杨应华[1]2003年在《人源多肽抗生素LL-37/hCAP-18的初步研究》文中研究指明天然免疫是机体防御系统的第一道防线。多肽抗生素既是天然免疫的重要组成部分，在宿主抵抗病原物入侵的防御反应中起重要作用；也是开发新型抗生素的理想候选物，在医药工业和培育抗病动物、植物新品种上有着广阔的应用前景。LL-37／hCAP-18是迄今在人体发现的多肽抗生素cathelicidin家族的唯一成员，也是人体内唯一的双亲性α-螺旋结构的多肽抗生素，在血细胞和上皮细胞中广泛表达。LL-37具有广谱抗菌作用，中和内毒素作用和趋化作用。很多感染性疾病与LL-37低表达或功能失活有关。越来越多的资料表明LL-37是开发新型抗生素的理想模板和分子骨架，对治疗感染性疾病有潜在的应用价值。 为了探讨LL-37／hCAP-18在白血病细胞中的表达与白血病患者容易感染的关系，本实验采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot等方法，对9个代表不同谱系的人白血病细胞系的LL-37／hCAP-18表达进行了初步观测。其中6个细胞系有mRNA水平的表达，表达量差异较大，Raji细胞表达水平最高，Ramos表达水平最低，两者相差8倍之多。然而，在蛋白质水平，只有J6-1和U937细胞系呈阳性。同时发现白血病患者骨髓中LL-37／hCAP-18阳性细胞的比例和阳性指数均较特发性血小板减少性紫瘢患者(对照组)低。这些观察结果提示，LL-37／hCAP-18低表达，可能是白血病患者容易感染的原因之一。 应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1克隆了hCAP-18基因编码区cDNA序列，构建hCAP-18重组表达质粒phCAP-18。DNA序列分析显示该cDNA序列与报道的同源性为99％，有两个点突变，一个错义突变(Codon 6，
杨艳丽[2]2006年在《人源杀菌肽LL-37的改良、融合表达及其生物学活性研究》文中认为杀菌肽(又称抗菌肽、肽抗生素)是近年来发现的生物体基因编码的具有抗微生物活性的小肽,通常是由12-60个氨基酸所组成,分子量＜10KDa,是生物体天然免疫的重要组成部分。目前已证实来自各种哺乳动物的Cathelicidin成员有30多种,而人类唯一的Cathelicidin gene所编码的蛋白质为hCAP-18(human Cationic antimicrobial protein 18),LL-37是hCAP-18 C端的37个氨基酸片段,为分子量4.5kDa的阳离子两性分子α-螺旋抗菌肽,其作用特点在于既不容易导致耐药菌株的产生,又具有广谱抗微生物作用,因而具有极高的应用价值。研究表明,LL-37在人体内含量较低,而且其杀菌力较猴RL-37等同源杀菌肽的抗菌力低。根据结构与功能(structure-activity relationship,SAR)的研究显示所有α-螺旋杀菌肽的杀菌活性和抗菌谱与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关。通过分子改造增加LL-37肽链的正电荷,来提高其抗菌活性和拮抗内毒素的能力是一种较好的途径。本研究对LL-37进行分子改造,提高LL-37的正电荷,同时把LL-37基因序列的部分原核细胞稀有密码子替换为原核细胞偏爱密码子,并在其N端加入一段编码负电荷、亲水性强的承载蛋白(Carrier protein molecule,CPM)基因序列,放入载体pET-30a(+),并于工程菌BL21 Star(DE3)中融合表达,使得改建LL-37(reconstructedLL-37,rLL-37)能在原核细胞中高效表达。rLL-37以融合肽形式采用大肠杆菌表达,其引导蛋白中含有FXa酶切位点和6个His的特异亲和纯化标志物,随后从表达的融合蛋白中抽提出包涵体,并经纯化、脱盐、FXa酶切等步骤,当以FXa酶切除N端的引导片段,则获得高纯度的rLL-37,并初步研究其体内外生物学活性。本研究的主要结果和结论如下:1、应用蛋白质分析软件(Anthepro 5.0、SWISS-MODEL等),对LL-37多肽进行二维、叁维结构及理化特性分析,将LL-37肽链中的部分带负电荷的氨基酸残基替换为中性(带极性基团,易溶)氨基酸残基(Glu_(16)→Gln_(16)、Asp_(26)→Asn_(26)、Glu_(36)→Gln_(36)),构建了改良LL-37多肽(rLL-37),rLL-37的净电荷由LL-37的+5.8提高至+9,并保持了N端亲水极性和C端疏水极性及二维、叁维螺旋结构不变。同时将LL-37基因序列的部分原核细胞稀有密码子替换为原核细胞偏爱密码子(GGA替换为GGT、AGA替换为CGT)。2、设计了一个84bp的DNA序列,该序列编码含28个氨基酸残基的多肽(即承载蛋白质分子,CPM),其pHi 2.7、pH 7.4时净电荷为-6.0。将这一段编码CPM的基因序列放入rLL-37多肽基因序列的N端。