导读:本文包含了心房肌细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:心房,细胞,重构,蛋白,通道,稳态,膜片。
心房肌细胞论文文献综述
曹哲哲,马瑞彦,蹇朝,唐富琴,肖颖彬[1]（2019）在《心房肌细胞凋亡及凋亡相关基因在房颤心房重构中的意义》一文中研究指出目的分析风湿性心脏病患者房颤发生与发展的特点,探讨心房肌细胞凋亡以及凋亡相关基因表达变化在房颤心房重构中的意义。方法统计分析瓣膜置换手术25例患者临床资料。根据心电图资料分为窦性心律组(10例)和房颤心律组(15例);术中取右心房组织,行Masson染色及天狼猩红染色,计算胶原容积分数(CVF)评价心房纤维化情况;运用TUNEL染色,荧光显微镜下观察两组细胞凋亡差异;用RT-qPCR检测两组样本凋亡相关基因的表达。结果与窦律组比较,房颤组患者LADd和RADd显着增大(均P<0.01),LVEF显着降低(P<0.01)、CVF显着增大(P<0.05)、细胞凋亡率显着增高(P<0.05)、TP53,BAX,Slug-SNAI2基因表达率显着增高(P<0.05),而BCL-2,BMP4的表达显着降低(P<0.05)。Pearson相关分析显示LADd、RADd、心房细胞凋亡率和CVF之间存在相关性。结论心房细胞的凋亡在心房重构纤维化形成过程中发挥重要作用,其机制与心肌细胞死亡后纤维组织代替性修复有关,调控心房肌细胞凋亡有望改善心房纤维化的形成。(本文来源于《心脏杂志》期刊2019年04期）
申华[2]（2019）在《Junctophilin-2调节心房肌细胞内钙稳态及心房重构影响房颤发生的作用机制研究》一文中研究指出一、研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常,并伴有较高的致残率和致死率。AF可逐渐由阵发性房颤(paroxysmal AF)进展为持续性房颤(persistent AF),是缺血性脑卒中、充血性心力衰竭及全因性死亡率增加的主要危险因素。目前AF的具体发生机制尚不明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。Calpain是一类钙离子依赖激活的半胱氨酸蛋白酶,在钙超载时其可转位至胞膜上并大量激活,水解一些蛋白底物,引起细胞结构和功能的破坏。近来研究发现,房颤患者心房肌组织中激活的Calpain-1可酶解L-型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)、钠钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)等多种心肌细胞内离子通道及结构蛋白。近期发现,位于心肌横管膜(transverse tubules,T-tubules)与肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)膜之间的膜偶联结构蛋白——亲联蛋白2(junctophilin-2,JP2)可以通过稳定肌浆网钙通道雷尼丁受体2(ryanodine receptor 2,RyR2)而发挥调节心肌细胞内钙稳态的作用,而钙稳态异常被认为是AF发生发展的重要机制之一。此外,在缺血再灌注损伤、心力衰竭等动物模型中,均发现JP2蛋白可被激活的Calpain-1所降解,提示JP2也是Calpain-1的降解底物蛋白之一。因此我们推测,在心房快速搏动、氧化应激等刺激条件下,心房肌内Calpain-1激活可通过降解重要钙稳定蛋白JP2等底物,促进房颤的发生与维持;而维持正常水平的JP2蛋白可减少RyR2的异常钙泄漏,抑制延迟后除极(delayed afterdepolarization,DAD)等电触发活动、以及可能的心房重构的发生,从而发挥其维持正常心律的关键作用。二、研究目的(一)明确JP2及Calpain-1在房颤患者及实验性房颤模型中的表达规律(二)阐明Calpain-1抑制剂通过调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制(叁)探讨JP2蛋白水平变化影响小鼠房颤易感性的作用及机制研究叁、研究方法(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化规律研究1.收集于我科行体外循环下冠状动脉搭桥术或者二尖瓣外科手术患者的心房肌标本,其中术前诊断为持续性AF者28例,维持正常窦性心律(normal sinus rhythm,NSR)者16例,于体外循环转机前采集标本,迅速转移至医院生物样本库。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。2.选取共计18只成年新西兰大白兔(2.0~2.5 kg,雄性)为实验对象,按照随机数法分别纳入假手术组(sham)和RAP组(2 w、4 w),其中每组6只。沿胸骨左缘第3肋间打开胸腔,暴露心脏,将起搏电极头端缝合固定于左心房游离壁.起搏电极尾端缝合固定于胸腹壁位置上并通过皮下与起搏器相接。起搏器起搏模式为AOO,刺激频率为1000 bpm,连续刺激4 w,以建立快速心房起搏(rapid atrial pacing,RAP)兔AF模型。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.实验动物的选择及分组本实验中,我们采用诱导性基因调控“Tet-off”系统构建心脏特异性Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)模型,作为房颤小鼠实验模型。