种Tgf2转座酶。目前这3种不同长度的转座酶在E.coli Rosetta1(DE3)内得到表达。鉴于E.coli BL21(DE3)菌株表达外源蛋白有更高的效率和稳定性,所以本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化并合成了金鱼Tgf2转座酶编码区基因,与p ET-28a(+)载体重组,采用E.coli BL21(DE3)作为宿主菌株,以期获得Tgf2转座酶的高效表达。本研究实验分为五个部分。第一部分内容为Tgf2转座酶的生物信息学分析。通过SOPMA、I-TASSER服务器,分析模拟转座酶的二级结构、结构域以及叁级结构,找到转座酶的催化元件,分析与转座酶活性相关的功能域。第二部分内容为金鱼Tgf2转座酶原核表达载体的构建。根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化并合成了金鱼Tgf2转座酶编码区基因Tgf2TP Plus,对Tgf2TP Plus基因序列所在的克隆载体p UC57-simple-Tgf2TP Plus和表达载体p ET-28a(+)进行Bam HI和XhoI位点的双酶切,回收之后通过T4DNA连接酶连接,转化到E.coli DH5α细胞内,根据重组载体序列设计合适的引物,通过PCR扩增,Bio Edit测序比对。结果显示,成功构建了重组载体p ET-28a(+)-Tgf2TP Plus。第叁部分内容为重组蛋白的诱导表达。从E.coli DH5α细胞内提取重组质粒p ET-28a(+)-Tgf2TP Plus,转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达重组蛋白。结果显示,在低吸光度(OD600=0.3-0.4)和低温(22℃)的条件下没有重组蛋白的表达,在37℃、OD600为0.5条件下,才会有重组蛋白的表达。之后,对时间、IPTG浓度和温度进行优化。结果表明,在诱导时间0-6 h之间,重组蛋白的表达量随着时间的增长而逐渐增加;在6 h-10 h之间,重组蛋白的表达量随着时间的增长并没有明显的变化,并且由于6 h时菌体的浓度较高,所以本实验采取诱导时间为6 h。诱导剂浓度为1.0 mmol/L时目的蛋白的表达量最高,本实验采取常规表达诱导剂浓度1.0 mmol/L。在28℃-37℃温度范围内,重组蛋白的表达在28℃和30℃表达量较高,由于30℃菌体浓度较大,所以本实验采取30℃诱导表达。因此,本实验选择30℃、OD600=0.5,1.0 mM IPTG浓度诱导表达6 h。SDS-PAGE电泳分析,在约70 kDa处有很深的蛋白条带,和预测的已知分子量接近。第四部分内容为重组蛋白的纯化和鉴定。通过SDS-PAGE分析确定E.coli BL21(DE3)菌株能够表达出可溶的重组蛋白。表达的重组蛋白带有His?Tag标签,可以利用镍柱亲和层析的方法将重组蛋白纯化出来。因此,收集诱导表达菌体,细胞破碎后上清液通过镍柱纯化,收集的目的组分进行SDS-PAGE分析。结果表明,得到了较高纯度的重组蛋白,并且重组蛋白的分子量与预测的已知分子量接近。通过MALDI-(TOF)/TOF串联质谱鉴定,确定表达的重组蛋白即为金鱼的Tgf2转座酶。第五部分内容为金鱼Tgf2转座酶体外活性的研究。主要包括DNA结合活性和消化活性。对于DNA结合活性,本实验采取了葡聚糖凝胶层析的方法,DNA结合活性的判断是根据转座酶和DNA探针结合的复合物,使紫外吸收值发生变化。消化活性是通过质粒和转座酶混合反应,利用琼脂糖凝胶电泳检测,观察质粒的变化。实验采用Tgf2左臂的末端重复序列作为DNA探针。结果表明,金鱼的Tgf2转座酶和探针能够发生特异性结合,且结合活性不受探针浓度的影响;金鱼的Tgf2转座酶具有体外切割活性。采用原核表达体系不仅获得高效重组Tgf2转座酶,也为其作为工具酶应用于鱼类生物学研究奠定了必要的基础,并且为得到高活性的转座酶提供了可能。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2017-05-01）