3、采用Touch-Down PCR方法,获得了编码CPM及rLL-37的DNA序列(长约210 bp),将其转入T载体,酶切后置入表达载体pET-30a(+),制备了表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,测序鉴定证实所构建质粒序列正确。4、质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37于杆菌BL21 star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON柱芯有效地亲和纯化。融合蛋白以FXa酶切后,rLL-37能被强阳离子交换柱芯Macro-Prep High S有效纯化。通过Folin-酚法测定蛋白质含量共获得rLL-37目的蛋白约3.5mg。5、用抑菌圈法证实rLL-37杀菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的抑菌力。通过微量稀释法测得rLL-37的MIC(Minimal Inhibitive Concentration)、MBC(Minimal Bacteric Concentration),rLL-37对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)显出了比氨苄青霉素(AMP)稍好的杀菌活性,对粪肠球菌(ATCC29212)的杀菌活性与AMP相近。6、通过ELISA实验,证实rLL-37在体外具有与LPS较强的结合力。7、小鼠体内生物学功能研究,初步证明rLL-37在动物体内无明显的毒副作用,并且在动物体内有减轻炎症的保护作用。综上所述,我们对LL-37进行改良,其净电荷由+5.8提高至+9,提高了LL-37的正电荷。在制备中过程,将LL-37基因序列中的部分密码子替换为原核细胞偏爱密码子,在rLL-37基因序列的N端加入一段编码带负电荷的CPM基因序列,使得融合蛋白的净电荷降低,利于TALON柱芯亲和纯化,也降低rLL-37多肽对表达宿主菌的损害;由于加入CPM,含rLL-37的融合肽的分子量由8KDa增加到15KDa,从而提高了表达产物的稳定性和表达产量,研究结果证明rLL-37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的。通过对rLL-37体内外生物学功能研究,初步证明rLL-37在体外对G~+、G~-菌都具有较好的杀菌力,而且具有与LPS较强的结合力;rLL-37在动物体内无明显的毒副作用,并且对感染小鼠有杀菌和减轻炎症的体内保护效应。从而使得rLL-37以基因工程制备成为可能,为LL-37多肽的进一步深入研究奠定了良好基础。
陆建荣, 王惠民, 凌勇武, 黄松平, 常秋月[3]2007年在《人源多肽抗生素LL-37真核表达载体的构建》文中提出目的构建抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,转化毕赤酵母GS115以获得表达LL-37的工程菌。方法通过重迭区扩增法人工合成抗菌肽LL-37的基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,PCR鉴定及序列分析后转化毕赤酵母GS115。MM、MD平板筛选His+Mut+、His+Mut-表型,PCR扩增鉴定基因的插入。结果PCR鉴定及序列分析表明抗菌肽LL-37基因正确插入载体pPIC9,MM、MD平板筛选及PCR鉴定获得10个His+Mut+、9个His+Mut-克隆。结论获得含LL-37基因的工程菌。
杨艳丽, 葛晓冬, 刘友生, 邹佳[4]2006年在《改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性》文中研究说明目的:将改良LL37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性.方法:将编码改良的LL37多肽的DNA序列放入载体pET30a(+),转入工程菌BL21star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL37.再以TALON柱芯亲和层析、SDSPAGE和Westernblot鉴定后,用FXa裂解融合肽.将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱MacroPrepHighS纯化、收集各洗脱峰,脱盐、冻干.采用抑菌圈法检测改良LL37的抗菌活性.结果:改良的LL37多肽于载体pET30a(+)在杆菌BL21star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%.融合蛋白经纯化后用SDSPAGE鉴定在Mr4000处见单一条带.经抑菌圈法检测改良的LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力.结论:改良的人源性LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.
