Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究

论文摘要

普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶,它能够专一的水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键形成直链淀粉。它可以与α-淀粉酶共同作用,完全地水解淀粉,因而在淀粉加工、啤酒酿造以及功能性药物多糖的工业生产中具有重要的作用。菌株的胞外分泌能力是衡量工程菌株性能的重要指标,高效的分泌能力可以有效的降低生产成本;淀粉的糖化一般都是在60℃、pH 4.5-pH 6.0之间的条件下进行,而且一般糖化时间为48-60小时。因此,提高重组菌株的酸碱适应性、胞外分泌能力与热稳定性对于淀粉加工过程中降低生产成本和改进生产工艺具有重要意义。本论文以Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶（PulA）为研究对象,基于多序列比对与结构域分析,构建了5个结构域截断突变体与4个定点突变体。研究了切除普鲁兰酶的不同结构域、构建不同点突变对其催化活性与酶学性质的影响,最终得到了酶学性质比较好的叠加突变体。主要的研究结果如下:（1）在Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶序列比对分析与结构域分析的基础上,以重组天然酶质粒为模板（PulA+pET-28a）,成功构建了1个N端、4个C端突变体菌株。除Puld4不具有普鲁兰酶的活性之外,其它4个截断突变体均表现出普鲁兰酶活性,而且4个截断突变体的胞外酶分泌效率随着蛋白质分子量的减小而逐渐增强,胞外酶活性占总酶活性的比例分别为13.5%、18.2%、20.1%和30.8%,与PulA重组菌株没有分泌能力相比有了很大的提高。酶学性质的分析表明,截断突变体与PulA的最适pH都为pH 6.0左右,但是截断突变体的作用pH范围变得更窄。Puld1、Puld2和Puld3与天然普鲁兰酶的最适作用温度为35℃,Puld5的最适作用温度为45℃,比天然普鲁兰酶的提高了10℃,半衰期达到了25 h,为天然酶的2.5倍,但是结构域的切除造成的空间结构的变化导致截断突变体与底物结合的能力降低了,随之催化效率也降低了。（2）基于多序列比对以及氨基酸性质分析,选择了保守区域及保守区域周围几个氨基酸作为突变位点,构建了4个定点突变体以及一个叠加突变体。突变体的酶学性质分析结果显示,突变体G603D和F654Y的比活力比重组天然酶的降低了43.7%和8.9%,突变体H611Q和F751L的比活力比重组天然酶的分别升高了64%和30.2%,叠加突变体与截断突变体Puld5相比,其胞外分泌能力提高了4%。除G603D突变体与PulA的最适作用温度都为35℃之外,其它突变体的最适温度都有所提高。除突变体G603D之外,其它普鲁兰酶突变体的热稳定性都有不同程度的提高,PulA的半衰期仅仅只有10 h左右,普鲁兰酶突变体F654Y、H611Q、F751L和Puld5/H611Q的半衰期分别为20 h、20 h、15 h和50 h,分别是天然普鲁兰酶的2倍、2倍、1.5倍和5倍,截断突变体与点突变体的相互叠加使得热稳定性得到了很大的提高。动力学参数分析结果显示,截断突变体的Kcat/Km为天然酶的1.17倍,弥补了只切除结构域造成的催化效率降低的缺点。本研究通过一系列的分子改造,探究了结构域切除以及定点突变对天然普鲁兰酶酶学性质的影响,得到了催化活性与酶学性质较为优良的叠加突变体Puld5/H611Q,为普鲁兰酶的工业化生产奠定了良好的实验基础。

论文目录

摘要

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第一章前言

1.1 普鲁兰酶概述

1.1.1 淀粉工业中的原料

1.1.2 普鲁兰酶的介绍

1.1.3 普鲁兰酶的产生菌株

1.1.4 普鲁兰酶的结构

1.1.5 普鲁兰酶的应用

1.2 普鲁兰酶的研究进展

1.2.1 产普鲁兰酶菌株的筛选与研究

1.2.2 普鲁兰酶的基因工程研究

1.2.3 普鲁兰酶的突变研究

1.3 目的意义以及主要研究内容

第二章结构域切除对普鲁兰酶分泌效率及热稳定性的影响

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒和引物

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 培养基与贮液

2.2 实验方法

2.2.1 截断突变体的克隆及大肠杆菌载体的构建

2.2.2 截断突变体在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

2.2.3 重组普鲁兰酶的酶活性测定

2.2.4 截断突变体的酶学性质分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 普鲁兰酶基因截断位置的确定

2.3.2 截断突变体的构建

2.3.3 截断突变体在大肠杆菌的诱导表达与纯化

2.3.4 截断突变体的酶学性质

2.3.5 截断突变体三维结构变化

2.4 小结

第三章普鲁兰酶的热稳定性突变研究

3.1 实验材料

3.1.1 菌株、质粒和引物

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.1.4 培养基与贮液

3.2 实验方法

3.2.1 突变体的克隆及大肠杆菌载体的构建

3.2.2 突变体在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

3.2.3 突变体普鲁兰酶的酶活测定

3.2.4 突变体的酶学性质分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 突变位点的选择

3.3.2 突变体重组菌株的构建

3.3.3 突变体在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

3.3.4 叠加突变体的构建、表达及纯化

3.3.5 突变体的酶学性质分析

3.3.6 叠加突变体的三维结构

3.4 小结

第四章总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

硕士期间发表论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏家强

导师: 陈颢

关键词: 普鲁兰酶,分子改造,热稳定性,胞外分泌,酶学性质

来源: 自然资源部第一海洋研究所

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 自然资源部第一海洋研究所

分类号: Q936

总页数: 78

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