在该系统中融合表达四环素(Tetracycline,Tet)调控的转录激活子(tet-controlled transcriptional activator,tTA),在缺少四环素或者强力霉素(doxycycline,Dox)时,tTA可以激活目的质粒转录;在四环素或者强力霉素作用下,缺少增强子使目的基因表达量很低或无法表达。开展作用及机制研究的时间点为撤除Dox药物饲料(即Tet-off系统开始目的基因过表达)后8周。在该时间点,分为以下叁组,即对照组(control),Calpain-1过表达组(CAPN 1-OE),以及Calpain-1过表达同时给予Calpain抑制剂(MDL28170,10 mg/kg,1/日,腹腔注射)处理组(CAPN 1-OE+MDL)。本部分纳入实验小鼠共计75只,其中选择无Calpain-1过表达的αMHC-tTA小鼠(Calpain/tTA-/+)作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+),雌雄不限,共计50只,采用随机数字法分为CAPN1-OE组和CAPN 1-OE+MDL组,每组25只。2.Calpain抑制剂调控小鼠房颤易感性的作用研究采用STG-3008型多通道电刺激器(MultiChannel Systems,Germany),通过连接Millar 1.1F多电极电生理导管(EPR-800,Millar Instruments),外接Labchart Pro信号采集系统(AD Instruments,Australia)同时记录心脏表面电信号和体表心电图,明确食管腔内电刺激导管的合适位置,开展经食管心脏程序性电刺激和记录。采用经食管心脏程序性电刺激方法检测各组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。3.标本收集完成相应电生理检测后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测各组心房组织JP2表达变化;采用活性检测试剂盒,评估各组心房组织Calpain 1的酶活性。4.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞钙稳态的机制研究通过Langendorff灌流酶解法成功分离成年小鼠心房肌细胞,进行5μM Fluo-4AM钙荧光标记后在激光共聚焦显微镜下检测钙稳态变化情况。激发波长/发射波长分别为488 nm/505–530 nm。刺激强度15 V/cm,频率1 Hz的规律电刺激暂停5 s后,检测钙火花(Ca~(2+)sparks)发生频率的变化。在此基础上,为了进一步明确撤药4周时JP2-OE的保护作用机制,采用钙指示剂(5μM Rhod-2 AM)小鼠心脏整体灌流的方法,原位观察整个心房组织(in situ whole heart imaging)的钙稳态异常,如钙波(Ca~(2+)waves)的发生频率情况。5.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞电重构的机制研究采用经食管心脏程序性电刺激方法,行S1S2刺激,比较心房有效不应期(atrial effective refractory period,AERP)的变化情况;采用心脏整体灌流心肌细胞膜荧光指示剂(5μM MM 4-64)30 min后,原位观察整个心房组织横管(Transverse tubules,T-tubules)结构的变化情况。6.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌结构重构的机制研究在进行完相应电生理实验之后,剪取小鼠心房肌组织称重(atrium weight),测量小鼠胫骨长度(tibia length),计算心房重量/胫骨长度(atrium weight/tibia length,AW/TL);小鼠心脏4%PFA灌流固定处理后,采用Masson trichrome染色法,检测小鼠心房纤维化程度;剪取小鼠心房肌标本,采用Western blot检测心房中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1,α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA),以及I型胶原蛋白(collagen I,Col I)等经典促纤维化信号通路的蛋白表达变化。(叁)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.心肌特异性JP2过表达小鼠、Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型的构建本实验中,我们首先构建了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE),并将其与业已建立的Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)杂交,以产生Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.实验动物的选择及分组按照基因型不同,本部分实验分为以下叁组,即对照组小鼠(control),Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)以及Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。