史鹏伟[5]2014年在《抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的初步研究》文中指出研究背景鲍曼不动杆菌属于非发酵革兰阴性杆菌,广泛存在于自然界中,属条件致病菌,在医院的环境中分布广泛且可长期存活。以引起呼吸道感染为主,也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。医疗环境中的氧气湿化瓶、呼吸机、输液设备、空调系统以及病人和医务人员皮肤均可被此菌污染而引起患者感染。对在院患者及医护人员有很大的威胁,尤其是对重症监护病房和烧伤病房中的患者,因其抵抗力低下或者皮肤大面积缺失等,成为了细菌侵袭机体的主要因素。近年来,随着鲍曼不动杆菌医院感染率、检出率及临床分离率的逐年上升,其耐药性亦呈增长趋势。甚至出现了广泛耐药鲍曼不动杆菌、全耐药鲍曼不动杆菌,给临床治疗带来了很大的挑战。研究表明：鲍曼不动杆菌基因组的特性使其具有快速获得和传播耐药性的能力,近年来多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈广泛流行传播。临床上对于鲍曼不动杆菌感染的治疗,常常束手无策。因为鲍曼不动杆菌不仅对常用的阿米卡星、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素的耐药率均高达95%以上,而且对第叁代和第四代头孢菌素的耐药率亦可高达70%。虽然部分鲍曼不动杆菌菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮-舒巴坦和多粘菌素仍有一定的敏感性,但随着抗菌药物大量而且广泛使用,耐药的鲍曼不动杆菌菌株也越来越多,耐药率也逐年上升。目前,虽然对鲍曼不动杆菌的耐药机制尚不完全明确,但近年来关于鲍曼不动杆菌耐药机制的报道越来越多,大多数研究均表明,鲍曼不动杆菌的主要致病因素与其产生的生物膜有关。细菌生物膜是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体,其相关感染因为对抗生素的耐药性极强成为临床难治性感染的重要原因之一。几乎每一种细菌都可以以生物膜的形式存在,国外相关研究证实至少65%的人类细菌感染疾病与生物膜有关。慢性中耳炎、中耳胆脂瘤、慢性腺样体炎等疾病的发病原因已被证实与生物膜的形成有关。生物膜是由多个细菌不可逆地黏附于机体或物体表面,被自身分泌的基质包裹,形成细菌群落。相比游离状态的细菌,细菌生物膜内的细菌对抗菌药物的敏感性明显降低,这可能与生物膜的结构或者是细菌生物膜内的细菌生理结构发生了改变有关,使得生物膜外的抗菌药物难以进入生物膜深部。以前一直认为是由于生物膜介导才使得抗菌药物难以渗透到生物膜内部,但一些研究否认了这一假说。研究表明,喹诺酮类药物能迅速渗透到绿脓杆菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部,四环素能迅速渗透入大肠杆菌生物膜内部,万古霉素能迅速渗透入金黄色葡萄球菌生物膜内部。目前能确认的只有氨基糖苷类药物,因为生物膜基质带负电荷,而氨基甙类药物带正电荷,因此,其很难渗入生物膜内部。此外,由于许多抗菌药物对繁殖期的细菌有很强的杀灭作用,如青霉素类药物、头孢菌素类药物及其一些碳青霉烯类药物等。由于受氧气、营养物质的匮乏及密度感应系统的调节等的影响,使得生存于细菌生物膜内部的细菌,生长、繁殖率下降,从而影响抗菌药物对其作用。因此,在抗菌药物的作用下,细菌生物膜内相对敏感的细菌可能会被杀死,但耐药性强的细菌会继续存在,而且一旦停止使用抗菌药物,这些耐药细菌会重新繁殖、生长。细菌生物膜使细菌具有极高的耐药性和免疫逃逸能力,可以逃避机体的免疫攻击和抗生素的杀灭,并进一步成为耐药菌,这也是是导致慢性持续性感染以及感染难以治愈的重要原因。所以,寻求一种从根本上控制、解决细菌感染和耐药的药物,对每一个临床工作者来说,是十分重要的。随着分子生物学理论及基因工程技术的发展,探索一种广谱、无耐药性或者低耐药性的新型抗菌药物越来越受到人们的重视。抗菌肽是在动物主动防御体系中发现的一种多肽,由宿主基因编码,是动物固有免疫的重要成分。抗菌肽是生物体免疫防卫系统产生的一类小分子活性多肽,是生物体内固有免疫的重要组成部分,这类活性多肽多数具有热稳定性、酸碱适应性及广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞等特点,主要分布于细菌、病毒、各种动物和植物体内。