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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

2020-12-02阅读(293)

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是以母猪繁殖障碍、各年龄猪的呼吸道症状及仔猪的高死亡率为特征的一种病毒性疾病。这种疾病对养殖业造成巨大的经济损失,因此及时准确掌握PRRSV的流行情况和疫苗免疫状况并提出正确的防控措施至关重要。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）变异快,具有免疫抑制、持续性感染的特性,这使其很难得以控制。现阶段PRRS的防控主要通过疫苗的接种和生物安全的严格把关。PRRSV抗体检测试剂盒可应用于检测血清中PRRSV抗体,监测PRRS的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。为研制特异性敏感性较好的PRRSV抗体检测方法,更好地实现PRRSV的流行病学监测及评价相关疫苗的免疫效果,本研究将PRRSV GDr180毒株N蛋白基因序列克隆到pET-32a载体中,成功构建重组克隆载体pET-32a-N并转化于大肠杆菌BL21（DE3）。通过优化诱导表达的条件,实现了N蛋白以可溶性的表达方式高效表达;通过Western blot实验,证明表达产物与PRRSV GDr180株阳性血清具有很好的反应原性和特异性;通过优化蛋白纯化条件,最终确定含100mM咪唑的洗脱液能纯化出纯度较高的N蛋白,测定蛋白浓度为250μg/mL。以纯化的N蛋白作为PRRSV抗体间接ELISA检测方法的包被抗原,对各参数和试剂进行优化;用建立的ELISA检测方法检测52份已知PRRSV抗体阴性的猪血清;并根据阴性血清样品OD450值计算其SP值的平均值（x）和标准差（s）,确定了临界值S/P值≥0.172时为阳性,S/P值<0.085时为阴性,介于两者之间为可疑。接下来对方法的特异性、重复性和敏感性进行试验,试验结果表明:用所建立的PRRSV抗体检测方法检测伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪肺炎支原体（MHP）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒2型病毒（PCV2）、副猪嗜血杆菌（HPS）等阳性血清,S/P值均小于0.085,证明建立的ELISA检测方法特异性较好;在批内重复和批间重复试验中,每个试验血清检测值之间的变异系数均小于10%,进一步表明ELISA方法有较好的重复性;敏感性试验中,强弱阳性血清80倍稀释的检测结果仍为阳性,表明建立的ELISA检测方法敏感性较好。最后,利用本试验建立的间接ELISA方法和IDEXX PRRSV ELISA抗体检测试剂盒同时检测196份临床血清样品。试验结果表明,与IDEXX公司ELISA检测试剂盒的结果相比,本试验建立的间接ELISA方法相对特异性高达96%,两者之间一致性达到91%。综上结果,表明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性敏感性良好,可应用于检测猪血清中的PRRSV抗体,监测猪繁殖与呼吸综合征的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略表
  • 1 文献综述
  •   1.1 概述
  •   1.2 病原
  •     1.2.1 病毒分类
  •     1.2.2 形态结构
  •   1.3 基因组结构
  •     1.3.1 主要非结构蛋白的功能与特性
  •     1.3.2 结构蛋白的功能与特性
  •   1.4 致病机制
  •   1.5 流行病学
  •   1.6 诊断
  •   1.7 研究目的与意义
  • 2 PRRSV-GDr180毒株N蛋白的表达及纯化
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 质粒和菌种
  •     2.1.2 主要试剂及配制方法
  •     2.1.3 主要仪器设备
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 引物的设计和合成
  •     2.2.2 PRRSV-GDr180 RNA的提取
  •     2.2.3 PRRSV-GDr180 RNA的反转录
  •     2.2.4 N基因的PCR扩增
  •     2.2.5 PRRSV的 N基因片段的纯化回收
  •     2.2.6 原核表达载体pET-32a质粒的提取
  •     2.2.7 pET-32a质粒和N基因片段的双酶切
  •     2.2.8 N基因片段与pET-32a载体连接
  •     2.2.9 连接产物转化E.coli BL21细胞
  •     2.2.10 重组载体pET-32a-N的PCR鉴定
  •     2.2.11 克隆重组载体pET-32a-N双酶切鉴定
  •     2.2.12 重组载体pET-32a-N序列测定
  •     2.2.13 不同诱导温度对N蛋白表达的影响
  •     2.2.14 不同IPTG浓度对N蛋白表达的影响
  •     2.2.15 不同诱导表达时间对N蛋白表达的影响
  •     2.2.16 N蛋白的可溶性分析
  •     2.2.17 SDS-PAGE蛋白电泳
  •     2.2.18 N蛋白的大量表达
  •     2.2.19 N蛋白的纯化
  •     2.2.20 N蛋白浓度的测定
  •     2.2.21 Western blot分析N蛋白的免疫原性
  •   2.3 试验结果
  •     2.3.1 N基因的PCR扩增结果
  •     2.3.2 克隆重组载体pET-32a-N的PCR鉴定结果
  •     2.3.3 克隆重组载体pET-32a-N的双酶切鉴定结果
  •     2.3.4 克隆重组载体pET-32a-N序列的测定结果
  •     2.3.5 克隆重组载体pET-32a-N在BL21（DE3）中的PCR鉴定结果
  •     2.3.6 不同诱导温度对N蛋白表达的影响结果
  •     2.3.7 不同IPTG浓度对N蛋白表达的影响结果
  •     2.3.8 不同诱导表达时间对N蛋白表达的影响结果
  •     2.3.9 融合表达蛋白的表达方式分析结果
  •     2.3.10 融合蛋白的纯化结果
  •     2.3.11 N蛋白浓度的测定结果
  •     2.3.12 Western blot分析N蛋白的免疫原性结果
  •   2.4 分析与讨论
  • 3 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白间接ELISA方法的建立
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 血清样品
  •     3.1.2 主要试剂及配制
  •     3.1.3 主要仪器设备
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 质控血清的制备
  •     3.2.2 工艺研究
  •     3.2.3 产品检验
  •   3.3 试验结果
  •     3.3.1 质控阴性血清的检测结果
  •     3.3.2 质控阳性血清的抗体测定结果
  •     3.3.3 酶标二抗的选定结果
  •     3.3.4 抗原最适包被浓度和待检血清最佳稀释浓度的确定结果
  •     3.3.5 包被方式的优化结果
  •     3.3.6 封闭液的选择结果
  •     3.3.7 抗原抗体最佳作用时间确定结果
  •     3.3.8 酶标抗体最佳作用时间确定结果
  •     3.3.9 酶标抗体工作浓度优化结果
  •     3.3.10 TMB底物反应时间的确定结果
  •     3.3.11 抗原保护剂的选择结果
  •     3.3.12 临界值的确定结果
  •     3.3.13 特异性检测结果
  •     3.3.14 批内重复试验结果
  •     3.3.15 批间重复试验结果
  •     3.3.16 敏感性试验结果
  •     3.3.17 同类产品比较结果
  •   3.4 讨论
  • 4 结论与展望
  •   4.1 结论
  •   4.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈汉锶

    导师: 林旭埜,田允波

    关键词: 猪繁殖与呼吸综合征,原核表达,蛋白

    来源: 仲恺农业工程学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 仲恺农业工程学院

    基金: 国家重点研发项目“猪重要疫病的诊断与检测新技术研究”-猪病诊断试剂产业化关键技术研究(课题编号2016YFD0500605)

    分类号: S852.651

    总页数: 71

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