共计纳入小鼠75只,其中选择有且仅有tTA基因阳性表达,即Calpain/tTA-/+或Calpain/JP2/tTA-/-/+的基因型小鼠作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择仅Calpain-1心脏特异性过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN1-OE组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1/JP2共同过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN 1-OE×JP2-OE组,雌雄不限,共计25只。在此基础上,按照撤除Dox药物饲料(即Calpain或者Calpain/JP2过表达激活)的时间,再细分为撤Dox饲料4周组(Dox withdrawal 4 w),以及撤Dox药物饲料8周组(Dox withdrawal 8 w)。每个时间段的系列实验动物分组同上,因此本部分实验共计纳入小鼠150只。3.各组小鼠心功能基线变化情况电生理实验开始之前,利用超声心动图检测各组小鼠心脏功能的变化情况,如左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF),收缩末左室容积(end-systolic volume,ESV),以及舒张末左室容积(end-diastolic volume,EDV)等;并评估整体心脏重构改变,比较各组小鼠心脏重量/体重(heart weight/body weight,HW/BW)以及肺脏重量/体重(lung weight/body weight,LW/BW)的变化情况。4.JP2过表达对小鼠房颤易感性的作用研究实验方法同第二部分。在相应的时间点,采用经食管心脏程序性电刺激,首先行不同基础刺激周长(basic cycle length,BCL)的连续短阵S1S1刺激,比较标准窦房结恢复时程(corrected sinus node recovery time,cSNRT)的变化情况,评价窦房结功能变化;采用burst电刺激方案,检测叁组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。5.标本采集完成相应电生理实验之后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测心房中JP2及Calpain-1的蛋白表达水平变化;采用钙蛋白酶Calpain活性检测试剂盒,评估各组小鼠心房肌组织中Calpain 1的酶活性变化情况。6.JP2调节CAPN 1-OE小鼠钙稳态的机制研究实验方法同第二部分。检测各组小鼠心房肌细胞钙火花发生频率变化情况;采用钙荧光指示剂心脏整体灌流方法,原位观察心房组织的钙波等钙泄漏事件发生情况。7.JP2调控CAPN 1-OE小鼠心房电重构的机制研究经食管心脏电刺激程序同第二部分。检测各组小鼠心房有效不应期AERP的变化情况;采用离体心脏原位T管成像技术,检测左右心房组织T管结构重构情况。8.JP2调节CAPN 1-OE小鼠结构重构的机制研究实验方法同第二部分。采用大体标本成像、心房重量/胫骨长度AW/TL评价叁组小鼠心房腔扩大情况;采用Masson染色法,检测各组小鼠心房纤维化程度;采用Western blot方法,检测各组小鼠心房组织中TGF-β1,α-SMA,以及Col I的蛋白表达水平变化。四、研究结果(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化及相关性研究1.房颤患者心肌标本中JP2及Calpain-1的表达规律持续性房颤患者心房肌组织中JP2蛋白表达水平显着下降,Calpain-1蛋白水平及其酶活性均显着升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关。2.快速心房起搏兔房颤模型中JP2及Calpain-1的表达规律在RAP兔房颤模型中,随着高频心房起搏时程延长,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐下降,Calpain-1蛋白水平及酶活性逐渐升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠异常升高的房颤易感性同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠其房颤的诱发率显着升高,房颤事件持续时长明显延长。而在撤除Dox药物饲料即日起,开始腹腔注射Calpain抑制剂MDL28170,结果提示,CAPN 1-OE+MDL处理组中,小鼠房颤诱发率、持续时间的异常升高均明显改善。2.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌Calpain-1的过度激活同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌组织Calpain 1的酶活性显着升高,伴有JP2蛋白表达水平明显下降,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌组织中的Calpain1的酶活性显着降低,而JP2蛋白表达水平得以明显恢复。3.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞异常钙稳态同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌细胞钙火花异常增多;采用心脏整体钙成像技术检测发现心房肌中异常钙波发生频率明显增多。