近年来的实验表明,LL-37是迄今在人体发现的Cathelicidins家族的唯一成员,hCAP-18酶解后释放出的C端片段,成为LL-37,因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)和氨基酸残基总数为37而得名。LL-37在人体组织中广泛存在,这类活性多肽主要由中性粒细胞、各种上皮细胞等产生,具有热稳定性、酸碱适应性,能抗菌、调节免疫反应、趋化作用、血管生成的刺激作用及组织再生和细胞因子释放。相关研究证实了抗菌肽LL-37对大肠杆菌、绿脓杆菌、肠球菌以及金葡菌具有抑菌作用,而且对大肠杆菌产生的生物膜也有一定的破坏作用。但是关于抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的实验研究尚未多见。本文旨在研究LL-37对浮游性鲍曼不动杆菌及其生物膜的影响,为将来在临床感染的控制和新的抗菌药物的研发提供科学的依据。研究目的1、观察鲍曼不动杆菌形成生物膜的能力,探索在体外建立鲍曼不动杆菌生物膜模型的方法；2、检测抗菌肽LL-37的MIC；3、观察抗菌肽LL-37对浮游型鲍曼不动杆菌及其生物膜的影响。研究方法1、生物膜形成的定性测定：在24孔组织培养板上建立鲍曼不动杆菌生物膜预模型。挑取AB菌落于5ml LB培养液中,37℃恒温振荡培养。8小时后用比浊仪调整菌液浓度约为1.0×108CFU/ml,吸取200gl菌液加入已加12x12mm玻片24孔板,每孔内加入2ml LB培养基,37℃恒温培养,每24h更换培养液1次,5d后将盖玻片从培养基中移除,用无菌PBS轻洗3次,以除去附着的浮游菌,加热固定后用结晶紫染色观察。培养孔中的浮游菌做结晶紫染色观察。2、测定LL-37MIC:根据临床实验室标准化协会所制定方法测定MIC。3、LL-37对生物膜作用(1)扫描电镜观察生物膜结构将无菌吸痰管剪成1.0cm大小,高压灭菌后置于含上述菌液的24孔板中,37℃恒温培养5d,每24小时更换培养液。5d后随机分为实验组和对照组,实验组加入20μg/ml LL-37溶液,对照组加无菌双蒸水。24小时后用无菌PBS溶液轻轻漂洗数次,2.5%戊二醛溶液固定,置冰箱4℃保存。经过乙醇梯度脱水后,将样品放入临界点干燥器内,干燥后的标本放入高真空蒸发器中,离子喷溅仪喷金后待测。运用扫描电子显微镜观察硅胶膜上鲍曼不动杆菌生物膜的超微结构。(2)结晶紫染色法定量检测生物膜96孔板内加入200μl菌液,每24小时换LB培养液,37℃恒温培养；5d后在各孔内分别加入不同浓度LL-37(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、(无菌双蒸水),37℃恒温放置24小时后,用无菌PBS溶液轻轻漂洗96孔板,自然风干后,加入1%结晶紫溶液2ml,室温染色20min,蒸馏水洗去染液,自然风干后,加入95%乙醇,放置10min。用酶标仪测定570nm波长处吸光度(A)值,以空白酒精做对照。实验结果1、在没有外界因素诱导的条件下,鲍曼不动杆菌在盖玻片上培养5d后形成成熟的生物膜,经结晶紫染色后肉眼可见玻片表面覆盖有紫色致密物质,高倍镜下观察,可见细菌聚集生长,形成膜状集落；培养基中的浮游菌经革兰染色后在高倍镜下观察,细菌成散在分布。2、成功测得抗菌肽LL-37对浮游型鲍曼不动杆菌的MIC的值为64μg/ml。3、(1)扫描电镜图片明确地观察到鲍曼不动杆菌可以黏附在硅胶吸痰管表面,并形成生物膜,证实鲍曼不动杆菌可以生物膜菌的方式生存,与黏附物接触第5天形成成熟的生物膜,与以往报道3-5天相一致。并且可见实验组生物膜相比对照组结构明显稀疏。(2)LL-37浓度为2.5μg/ml时吸光度明显降低,即生物膜量较0μg/ml、1.25μg/ml组明显减少,表明此浓度下LL-37即可抑制生物膜形成,并随着LL-37浓度的增加吸光度逐渐降低。当LL-37浓度增至10μg/ml、20μg/ml时,两组之间差异无统计学意义。研究结论1、鲍曼不动杆菌在盖玻片上培养5d后形成成熟的生物膜,与以往报道3-5d相一致,证明已成功建立体外鲍曼不动杆菌生物膜模型。2、测得抗菌肽LL-37的最小抑菌浓度为64μg/ml,与之前研究结果4-64μg/ml一致。3、当抗菌肽LL-37浓度为2.5μg/m(远低于其最小抑菌浓度时)即可破坏鲍曼不动杆菌生物膜结构的浓度。