侯靖威[6]（2016）在《SAMHD1蛋白核质穿梭对于抑制LINE-1转座活性的重要作用研究》一文中研究指出SAMHD1蛋白作为宿主细胞的天然抗病毒因子,以其多种多样的生物学功能和复杂的作用机制,一直以来都是分子生物学领域关注的热点。随着近几年研究的不断深入,除了SAMHD1基因突变可以导致AGS疾病发生,以及SAMHD1可以抑制HIV对宿主细胞的感染外,又新发现了SAMHD1可以抑制逆转录转座子LINE-1转座活性的能力。LINE-1作为哺乳动物中广泛存在的逆转录转座子,在人类基因组中的数量非常巨大。虽然在正常状态下LINE-1的转座活性非常低,不会对基因组的稳定构成大的威胁,但是LINE-1仍然与许多基因变异以及疾病发生有关。一旦SAMHD1失去对LINE-1的抑制作用,可能会造成严重的后果。然而目前对于SAMHD1抑制LINE-1的作用机制,还没有办法下结论。根据已有的实验结果,我们认为SAMHD1可能是通过下调LINE-1的ORF2蛋白表达,进而降低ORF2介导的LINE-1 RNA的逆转录水平,来发挥对LINE-1的抑制作用。而在研究过程中,我们发现SAMHD1的不同突变对于LINE-1的抑制作用有明显差异。为了研究这种差异产生的原因,我们进行了核质分离实验,结果证明SAMHD1对LINE-1的抑制作用应该是发生在细胞质中的。所以我们推测虽然SAMHD1含有核定位信号,能够定位在细胞核中,但是也会通过某种机制进行核质穿梭,进入细胞质中实现对LINE-1的抑制作用。核质穿梭对于SAMHD1抑制LINE-1非常重要,SAMHD1穿梭到细胞质中是发挥抑制LINE-1作用的前提。核质穿梭这一推测为SAMHD1生物学功能以及作用机制的研究提供了全新的思路,同时也为相关疾病的预防与治疗手段研究提供了理论基础,具有重要的意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-04-01）
王菁菁[7]（2016）在《烟草基因组一类微小倒置重复转座元件（MITE）的转座活性及真应用》一文中研究指出微小倒置重复转座元件(miniature inverted repeat transposable element. MITE)是真核基因组中含量丰富的一类非自主转座元件,且与许多重要生物学事件密切相关。目前为止,仅在极少数物种中鉴定出几个MITE家族仍具备活跃的转座活性,如此便无法充分地获知MITE转座的分子细节以解析其转座机制。本研究选择烟草(Nicotiana tabacum)基因组为研究对象,首先应用生物信息学方法分析完成了烟草MITE同源序列的种类和数量分布状况,包括MITE元件群的结构特征及相关信息；再者,通过检测MITE元件群在不同烟草品系中的多态性差异,获得其中一个元件(TMi1)可能具有转座活性的初步证据；其后,在建立了二组适用于MITE转座活性检测的生物学表型的基础上,采用转座子显示技术及后续验证实验,最终确认TMi1元件于目前仍具有转座活性。这是烟草基因组中首次发现一个活跃转座的MITE,拓展了人们对具转座活性植物种类的认识范围,有助于充分认识和挖掘烟草基因组中丰富的转座子种类和资源,也为理解和定义基因组进化以及生物多样性形成的遗传规律提供有用线索。分子标记遗传连锁图是基因定位、图位克隆、分子标记辅助选择育种的基础。普通烟草基因组较大,分子标记多态性水平较低,为遗传连锁图构建、基因定位等相关研究造成较大困难。由于MITE具有高拷贝数和偏爱插入到基因邻近位点等特点,可作为理想的分子标记。本研究在总共受检的9个的烟草栽培品系中,有4个品系被检测得到存在着明显的DNA多态性(分别为PVH19、云烟96、云烟100、云烟108),这意味着通过MITE元件可构建高密度遗传连锁图谱,进行抗病基因定位,进而对抗病基因在分子水平进行鉴定和筛选,有利于提高育种效率。(本文来源于《浙江大学》期刊2016-01-03）
杜瑾,张晓青,王建艳,郝建安,王静[8]（2015）在《1株来自海洋的芽胞杆菌dhs-330转座突变库的构建及表面活性相关基因的克隆》一文中研究指出为研究产生物表面活性剂的海洋芽胞杆菌dhs-330合成活性产物的分子机制,应用质粒p IC333介导的mini-Tn10转座子随机突变技术,构建了芽胞杆菌dhs-330的突变体库。通过表面活性测定和反向PCR克隆,从300个突变株中筛选出产表面活性剂水平提高的突变株2株,分别在ycs G和yvk C基因发生插入突变;表面活性降低的突变株4株,分别在fen C、yrk F、kin E和sig D基因发生插入突变。这些基因可能与芽胞杆菌dhs-330中表面活性剂的合成代谢和调控有关。(本文来源于《微生物学杂志》期刊2015年05期）
