沙门氏菌中sRNA伴侣蛋白Hfq靶基因的寻找

论文摘要

沙门氏菌(Salmonella)为肠杆菌科、沙门氏菌属成员,是一类革兰氏阴性肠杆菌,该菌对我国畜禽养殖业威胁较大,同时也可以引起食源性污染从而严重威胁人类健康和食品安全。细菌s RNA是近些年来发现的一类细菌重要生命活动调控因子,其中反式s RNA需要细菌s RNA伴侣蛋白Hfq协同调控毒力基因表达、压力应答、营养物质吸收、适应环境变化及群体感应中发挥重要作用。本研究以鼠伤寒沙门氏菌标准株为模版,构建出鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株分别培养至对数期和稳定期,提取RNA进行转录组测序,筛选差异表达基因、进行GO富集分析和Pathway富集分析,并筛选部分差异表达基因进行荧光定量PCR验证,筛选相关通路进行深入分析,筛选沙门氏菌hfq基因缺失株重要调控基因。1.鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的构建及鉴定采用P22噬菌体转导技术,以鼠伤寒沙门氏菌yifk::Mud K△hfq::cat基因缺失株为供体菌,鼠伤寒沙门氏菌标准株为受体菌,构建鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,PCR扩增及基因测序结果表明鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株构建成功。2.鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的转录组分析对鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的转录组测序结果采用DEseq2的算法,在对数期筛选出差异表达基因1055个,其中表达显著上调基因516个,表达显著下调基因539个,在稳定期筛选出差异表达基因959个,其中表达显著上调基因496个,表达显著下调基因463个。对随机筛选的STM3630,STM2890,STM2874,STM3764,STM4361,STM2898,STM2640,STM2893,STM1583,STM2897和STM1091等11个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,趋势与转录组测序相符,表明转录组测序结果可靠。将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的差异表达基因在GO数据库和KEGG数据库中注释,对数期显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、碳水化合物代谢过程等生物过程中,以及细菌趋化性、丙酸代谢、碳代谢、ABC转运蛋白、不同环境中的微生物代谢、卟啉与叶绿素代谢、光合生物固碳、戊糖磷酸途径、原核生物中的固碳途径、柠檬酸循环和糖酵解途径等11个信号通路中。稳定期显著差异表达基因主要富集在钴胺素代谢过程、钴胺素生物合成过程、胞质过程、核糖体RNA结合过程等生物学过程,卟啉和叶绿素代谢等信号通路中。3.基于转录组结果分析的鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株重要差异共表达基因筛选在鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序的基础上,筛选致病机制生物学过程,趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应通路等信号通路的富集基因。在对数期对致病机制生物学过程,趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应通路等信号通路进行筛选差异表达基因筛选,分别筛选出27、12、11、66、68和18个基因。在稳定期对致病机制生物学过程,趋化性、分泌、ABC转运蛋白、双组分系统和群体感应等信号通路进行筛选差异表达基因筛选,分别筛选出36、6、15、49、56和18个基因。筛选对数期和稳定期生物学过程及信号通路差异共表达基因,在致病机制生物学过程及趋化性通路、分泌通路、ABC转运蛋白通路、双组分通路和群体感应等信号通路中分别筛选到14、4、7、20、16和5个基因,在以上生物学过程及信号通路中参与两个及以上的重要差异共表达基因有8个,分别为hilA、spaS、invG、spaP、invA、pstS、STM1678、mppA,提示可能为鼠伤寒沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq的调控靶基因。综上所述,采用P22噬菌体转导技术成功构建鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株,将鼠伤寒沙门氏菌标准株和鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株分别培养至对数期和稳定期进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO富集分析和Pathway富集分析,筛选对数期和稳定期相关功能生物学过程和信号通路差异共表达基因,寻找到hfq可能靶基因8个。

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中文摘要

Abstract

缩略词

文献综述细菌sRNA及伴侣蛋白Hfq研究进展

1 细菌sRNA研究进展

1.1 细菌sRNA的发现

1.2 细菌sRNA的特征

1.3 细菌sRNA的分类

1.3.1 行使管家功能的sRNA

1.3.2 调控蛋白活性的sRNA

1.3.3 调控mRNA的sRNA

1.4 细菌sRNA的调控

1.5 细菌sRNA的功能

1.5.1 调控毒力基因表达

1.5.2 适应外界环境变化

1.5.3 调控细菌群体感应

1.5.4 调控外膜蛋白合成

2 细菌sRNA伴侣蛋白Hfq研究进展

2.0 细菌sRNA伴侣蛋白Hfq简介

2.1 细菌sRNA伴侣蛋白Hfq功能

2.2 细菌sRNA伴侣蛋白Hfq结构

3 转录组研究

3.1 转录组研究简介

3.2 转录组测序技术

3.3 转录组测序步骤

3.4 转录组测序应用

4 研究背景与目的意义

试验研究

第一章沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq缺失株的转录组分析

1 材料

1.1 实验菌株

1.2 实验试剂

1.3 实验设备

2 方法

2.1 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的构建及鉴定

2.1.1 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的构建

2.1.2 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的鉴定

2.2 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序

2.2.1 培养与送样

2.2.2 RNA提取与质量检测

2.2.3 建库测序

2.2.4 数据处理与分析

2.2.5 差异基因筛选

2.2.6 显著差异表达基因GO富集分析

2.2.7 显著差异表达基因Pathway富集分析

3 结果

3.1 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株构建与鉴定

3.2 鼠伤寒沙门氏菌标准株与hfq基因缺失株转录组结果分析

3.2.1 RNA提取与质量分析

3.2.2 转录组测序结果可靠性评估

3.2.3 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株差异表达基因筛选与分析

3.2.4 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株差异表达基因GO富集分析

3.2.5 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株差异表达基因Pathway富集

4 讨论

4.1 关于鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株的构建

4.2 关于鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序分析

4.2.1 测序数据分析

4.2.2 差异表达基因分析

4.2.3 差异表达基因GO富集分析

4.2.4 差异表达基因Pathway富集分析

5 本章结论

第二章基于转录组测序鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关重要调控基因的筛选

1 材料

1.1 实验菌株

1.2 实验试剂

1.3 实验设备

2 方法

2.1 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序结果可靠性验证

2.1.1 转录组测序结果验证引物的设计

2.1.2 鼠伤寒沙门氏菌标准株和hfq基因缺失株RNA的提取

2.1.3 细菌cDNA合成

2.1.4 荧光定量检测程序

2.1.5 荧光定量数据处理

2.2 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关重要调控基因的筛选

3 结果

3.1 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序结果可靠性验证

3.2 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关生物学过程及通路共表达基因筛选

3.2.1 差异表达基因GO富集相关生物学过程共表达基因筛选

3.2.2 差异表达基因Pathway富集相关通路共表达基因筛选

3.3 鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关重要调控基因筛选

4 讨论

4.1 关于鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株转录组测序结果验证

4.2 关于鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关生物学过程及通路的筛选

4.3 关于鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株相关重要基因的筛选

5 本章结论

全文总结

致谢

主要参考文献

附录一相关培养基、溶液的配制

附录二硕士研究生期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李晨

导师: 王开功,杨琦,孙鹃

关键词: 沙门氏菌,伴侣蛋白,沙门氏菌基因缺失株,转录组分析

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

分类号: S852.61

总页数: 110

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