丁静[6]2012年在《人抗菌肽LL-37的原核表达及其抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染活性的初步研究》文中认为LL-37是人体内发现的抗菌肽Cathelicidin家族的唯一成员，由37个氨基酸残基组成，因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸（L）而得名。LL-37抗菌谱广，体外研究显示对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒均发挥抑制作用，特别是对部分临床耐药菌及临床易感菌株也有较强的抑菌活性，因此有很好的应用前景。本文采用原核表达系统实现小分子抗菌多肽LL-37的可溶表达，并研究其在皮肤创伤感染中发挥的活性作用。本课题将LL-37连接入pET32a载体中进行可溶表达，通过考察表达诱导因素获得高产量的LL-37，体外实验验证其抗菌活性，最后研究LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤创面耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防治疗作用，并从抗细菌生物膜方面探讨其作用机制。研究目的：本文主要是采用pET32a表达载体实现LL-37的可溶表达，同时还探讨了LL-37对于小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）创伤感染模型的预防治疗作用，并对其机制进行初步研究，为小分子抗菌肽的基因工程表达提供参考，也为LL-37的深入研究和开发应用提供实验依据。研究方法：1.融合蛋白Trx-LL-37的生物信息学分析及表达载体构建：运用相关生物信息学软件对融合蛋白Trx-LL-37氨基酸序列进行分析预测，初步了解融合蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构以及可溶表达概率。参考GenBank中已发表的LL-37全长cDNA基因序列（No.：CAA46115）以及pET32a（+）多克隆位点序列，设计两条特异性引物，PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列，引入KpnⅠ、SacⅠ酶切位点以及甲酸裂解位点。通过KpnⅠ、SacⅠ双酶切反应，将含有LL-37的小片段连接入pET32a表达载体中，进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定。2. LL-37的原核表达、纯化及鉴定：将构建好的表达载体pET32a-LL-37转化入BL21（DE3）中进行表达，采用SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物进行鉴定。以融合蛋白Trx-LL-37的可溶蛋白表达水平为指标，通过诱导条件及表达条件的单因素优化，确定最佳表达参数。通过Ni2+亲和层析色谱法纯化融合蛋白Trx-LL-37，甲酸裂解去除标签蛋白，再次采用Ni2+亲和层析色谱法纯化目标蛋白LL-37。3. LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究：选取金黄色葡萄球菌S.aureus、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌S.epidermidis、大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等临床常见感染菌种作为实验对象，采用琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法，验证纯化产物LL-37的抑菌活性。建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型，以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照，通过统计分析体重变化、组织菌负荷、感染愈合时间、创面愈合率等指标探讨了LL-37的治疗效果。4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究：采过96孔板法，以金黄色葡萄球菌作为阳性菌对照，探讨了MRSA的体外成膜能力。然后结合激光共聚焦实验研究了LL-37对MRSA生物膜形成的影响以及对已形成的MRSA生物膜的破坏作用。结果：1.融合蛋白Trx-LL-37生物信息学分析及表达载体构建：经过生物信息学软件预测分析，融合蛋白Trx-LL-37基因编码蛋白含有195个氨基酸，分子量为21.5kDa，理论等电点为6.3，热稳定性好、半衰期长，属于稳定类蛋白；融合蛋白二级结构简单，主要包含α-螺旋、无规则卷曲；根据两个参数模型预测显示，重组融合蛋白具有可溶性表达的倾向，可采用基因工程技术进行表达。