双水相浮选体系的设计构建及其在分离纯化菠萝蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶中的应用研究

论文摘要

酶是一种能够催化特定化学反应的生物催化剂。因其温和的反应条件、对底物的专一性和高效率的催化活性,已在诸多工业领域广泛应用。然而,对植物来源的酶或是微生物来源的酶来说,将其从复杂的体系中分离出来的同时又要防止其结构的改变以及生物活性的丧失,一直是其分离纯化过程中的关键问题。双水相浮选技术作为一种复合型分离技术,具有纯化步骤简易、操作环境温和和易于放大等优点,因而被逐渐引入到对生物制品的分离纯化中。本文以菠萝蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶为例,构建新型的双水相浮选体系对酶进行分离纯化,具体内容如下:（1）设计合成了温敏聚合物L64-IDA-Cu（Ⅱ）作为浮选捕集剂,并利用FT-IR、原子吸收光谱法和透射率实验对其结构和温敏性能进行研究。通过考察一系列离子液体（IL）和盐对菠萝蛋白酶的酶活稳定性影响,构建[Bmim]Br-K2HPO4的离子液体双水相浮选（ILATPF）体系,并以L64-IDA-Cu（Ⅱ）为捕集剂结合ILATPF对菠萝蛋白酶进行分离纯化。通过单因素实验和响应曲面法（RSM）优化得到实验条件:盐浓度,浮选时间,L64-IDA-Cu（Ⅱ）浓度,IL浓度和浮选流速分别为0.50 g/mL,30min,0.30g/L,60%和30mL/min,并得出最佳浮选效果:Ye和Kp值分别达到97.43%和3.45。对于浮选分离后得到的L64-IDA-Cu（Ⅱ）-菠萝蛋白酶复合物以及上相离子液体的混合物,利用L64-IDA-Cu（Ⅱ）的温敏性能,通过两步沉淀去除离子液体和L64-IDA-Cu（Ⅱ）本身,实现最终纯化（得到的菠萝蛋白酶的Ye、Kp和PF值为96.90%、5.97和7.18）。接着将本实验方法与其他纯化方法进行比较,证明本实验方法具有良好的纯化效果。最终通过SDS-PAGE分析,证明纯化的菠萝蛋白酶的纯度优良,并用紫外吸收光谱分析（UV-vis）、FT-IR和圆二色谱（CD）验证纯化过程对菠萝蛋白酶的结构没有造成影响。（2）本实验成功表达了含GB和ELP标签的融合β-葡萄糖苷酶（Glu）:Glu-linker-ELP-GB（GLEGB）。通过考察一系列聚合物、盐和表面活性剂对Glu的酶活稳定性影响,构建了 PEG-（NH4）2SO4的ATPF体系。然后利用融合蛋白GLEGB上的GB标签的疏水作用结合ATPF对融合蛋白进行初步纯化。通过单因素实验和RSM优化得到ATPF纯化GLEGB的条件:PEG 2000浓度,BS-12浓度,浮选时间和浮选流速分别为40.00%,1.50%,30 min和30 mL/min,并得到最佳的浮选效果:Ye和PF值分别为172.86%和9.58。然后对于得到的GLEGB和PEG2000的混合液,利用GLEGB上的ELP标签的逆转换循环（ITC）特性去除PEG 2000,得到进一步纯化的GLEGB水溶液（纯化的GLEGB的Ye和PF值达到 124.92%和24.26）。并将ATPF-ITC联用方法用于其他酶（Glu、Glu-linker-ELP（GLE）、Glu-linker-GB（GLG）、Glu-linker-ELP-6His（GLEH））的分离纯化,证明了GB和ELP标签联用的良好纯化效果。最后通过SDS-PAGE分析,证明纯化的GLEGB的纯度良好,并通过UV-vis、FT-IR和CD对购买的Glu和纯化的GLEGB进行比较,验证纯化过程对酶的结构没有造成影响。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 双水相浮选

1.1.1 双水相浮选概述

1.1.2 双水相浮选特点

1.1.3 双水相浮选的基本原理

1.1.4 双水相浮选影响参数

1.1.5 双水相浮选的研究进展

1.2 菠萝蛋白酶

1.2.1 菠萝蛋白酶的结构和性质

1.2.2 菠萝蛋白酶的分离纯化方法研究进展

1.3 β-葡萄糖苷酶

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的结构和性质

1.3.2 β-葡萄糖苷酶的分离纯化方法研究进展

1.4 融合蛋白技术

1.4.1 融合蛋白技术及连接肽

1.4.2 融合标签

1.5 课题的选题目的、意义及研究内容

1.5.1 选题目的和意义

1.5.2 研究内容

第二章基于金属螯合离子液体双水相溶剂浮选体系的构建及分离纯化菠萝蛋白酶的应用研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验材料、试剂和主要仪器

2.2.2 温敏聚合物L64-IDA-Cu（Ⅱ）的制备

2.2.3 温敏聚合物L64-IDA-Cu（Ⅱ）的性能鉴定

2.2.4 菠萝蛋白酶的稳定性实验

2.2.5 基于温敏嵌段聚合物L64-IDA-Cu（Ⅱ）作为捕集剂的ILATPF和两步沉淀对菠萝蛋白酶的分离纯化

2.2.6 响应曲面设计

2.2.7 菠萝蛋白酶的酶活和蛋白质含量的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 温敏嵌段聚合物L64-IDA-Cu（Ⅱ）的合成与性能研究

2.3.2 菠萝蛋白酶的稳定性研究

2.3.3 以L64-IDA-Cu（Ⅱ）为捕集剂的ILATPF分离菠萝蛋白酶的条件探究

2.3.4 两步沉淀纯化菠萝蛋白酶的条件探究

2.3.5 [Bmim]Br和L64-IDA-Cu（Ⅱ）的循环使用

2.3.6 菠萝蛋白酶的结构表征

2.4 本章小结

第三章聚合物-盐双水相浮选体系的构建及其对融合β-葡萄糖苷酶的分离纯化研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验材料、试剂和主要仪器

3.2.2 融合蛋白GLEGB的诱导表达实验

3.2.3 β-葡萄糖苷酶的稳定性研究

3.2.4 ATPF结合ITC对融合蛋白GLEGB的分离纯化

3.2.5 响应曲面设计

3.2.6 β-葡萄糖苷酶的酶活和蛋白含量测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 β-葡萄糖苷酶的稳定性研究

3.3.2 ATPF-ITC分离纯化融合蛋白GLEGB

3.3.3 ITC纯化融合蛋白GLEGB的条件探索

3.3.4 聚合物PEG 2000的循环使用

3.3.5 融合蛋白GLEGB的结构表征

3.4 本章小结

第四章结论与创新点

4.1 本研究的主要结论

4.2 本研究的创新点

参考文献

致谢

硕士期间研究成果

附录A:中英文符号及缩写对照表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蔡云凤

导师: 韩娟

关键词: 双水相浮选,菠萝蛋白酶,融合葡萄糖苷酶,分离纯化,控温沉淀

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江苏大学

分类号: Q814.1

总页数: 97

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双水相浮选体系的设计构建及其在分离纯化菠萝蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶中的应用研究

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