CAPN 1-OE+MDL处理组中,上述钙火花频率增高等异常钙稳态现象明显改善,而在心脏整体灌流钙荧光指示剂染色成像中,结果提示MDL处理可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的钙稳态异常。4.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房电重构同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌AERP大幅缩短,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌AERP这一关键电重构指标明显改善。原位观测小鼠心房肌细胞中T管结果提示,在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而MDL处理组可使CAPN 1-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善。5.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的结构重构CAPN 1-OE 8周组小鼠心房可见显着的双心房腔扩大,且AW/TL显着增大,Masson染色提示心肌纤维化明显增多,WB结果显示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等纤维化相关指标均明显激活;而Calpain抑制剂MDL处理后,CAPN 1-OE小鼠心房扩张、心室肥厚显着改善,WB结果提示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等蛋白表达水平显着下调,Masson染色同样证实了CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌纤维化程度的改善。(叁)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.成功建立了Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型在该部分,首先建立了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE)。与对照组小鼠相比,在撤除Dox药物饲料4周,即JP2过表达激活4周时,JP2-OE小鼠的心房肌组织中JP2的蛋白表达水平显着增高;将JP2-OE小鼠与CAPN 1-OE小鼠杂交,即可得到Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.在撤除Dox药物饲料4周时,心脏超声结果提示各组小鼠左室功能未见明显异常超声心动图结果显示,对照组小鼠,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等3组小鼠,其左室射血分数LVEF,收缩末左室容积ESV,以及舒张末左室容积EDV等未见显着差别;取小鼠心脏、肺脏等称重后,各组小鼠心脏重量/体重HW/BW、肺脏重量/体重LW/BW的变化情况等未见显着差别。3.在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠均出现较明显的左室功能受损超声心动图结果显示,同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等,其LVEF显着下降,而ESV及EDV等指标显着升高,提示存在明显的左心收缩舒张功能障碍;此外,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等HW/BW显着增大,但LW/BW未见显着差别,提示存在显着的心脏肥厚,但未见明显的肺脏淤血等。4.叁组小鼠窦房结传导功能均未见明显异常在撤除Dox药物饲料4周时,检测叁组小鼠心房标准窦房结恢复时程cSNRT后发现,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标均未见异常,提示CAPN 1-OE和/或JP2-OE并未对小鼠窦房结功能产生影响。在撤除Dox药物饲料8周时,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标变化均未达到统计学差异,提示窦房结功能仍维持正常水平。5.叁组小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性的变化情况JP2过表达4周,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性均显着上升;JP2过表达8周时,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌Calpain-1酶活性呈进一步升高。提示JP2-OE并不能改变Calpain-1酶活性。6.在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显着降低CAPN 1-OE小鼠房颤的诱发率和持续时间同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后可诱发出房颤的比例显着增高,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率明显降低,且房颤事件发作持续时间也明显缩短。7.