灵长类动物SAMHD1蛋白的细胞学功能保守性研究

论文摘要

目的:探讨不同灵长类动物SAMHD1蛋白的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1蛋白的进一步研究提供依据。方法:构建稳定表达SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为空白对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系为实验组。经佛波酯刺激分化成巨噬样细胞后,采用流式细胞术分析HIV-1-GFP病毒在不同实验组中的感染率。以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAMHD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用蛋白印迹实验检测SAMHD1蛋白水平,免疫荧光检测方法观察不同SAMHD1蛋白的细胞内定位。以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率。以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平。结果:抗病毒实验中,与对照组比较,灵长类动物SAMHD1稳定表达的实验组HIV-1细胞感染率明显降低（P<0.01）。病毒蛋白Vpx降解实验中,与对照组比较,HIV-2、SIVmac和SIVdeb编码的Vpx蛋白明显降低了灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平。免疫荧光实验,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核内。抑制LINE-1实验中,与对照组相比较,SAMHD1瞬时表达的实验组细胞中GFP阳性细胞率明显降低（P<0.05或P<0.01）。抑制免疫激活实验中,与对照组相比较,实验组中灵长类SAMHD1表达明显降低了IFN-luc荧光素酶水平（P<0.05）。结论:不同灵长类动物SAMHD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生干扰素的作用。

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中文摘要

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第1章绪论

1.1 背景知识

1.1.1 灵长类动物与猴免疫缺陷病毒

1.1.2 限制性因子SAMHD1 的结构与发现

1.1.3 限制性因子SAMHD1 的抗病毒作用

1.1.4 限制性因子SAMHD1 的细胞学功能

1.1.5 病毒蛋白Vpx与限制性因子SAMHD1 竞争性进化关系.

1.2 研究目的

第2章材料与方法

2.1 实验材料、仪器与试剂

2.1.1 实验所用细胞系

2.1.2 实验所用菌株

2.1.3 实验所用毒株

2.1.4 实验所用质粒

2.1.5 实验所用抗体

2.1.6 实验所用仪器

2.1.7 实验所用主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 LB液体以及固体培养基的制备

2.2.2 感受态的制备

2.2.3 质粒扩增

2.2.4 细胞复苏、培养与冻存

2.2.5 PEI转染法

2.2.6 蛋白免疫印记Western Blot

2.2.7 病毒的包装与纯化

2.2.8 建立SAMHD1 稳定表达细胞系

2.2.9 灵长类SAMHD1 蛋白的细胞内定位-免疫荧光

2.2.10 灵长类SAMHD1 蛋白对LINE-1 转座的抑制

2.2.11 灵长类SAMHD1 蛋白对干扰素产生信号通路的影响

2.2.12 HIV-1-GFP病毒滴度检测

2.2.13 统计学分析

第3章实验结果与讨论

3.1 灵长类动物SAMHD1 抗病毒活性

3.2 慢病毒蛋白Vpx诱导灵长类动物的降解作用

3.3 灵长类SAMHD1 蛋白的细胞内定位

3.4 灵长类动物SAMHD1对LINE-1 转座活性的抑制

3.5 灵长类动物SAMHD1 抑制免疫激活作用

3.6 讨论

结论

参考文献

作者简介及在硕士期间所取得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李爽

导师: 魏伟

关键词: 灵长类动物,逆转录病毒,逆转录转座子

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 吉林大学

分类号: Q952

总页数: 49

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