特异性引物PCR扩增出含有LL-37成熟肽的基因序列，引入特异性酶切位点以及甲酸裂解位点。经KpnⅠ、SacⅠ双酶切后连接入pET32a表达载体，进行菌落PCR、双酶切以及质粒测序鉴定，片段大小以及氨基酸序列均与GeneBank公布一致。2. LL-37的原核表达、纯化及鉴定：构建的表达菌BL21（DE3）/pET32a-LL-37经诱导表达，SDS-PAGE、WesternBlot对表达产物鉴定结果显示，IPTG诱导后的菌体蛋白在21.5kDa附近存在目标蛋白（Trx-LL-37）条带，而未诱导的未出现相应大小的条带。诱导表达条件经过优化，种子菌180rpm37℃培养2.5h，加入终浓度0.05mM IPTG，于17℃低温诱导，培养24h，此时融合蛋白Trx-LL-37表达量最高，重组蛋白在总可溶蛋白中的比例也最高，达到45%以上。融合蛋白Trx-LL-37经Ni2+亲和层析色谱法一次纯化，甲酸裂解去除标签蛋白，Ni2+亲和层析色谱法二次纯化，最终获得目标蛋白LL-37。终产量为每升发酵液得到目标蛋白LL-37约3mg。经RP-HPLC色谱分析，峰面积结果显示，目标蛋白纯度在90%以上。3. LL-37抗小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA创伤感染活性初步研究：琼脂孔穴扩散法及微量肉汤稀释法实验结果显示，产物LL-37对于临床常见感染菌种具有抑菌活性，并且其MICs以及MBCs与经典文献一致。本实验建立小鼠深Ⅱ度烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌创伤感染模型，观察LL-37对创面感染的影响，以生理盐水为阴性对照、庆大霉素为阳性对照，进行比较。每日观察发现，治疗组小鼠精神状态正常，进食、休息等活动均未受到影响，体重正常增长；生理盐水组小鼠精神萎靡，毛发无光泽，体重水平一直处于治疗组小鼠之下。具体结果显示， LL-37组第3d创面即干燥结痂，痂下湿润，渗出物相比对照组明显减少，局部组织菌负荷比对照组低了约3.5~Log（CEU/g tissue），差异有统计学意义（P＜0.05），说明LL-37有效降低了局部组织菌负荷，能够及时抑制早期烫伤创面细菌的定植与增长，预防控制感染的发展。第9d，LL-37组创面明显缩小，痂下肉芽组织生长迅速，愈合率与庆大霉素组无统计学差异（P>0.05）。9d HE病理切片还发现，生理盐水组创面正下方皮下组织分布有脓细胞碎片，可见炎症细胞浸润，而治疗组均无；除此，LL-37皮下出现大量成纤维母细胞及新生血管，修复状况明显优于对照组。从另一方面说明，LL-37对模型小鼠烫伤创面具有促愈合修复作用。综上，LL-37对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创伤模型具有一定效果。4. LL-37抗MRSA生物膜活性初步研究：96孔板法联合结晶紫染色结果显示，MRSA与阳性质控菌株S.aureus（ATCC25923）相比，两者成膜能力相当，在统计学意义上无显着差异（P＞0.05）。然后，本实验选取6.25、3.13、0.625、0.0625μM4个亚抑菌浓度，研究LL-37对于MRSA体外生物膜形成的影响，发现LL-37不仅作用于生物膜形成的初始阶段——细菌的附着，还对已成型的生物膜具有杀伤破坏作用。结果显示，LL-37在1/20MIC浓度对生物膜形成的抑制作用即有统计学意义，1/4MIC3.13μM条件下对生物膜形成的抑制率达63%；在激光共聚焦显微镜下可观察到，1/4MIC LL-37作用48h后，MRSA生物膜内组成细菌数目明显减少，成形的菌斑结构疏松，无信号区居多，生物膜较薄，平均厚度仅为未加药组的1/4。结论：本研究通过原核系统可溶表达得到融合蛋白Trx-LL-37；融合蛋白经甲酸裂解、两步Ni柱纯化获得目标蛋白LL-37，体外抑菌试验证明其具有抑菌活性。通过对小鼠深Ⅱ度烫伤MRSA感染创面治疗发现，LL-37能够抑制感染创面细菌的定植与生长，预防感染，促进创面愈合。体外96孔板法研究显示，MRSA具有强大的生物膜形成能力；LL-37具有抗生物膜活性，在1/20MIC亚抑菌浓度条件下，即可抑制MRSA生物膜的形成，且有统计学意义。细菌生物膜的形成是许多慢性感染创面延迟不愈的主要原因，也是许多细菌产生耐药性的原因，LL-37不仅预防控制MRSA感染，还能抑制MRSA生物膜的形成，由此表明，LL-37对于耐药菌造成的感染具有一定的效果。
