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猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定和功能研究

2020-12-02阅读(700)

猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定和功能研究

论文摘要

近年来,由于毒素-抗毒素（Toxin-antitoxin,TA）系统在细菌和古生菌基因组中大量的广泛存在,然对其生理功能的认识却十分有限,因此引起了越来越多的关注。TA系统最初发现于大肠杆菌低拷贝质粒中,利用一种称为是“分裂后杀伤机制”或“成瘾模块”的机制发挥质粒的稳定性功能。TA系统在影响细菌自身的生长调控、生物被膜的形成、毒力或其他不利条件的应激反应中发挥重要作用。这些模块已经在大肠杆菌和其他各种细菌中被鉴定,但其功能尚需进行深入研究。此外,TA系统存在于猪链球菌（Streptococcus suis）这一重要人兽共患病原菌基因组中,却鲜有报道。尽管目前关于猪链球菌致病性的研究有很多,但对其发病机制的认识仍然非常有限。因此,在本研究中,我们主要开展了猪链球菌2型yefM-yoeB TA系统的鉴定和功能研究,来探讨TA系统与猪链球菌致病性的关系。具体研究内容如下:1.猪链球菌2型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB的鉴定生物信息学分析显示猪链球菌2型YefM和YoeB与大肠杆菌、肺炎链球菌的具有极高的同源性,且yefM-yoeB染色体位点存在于猪链球菌的大多数血清型菌株的基因组中。过量产生猪链球菌YoeB毒素会抑制大肠杆菌的生长,并且猪链球菌YoeB毒素的毒性可以被猪链球菌和肺炎链球菌而非大肠杆菌产生的YefM抗毒素中和。更重要的是,将猪链球菌yefM-yoeB系统导入不同种属的大肠杆菌后能影响细胞的正常生长。利用Pull down和Western blot实验证实猪链球菌的毒素蛋白YoeB能与其同源的抗毒素蛋白YefM在体内发生相互作用,并形成稳定的复合物YefM-YoeB。通过β-半乳糖苷酶活性检测实验,表明YefM或YefM-YoeB能够负向自动调节TA操纵子活性,抑制其转录活性。以上结果表明猪链球菌2型中有一对有活性的yefM-yoeB毒素-抗毒素系统。2.缺失yefM-yoeB没有显著影响猪链球菌2型对小鼠的致病性针对目前yefM-yoeB系统模型在细菌致病性方面研究未见深入报道,因此急需进行有关yefM-yoeB影响猪链球菌的生长特性和功能方面的研究。我们利用同源重组的方法成功构建了yoeB毒素基因缺失突变株?yoeB、yefM-yoeB基因缺失突变株?yefM-yoeB和互补菌株C?yefM-yoeB;经多次尝试均未得到敲除yefM抗毒素基因的缺失突变株。突变株?yoeB和?yefM-yoeB较野生株在生长,溶血活性方面没影响。缺失yefM-yoeB不影响猪链球菌2型在小鼠感染模型中的存活或组织定植能力。以上数据表明,猪链球菌yefM-yoeB是一个有活性且与毒力无关的TA系统。3.位于YefM上的Lys64位点改变影响猪链球菌2型的氧化应激反应和致病性利用SWISS-MODEL模拟YefM-YoeB毒素与抗毒蛋白的结构,初步假定其相互作用的关键位点。通过定点突变构建四株假定的抗毒素YefM无活性突变体CΔyefM（A54S）-yoeB、CΔyefM（N58A）-yoeB、CΔyefM（L61A）-yoeB和CΔyefM（K64A）-yoeB。探讨野生株WT、突变株、互补菌株和四株无活性突变体在生长、氧化应激、对小鼠的致病力和细胞毒性的影响。初步研究结果显示CΔyefM（K64A）-yoeB在正常生长、氧化应激、对小鼠的致病力和对hBMEC和HEp-2细胞毒性方面都显著降低;CΔyefM（L61A）-yoeB对HEp-2细胞毒性方面低于野生菌株和互补菌株。结果表明YefM的Lys64位点可能是YefM-YoeB相互作用的关键位点。本研究不仅在猪链球菌2型中首次鉴定了yefM-yoeB系统,同时也丰富了对yefM-yoeB系统的认识。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 1 文献综述
  •   1.1 猪链球菌概述
  •     1.1.1 猪链球菌的流行病学
  •     1.1.2 猪链球菌病的治疗和防控
  •     1.1.3 猪链球菌毒力因子相关的致病性研究进展
  •   1.2 毒素-抗毒素系统
  •     1.2.1 毒素-抗毒素系统具有重要的生物学功能
  •     1.2.2 毒素-抗毒素系统影响细菌致病性
  •     1.2.3 毒素-抗毒素系统调控生物膜形成
  •     1.2.4 毒素-抗毒素系统调控持留菌形成
  •     1.2.5 毒素-抗毒素系统调控细菌的适应性
  •     1.2.6 毒素-抗毒素系统的发展前景
  •   1.3 Ⅱ型毒素-抗毒素系统
  •     1.3.1 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的种类
  •     1.3.2 Ⅱ型毒素-抗毒素系统的研究进展
  •     1.3.3 猪链球菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统