在撤除Dox药物饲料8周时,JP2-OE未能改善CAPN 1-OE小鼠明显升高的房颤诱发率CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后房颤诱发率显着增高,而JP2-OE并未使能显着改善CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率,但仍可明显缩短房颤事件的发作持续时间。8.叁组小鼠心房肌JP2蛋白表达水平变化情况在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌组织内的JP2蛋白表达水平;但在撤除Dox药物饲料8周时则无法维持心房肌JP2正常水平,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中的JP2蛋白含量也显着下降。提示JP2表达水平逐渐下降,是导致CAPN 1-OE小鼠房颤易感性增加的机制之一,而维持正常水平的JP2蛋白水平,是JP2-OE发挥调节房颤易感性的蛋白基础。9.JP2过表达4周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中钙火花发生频率明显改善。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌中自发性钙波等异常钙释放事件显着增多,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌中钙波发生频率明显改善,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。10.JP2过表达8周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同心房肌钙波发生频率异常增多的CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌自发性钙波发生频率未见明显减少,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。11.JP2过表达4周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠经食管程序性S1S2电刺激后可发现其AERP显着缩短,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的AERP得以明显改善;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,在撤除Dox药物饲料4周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而对照组小鼠心房肌细胞内可见规律存在的T管,且广泛分布于大部分心房肌细胞中,JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善,完整、规律排列的T管系统有助于细胞电信号的精细传递。12.JP2过表达8周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠经S1S2食管电刺激后发现AERP均显着缩短;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,JP2过表达8周时,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房T管系统的完整性未见明显改善,提示此时JP2过表达未能有效改善房颤小鼠的电重构。13.JP2过表达4周对房颤小鼠心房结构重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房重量/胫骨长度AW/TL明显增大,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠AW/TL明显改善,而大体心脏标本也可得出同一结论,肉眼可见CAPN 1-OE小鼠双心房,尤其是左心房明显扩大,而CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔扩大明显改善;心房肌组织纤维化也是房颤维持的重要基质改变。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均显着增高,WB结果显示CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房肌组织中经典促纤维化信号通路TGF-β1/α-SMA/Col I均明显激活,提示JP2-OE参与调控小鼠心房腔的大小,未能有效改善房颤小鼠心房纤维化信号通路的激活。14.JP2过表达8周对房颤小鼠心房结构重构的影响JP2过表达8周时,同CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔的扩大未得到有效抑制。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均进一步增高。五、研究结论1.在房颤患者及房颤实验模型中,随着心房快速刺激持续存在,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐降低,而Calpain-1表达明显上调且其酶活性显着激活,且心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关;2.在CAPN 1-OE小鼠房颤模型中,JP2蛋白是Calpain-1重要降解底物之一。在Calpain-1蛋白过表达8周时,MDL28170通过显着抑制Calpain-1酶活性,并改善心房肌蛋白JP2的表达水平,显着改善房颤的易感性;3.心房肌细胞JP2蛋白的变化,可通过调节房颤小鼠心房肌细胞钙稳态(钙火花、钙波等钙异常释放事件),进而影响心房电重构(AERP变化、T管结构重构)及结构重构(心房腔扩大、心房纤维化),从而影响小鼠房颤易感性(房颤的发生率及持续时间);JP2-OE作为潜在的治疗房颤的可能手段,其调控房颤易感性的作用有一定的时程性。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2019-05-01）