骆红梅,王菁菁,马文广,李婵媛,李永平[9]（2015）在《烟草基因组一类微小倒置重复转座元件(MITE)目前仍具转座活性》一文中研究指出微小倒置重复转座元件(miniature inverted repeat transposable element,MITE)是真核基因组中含量丰富的一类非自主转座元件,且与许多重要生物学事件密切相关。目前为止,仅在极少数物种中鉴定出几个MITE家族仍具备活跃的转座活性,如此便无法充分地获知MITE转座的分子细节以解析其转座机制。本研究选择烟草(Nicotiana tabacum)基因组为研究对象,首先应用生物信息学方法分析完成了烟草MITE同源序列的种类和数量分布状况,包括MITE元件群的结构特征及相关信息;再者,通过检测MITE元件群在不同烟草品系中的多态性差异,获得其中一个元件(TMi 1)可能具有转座活性的初步证据;其后,在建立了二组适用于MITEs转座活性检测的生物学表型的基础上,采用转座子显示技术及后续验证实验,最终确认TMi 1元件于目前仍具有转座活性。这是烟草基因组中首次发现一个活跃转座的MITE,拓展了人们对具转座活性植物种类的认识范围,有助于充分认识和挖掘烟草基因组中丰富的转座子种类和资源,也为理解和定义基因组进化以及生物多样性形成的遗传规律提供有用线索。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2015年09期）
梁志滨,梁臣,耿运琪[10]（2013）在《宿主限制长散布元件转座活性的机制》一文中研究指出转座子约占人类基因组的45%,对基因组的结构与功能造成了重大的影响.一部分转座子现在仍然具有活性,它们的转座能引发疾病.长散布元件(long interspersed element-1,LINE-1)是现今在人类基因组中发现的唯一具有活性并能自主转座的转座子,并能介导非自主转座的元件进行转座.近年来,LINE-1的研究有新的突破,本文简述了LINE-1的结构、转座机制及对基因组的影响,重点总结和分析宿主对LINE-1的限制机制.由于LINE-1的生活周期与逆转录病毒有相似之处,也希望能够为宿主抗病毒的研究提供线索.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2013年08期）
转座活性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
水平转移(Horizontal transfer,HT)是在不同物种之间所进行的遗传物质交流的方式,在物种进化中扮演着重要角色。转座子(Transposable element,TE)是一段可以在宿主基因组中自由移动的DNA序列,随着基因组时代的到来,研究发现转座子广泛的存在于真核生物基因组中,是基因组的重要组成成分。LTR(Long terminal repeat)反转录转座子,属于RNA介导的反转录转座子(Class I)的主要类型,以“复制—粘贴”的形式进行转座,影响着物种基因组的大小和结构。转座子的水平转移(Horizontal transposable element transfer,HTT)在物种基因组组成、进化等方面都发挥着重要作用,被认为是推动生物革新的重要动力。基于蔷薇目中许多物种已完成全基因组测序,以及转座子水平转移鉴定方法的成熟,研究蔷薇目物种间LTR反转录转座子水平转移以及对转座活性进行分析,可以更好的揭示LTR反转录转座子水平转移对蔷薇目物种基因组大小和组成的影响,诠释蔷薇目物种间的进化关系。