陈志瑾[7]2009年在《酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化及其抗单纯疱疹病毒活性分析》文中研究指明肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生素为阳离子型。如动物的防御素(Defensins)即为一组阳离子型肽抗生素,它首先从兔的中性粒细胞中发现,而后发现在不同动物的巨噬细胞、小肠paneth细胞、上皮细胞中也有表达,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种功能。根据半胱氨酸的分布及形成二硫键的方式不同,哺乳动物的防御素分为α-,β-和θ-叁个亚家族。人的防御素分子中均含有6个半胱氨酸,可形成3对二硫键。迄今已发现17种人防御素,包括6个α-防御素(HNP1-4,HD5和HD6)和11个β-防御素(HBD1-6和HBD25-29)。它们在人体遭受感染后,机体的特异性免疫建立之前发挥重要作用。在临床耐药菌问题日益严重、病毒感染又缺乏特异性治疗手段的今天,肽抗生素的发现及深入研究无疑给临床抗感染治疗点燃了新的希望。肽抗生素hPAB-β为人hBD-2的一种突变体,在我们的前期工作中通过删除hBD-2N-端叁个氨基酸,在C-端添加了一个天冬酰胺获得,具有hBD-2相似的抗菌活性。在前期工作中,我们利用铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因编码的PaP3.30蛋白作为承载分子对hPAB-β进行了融合表达,融合蛋白的表达率达到细菌总蛋白的40%,但该融合蛋白的分子量(23.6 kDa)是目标肽hPAB-β(4.3 kDa)的5倍多,故实际的hPAB-β表达量不到7%,表达效率不高；后来采用串联体的方法(即将hPAB-β基因头尾相连,构建不同拷贝数的表达载体),但由于一个hPAB-β中就含有6个半胱氨酸,串联的分子越多,二硫键的形成越复杂,融合蛋白形成的包涵体溶解性越差,难以实现hPAB-β的高效制备；最后根据毕赤酵母系统表达外源蛋白产量高及可进行分泌型表达的特点,我们成功构建并实现了肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的分泌型表达,目标多肽的产量达到241.2±39mg／L,本论文报道了酵母高密度发酵肽抗生素hPAB-β的纯化,以及在获得高纯度hPAB-β后,以单纯疱疹病毒为模型,探讨了hPAB-β对疱疹病毒的杀灭作用,主要实验方法和结果如下：利用毕赤酵母易于高密度发酵的特性,在3.7L发酵罐中对重组了肽抗生素hPAB-β表达盒的pPIC9K-hPAB-β/GS 115酵母优5工程菌进行高密度发酵,在菌体达到一定生长量后,用甲醇诱导目标基因的表达,并对菌体生长曲线、目标蛋白的表达水平进行了监测。从生长曲线中可见,在种子接种后的16h内,酵母菌生长迅速,加入补料后,酵母菌继续生长,在生长32h(菌体湿重达236.7±25.3g／L)时停止补料,菌体生长速度下降,在甲醇诱导期间,菌体生长缓慢。在诱导过程中,间隔8-12h取样进行Tricine SDS-PAGE电泳分析,结果可见,在刚开始诱导时,上清中未见目标肽分泌,加入诱导剂12h后,隐约见有表达条带,尔后表达带逐渐增强,到诱导60h下罐时达到最高。用Brandford法测得3次发酵液的总蛋白浓度分别为664.0 mg／L,781.8 mg／L和721.3mg／L。用Bio-Rad公司Quantity One软件条带检测灰度分析工具对凝胶电泳后的蛋白条带进行分析,目的蛋白约占发酵上清液总蛋白的33.4%,故可知发酵上清中目的蛋白的表达量约为241.2±29.5 mg／L,实现了重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β的目标。纯化的目的不仅仅是要获得高纯度的目标产物,还要使目标产物的生物学活性在纯化过程中不丧失,这就要根据目标分子与杂质的差异设计纯化路线,经过试验摸索加以优化。考虑到hPAB-β为一阳离子小肽(pI 9.001),我们设计了10kDa膜过滤、反相层析、阳离子交换、分子筛脱盐等纯化技术对目标肽进行纯化,最终从每升发酵液中纯化得到74.9±1.5 mg目标蛋白,纯度达到98%以上,总体纯化效率为31.5%,实现了酵母表达肽抗生素hPAB-β的分离纯化。获得纯化的hPAB-β后,我们利用Western blot对目标肽进行了鉴定,目标产物能与hPAB-β的特异性抗体反应,表明纯化出的蛋白即为需要的目标物。进一步利用琼脂扩散法检测了纯化产物对革兰阴、阳细菌的杀灭活性,结果表明纯化产物具有生物学活性,为进一步开展hPAB-β的功能研究奠定了基础。