  • 2 研究目的与意义
  • 3 实验材料与方法
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 菌株、质粒和培养条件
  •     3.1.2 实验相关试剂
  •     3.1.3 本研究所用引物
  •     3.1.4 实验动物和细胞
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 猪链球菌2 型基因组DNA的提取
  •     3.2.2 猪链球菌2型RNA的提取、RT-PCR和 qRT-PCR
  •     3.2.3 重组质粒的构建
  •     3.2.4 大肠杆菌生长曲线的测定
  •     3.2.5 YefM-YoeB蛋白的克隆、表达和纯化
  •     3.2.6 小鼠血清抗体的制备和Western blot检测
  •     3.2.7 抗毒素或毒素-抗毒素复合物对TA操纵子的自动调节
  •     3.2.8 猪链球菌2 型基因缺失突变株的构建
  •     3.2.9 互补菌株C?yefM-yoeB的构建
  •     3.2.10 突变株、野生株和互补菌株的生物学特性研究
  •     3.2.11小鼠感染实验
  •     3.2.12 猪全血杀菌实验
  •     3.2.13 毒素-抗毒素定点突变
  •     3.2.14 在不同条件下生长曲线的测定
  •     3.2.15 BALB/c小鼠感染实验
  •     3.2.16 细胞实验
  •     3.2.17 统计分析
  • 4 结果与分析
  •   4.1 猪链球菌2型YEFM-YOEB II型毒素-抗毒素系统的鉴定
  •     4.1.1 生物信息学分析
  •     4.1.2 YoeB、YefM、YefM-YoeB对大肠杆菌的生长影响
  •     4.1.3 猪链球菌YoeB的毒性作用
  •     4.1.4 引入猪链球菌yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
  •     4.1.5 毒素抗毒素形成复合物
  •     4.1.6 毒素抗毒素系统的自我调控
  •   4.2 猪链球菌2 型缺失毒素-抗毒素系统YEFM-YOEB的影响
  •     4.2.1 自杀性重组载体的构建和鉴定
  •     4.2.2 猪链球菌2型yoeB基因缺失突变株的鉴定
  •     4.2.3 猪链球菌2型yefM-yoeB基因缺失突变株和互补菌株的筛选与鉴定
  •     4.2.4 突变株和野生株体外生长特性的比较
  •     4.2.5 突变株和野生株的溶血活性比较
  •     4.2.6 突变株和野生株的耐药性检测
  •     4.2.7 猪链球菌2 型缺失yefM-yoeB对小鼠的致病力的影响
  •     4.2.8 缺失yefM-yoeB影响猪链球菌2 型在猪全血中的增殖情况
  •   4.3 毒素-抗毒素蛋白相互作用的关键位点
  •     4.3.1 YefM-YoeB蛋白结构解析
  •     4.3.2 YoeB活性位点的验证
  •     4.3.3 YefM点突变影响大肠杆菌的生长
  •     4.3.4 YefM点突变影响猪链球菌2 型的生长
  •     4.3.5 YefM点突变影响猪链球菌2 型的应激反应
  •     4.3.6 YefM点突变影响猪链球菌2 型在小鼠体内的存活
  •     4.3.7 YefM点突变后影响细胞毒性
  • 5 讨论
  •   5.1 课题的选择
  • Ssu和异源YefMSpn中和,不被YefMEco中和'>  5.2 猪链球菌2 型毒素YoeB可以被同源YefMSsu和异源YefMSpn中和,不被YefMEco中和
  •   5.3 猪链球菌2 型毒素-抗毒素yefM-yoeB影响大肠杆菌生长
  •   5.4 YefM-YoeB蛋白的表达问题及猪链球菌2 型缺失抗毒素基因致死原因
  •   5.5 猪链球菌2 型毒素-抗毒素系统yefM-yoeB对抗生素耐药性的影响
  •   5.6 小鼠模型评价猪链球菌2型毒素-抗毒素系统缺失的致病性问题
  •   5.7 YefM-YoeB晶体解析及相互作用的关键位点影响猪链球菌2 型的氧化应激能力和致病性
  • 6 结论与展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   补充材料
  •   个人简历
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 徐加利

    导师: 贝为成

    关键词: 猪链球菌,毒素抗毒素系统,氧化应激反应,毒力

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 华中农业大学

    分类号: S852.611

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000025

    总页数: 113

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