本研究利用较为全面的生物信息学方法,对蔷薇目中已完成测序的7个物种分别为桑树(Morus notabilis)、大麻(Cannabis sativa)、枣(Ziziphus jujuba)、野生草莓(Fragaria vesca)、桃(Prunus persica)、苹果(Malus domestica)、梨(Pyrus bretschneideri)的LTR反转录转座子水平转移进行了鉴定,并分析了其在发生水平转移之后的转座活性,主要的研究结果如下:一、蔷薇目中7个物种间LTR反转录转座子水平转移的鉴定对蔷薇目中所选择的已完成全基因组测序的7个物种从基因组着手,鉴定每个物种的LTR反转录转座子,然后通过BLAST比对、SiLiX聚类、CD-hit一致性计算等一系列生物信息学分析方法,鉴定到71个候选的LTR反转录转座子水平转移家族;在这71个候选水平转移家族中鉴定到存在7个家族的LTR反转录转座子序列高度一致,反转录酶(Reverse transcriptase,RT)序列的一致性也明显高于保守基因序列的一致性,而且RT序列的Ka/Ks值与保守基因的Ka/Ks值均小于1,表明其在进化中受到纯化选择,而且我们进一步证明了LTR反转录转座子的系统发生关系以及分化时间均与物种关系存在明显的不一致,表明了在蔷薇目物种间确实发生了LTR反转录转座子的水平转移。最终我们将这7个家族作为在蔷薇目7个物种中鉴定到的LTR反转录转座子水平转移家族,其中存在2个LTR反转录转座子水平转移家族发生于桑树和枣树之间,分别命名为Mn.Zj.1、Mn.Zj.2,而其余5个水平转移家族发生于苹果和梨之间,依次分别命名为Md.Pb.1-5,且LTR反转录转座子发生水平转移的时间在桑树和枣、苹果和梨中分别约为9 Mya(Million years ago)和3 Mya.二、7个LTR反转录转座子水平转移家族的转座活性分析首先我们验证了在蔷薇目7个物种中已鉴定的7个LTR反转录转座子水平转移家族的LTR反转录转座子均具有完整的功能序列结构,然后通过对其拷贝扩增时间进行估计,来进一步证明LTR反转录转座子在发生水平转移之后在新的宿主基因组中是否仍然具有活性以及对水平转移发生的方向做合理的推测。研究结果发现在桑树和枣的两个家族Mn.Zj.1、Mn.Zj.2,在发生水平转移之后,两物种的拷贝的扩增时间均明显的低于水平转移发生的时间,表明LTR反转录转座子在两个宿主基因组中都存在活性,并且在Mn.Zj.1家族枣物种中,LTR反转录转座子的拷贝扩增时间比桑树拷贝扩增时间要晚,进一步推测LTR反转录转座子由桑树水平转移到枣。在苹果和梨两物种的LTR反转录转座子水平转移家族Md.Pb.1-5中,证明得到在Md.Pb.2、Md.Pb.3两个家族中,LTR反转录转座子在发生水平转移之后在宿主基因组中仍然是保持活性的,尤其是在Md.Pb.3家族中存在大量的拷贝扩增现象,而其余的家族均发生了沉默。LTR反转录转座子水平转移后在宿主基因组中发生的拷贝扩增现象,对物种基因组的组成、进化等均会产生深远影响。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转座活性论文参考文献
[1].陈才.猪转座组注释、活性分析及其对基因组、转录组和功能基因的影响[D].扬州大学.2019
[2].侯菲.蔷薇目7个物种间LTR反转录转座子水平转移的鉴定以及转座活性分析[D].西南大学.2018
[3].张赞一.毛竹LTR反转录转座子-PHRE6的克隆与转座活性鉴定以及转座监测系统的构建[D].浙江农林大学.2018
[4].赵茜.密码子优化后的金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及其酶活性研究[D].上海海洋大学.2018
[5].司蕊蕊.金鱼Tgf2转座酶的原核表达、纯化及体外活性研究[D].上海海洋大学.2017
[6].侯靖威.SAMHD1蛋白核质穿梭对于抑制LINE-1转座活性的重要作用研究[D].吉林大学.2016
[7].王菁菁.烟草基因组一类微小倒置重复转座元件（MITE）的转座活性及真应用[D].浙江大学.2016
[8].杜瑾,张晓青,王建艳,郝建安,王静.1株来自海洋的芽胞杆菌dhs-330转座突变库的构建及表面活性相关基因的克隆[J].微生物学杂志.2015
[9].骆红梅,王菁菁,马文广,李婵媛,李永平.烟草基因组一类微小倒置重复转座元件(MITE)目前仍具转座活性[J].农业生物技术学报.2015
[10].梁志滨,梁臣,耿运琪.宿主限制长散布元件转座活性的机制[J].生物化学与生物物理进展.2013