病毒分离培养和分型是生殖器疱疹实验室诊断的“金标准”,通常需时2-4天,然而不同的标本类型对培养结果干扰较大。随着基因组学的进展,单纯疱疹病毒的基因组全序列均已清楚,为分子生物诊断技术(PCR、核酸探针等)在单纯疱疹病毒感染诊断中的应用奠定了良好基础。为研究肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性,我们以单纯疱疹病毒为模型,采集了60例临床上疑似生殖器疱疹患者病变部位的标本进行病毒分离培养,并根据单纯疱疹病毒DNA多聚酶基因序列合成了型特异性PCR引物,对临床标本进行PCR检测,并与细胞培养进行了对比分析。结果60份疑为生殖器疱疹患者的标本经HSV型特异性PCR检测,有45份可见约390bp的特异性扩增产物(HSV-2),阳性率75%,而HSV-1特异性引物检测为阴性；利用Vero细胞进行病毒分离培养,结果阳性36例,阳性率60%,和PCR检测相比,差异非常显着(X2=24.38,P<0.01)。从患者皮损的类型来看,水疱和脓疱标本的病毒培养和PCR检测阳性率均较高(80-93.3%),糜烂、结痂、斑丘疹标本检测阳性率较低,尤以斑丘疹最低,提示对疑为生殖器疱疹病人作病原学诊断,采集水疱、脓疱标本进行病毒分离或PCR检测较佳。利用重组毕赤酵母工程菌pPIC9k-hPAB-β/GS115进行高密度发酵、纯化,制备肽抗生素hPAB-β。采用稀释法检测了重组hPAB-β对Vero细胞的毒性,结果显示高浓度的肽抗生素hPAB-β(1 mmol/L以上)对细胞有毒性,其对Vero细胞的最大无毒浓度为400μmol/L,约1.72mg/ml。以临床标本中分离的HSV-2为研究对象,将肽抗生素hPAB-β作用于HSV-21.5h后接种细胞,结果可见各实验稀释度(400-10μmol/L)的肽抗生素都有抑制病毒噬斑形成的能力,随着肽抗生素浓度的升高,噬斑形成数减少,表明经酵母高密度发酵的肽抗生素hPAB-β对临床分离的HSV-2有直接杀灭作用。病毒液对照(100TCID50的病毒液0.2ml+PBS 0.2m1)在培养20h时即开始出现细胞病变,培养2d后,对培养孔用1%结晶紫(含10%甲醛)染色,记数平均噬斑形成数目为101.7±5.5个。在同等实验条件下,阿昔洛韦的高浓度孔才能见其病毒抑制效应,在浓度降低至100μmol/L以下时,病毒噬斑形成数没有明显改变。基于此,选用浓度为200μmol/L肽抗生素hPAB-β和阿昔洛韦的抗病毒活性进行对比分析,以病毒对照组的噬斑形成率为100%,则肽抗生素hPAB-β作用组的噬斑形成率为48.7%；200μmol/L阿昔洛韦作用组的噬斑形成率为39.0%；与病毒对照组相比,两个药物作用组的病毒噬斑形成都有显着降低(P值分别为0.02545和0.0103),肽抗生素作用组与阿昔洛韦药物对照组相比,噬斑形成率略高(前者48.7%,后者39.0%),但两者无统计学意义(P=0.06927)。表明肽抗生素hPAB-β对HSV-2具有良好的杀灭活性。综上所述,利用重组毕赤酵母高密度发酵,肽抗生素hPAB-β的表达量达到241.2±29.5 mg／L,经10kDa膜过滤、反相层析、离子交换、分子筛层析等处理,从酵母发酵上清中纯化得高纯度目标产物74.9±1.5 mg／L,总体纯化效率为31.5%,该纯化产物具有杀灭革兰阴、阳性细菌的能力。采用PCR、病毒分离培养对60例疑似生殖器疱疹患者的标本进行检测与鉴定研究,有45份PCR扩增产物阳性,阳性率75%,均为HSV-2,而HSV-1型特异性引物的检测为阴性；用Vero细胞进行的病毒分离培养,结果36例阳性,阳性率60%,和PCR检测相比,差异非常显着。利用病毒噬斑计数法对肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性进了分析,结果在200μmol/L hPAB-β或阿昔洛韦时的作用下,前者的病毒噬斑形成率为48.7%,后者为39.0%,与病毒对照组相比,两者均显着下降,而肽抗生素hPAB-β与阿昔洛韦组相比,对病毒噬斑形成的抑制无显着差异(P=0.06927),表明经酵母表达纯化的肽抗生素hPAB-β具有抗HSV-2的活性,为深入分析其抗病毒机制提供了实验依据。
参考文献：
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[7]. 酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化及其抗单纯疱疹病毒活性分析[D]. 陈志瑾. 第叁军医大学. 2009
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