缪炜伦,陈明龙,施姣姣[3]（2019）在《高频电刺激人源诱导多能干细胞分化心房肌细胞构建心房肌细胞损伤模型》一文中研究指出目的通过高频电刺激人源诱导多能干细胞分化心房肌细胞构建细胞水平损伤模型,探讨损伤发生的机制。方法利用人源诱导多能干细胞技术并通过视黄酸(RA)诱导分化特异性心房肌细胞,并通过免疫荧光染色以及实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证心房肌特异性核蛋白标志物NR2F2的表达。将分离培养的心房肌细胞分为高频组、对照组。高频组对心房肌细胞以频率7 Hz,持续24 h的高频电刺激。对照组不予电刺激。利用共聚焦显微镜检测两组钙瞬变。利用Annexin V/propidium iodide (AV/PI)分析两组细胞凋亡率的变化。通过qRT-PCR检测凋亡相关基因(bax以及bcl-2)以及钙离子通道RyR2表达量变化。4-苯基丁酸钠(4PBA)处理高频电刺激组细胞后检测细胞钙瞬变。结果利用人源诱导多能干细胞技术能获得较多的心房肌细胞。高频组荧光强度变化值/最低荧光强度(ΔF/F0)较对照组明显下降,同时RYR2基因表达量下降。利用4PBA预处理高频组细胞后,ΔF/F0明显增加。高频组早期凋亡及晚期凋亡的细胞比率之和明显高于对照组,同时促凋亡基因bax表达上调而抑制凋亡基因bcl-2表达下降。结论高频电刺激人源诱导多能干细胞分化的心房肌细胞可致细胞内钙稳态异常以及细胞凋亡增加,构成心房肌细胞的电损伤。(本文来源于《中国心脏起搏与心电生理杂志》期刊2019年02期）
曾祥君,肖学钧,吴岳恒,黄焕雷[4]（2019）在《慢性房颤心房肌细胞成分结构的基因本体法分析》一文中研究指出目的应用基因本体法研究慢性房颤心房肌细胞成分分子病理异常。方法选择接受二尖瓣置换术的二尖瓣狭窄为主的48例风湿性心脏病患者,其中慢性房颤24例(慢性房颤组)、窦性心律24例(窦性心律组)。取两组右心耳心肌,采用Western blotting法检测钙调蛋白(CaM)表达,应用全基因组表达谱芯片检测技术,获取数据行主成分、系统聚类及细胞组件基因本体分析。结果慢性房颤组、窦性心律组心房肌组织中CaM相对表达量分别为0.199±0.058、0.135±0.034,两组相比P<0.05。主成分分析显示,慢性房颤组和窦性心律组心房肌样本在二维空间上明确分布于不同的区域;系统聚类将所有样本聚为慢性房颤和窦性心律两类;DIVID系统在线分析显示,慢性房颤和窦性心律差异表达基因在细胞成分本体有肌原纤维、细胞外基质、胶原叁聚体等37个注释条目异常;注释条目富集聚类显示,心房肌结构受房颤影响依次为细胞外成分、收缩纤维及细胞骨架等。结论慢性房颤与窦性心律心房肌基因表达模式明显不同,慢性房颤心房肌细胞外结构、收缩纤维、细胞骨架、细胞膜、膜锚蛋白、内质网、线粒体、脂肪及脂蛋白颗粒等细胞成分在分子水平与窦性心律心房肌存在明显异常。(本文来源于《山东医药》期刊2019年07期）
覃智芳,田银,何成龙,李浩,袁正强[5]（2018）在《ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L和KAch通道表达中的作用》一文中研究指出目的:探讨ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L及KAch通道中的表达作用。方法:实验与2014年9年开始截止到2017年7月,选取60只实验乳鼠随机分为低药物浓度组和高药物浓度组,每组各30只;低药物浓度组NE 0.1μmol/L,Ach 0.1μmol/L;高药物浓度组NE 10μmol/L,Ach 10μmol/L进行干预。应用实时荧光定量RT-PCR和免疫组化α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)染色鉴定心肌细胞。进行检测2两组大鼠乳鼠心房肌细胞中的L型钙通道(Ca-L)和乙酰胆碱敏感钾通道(KAch)相关基因和蛋白表达。结果:研究显示,ANS活性与乳鼠心房肌细胞Ca-L及KAhc通道的表达转录水平呈正相关性。结论:ANS活性在乳鼠心房肌细胞Ca-L和KAch通道中影响了诸多因子的水平表达。(本文来源于《影像研究与医学应用》期刊2018年20期）
陈茜,王容,项国剑,李泱,林风辉[6]（2018）在《乳鼠窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌细胞动作电位比较》一文中研究指出目的研究乳鼠窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌细胞的动作电位。方法选12只新生24h内的Wistar大鼠乳鼠,分离培养窦房结细胞、心房肌细胞和心室肌细胞,运用全细胞膜片钳技术记录动作电位。结果窦房结细胞体积小,细而长,呈长梭形,搏动频率为(152.1±10.9)min-1;心房肌细胞体积亦较小,梭形或叁角形,搏动频率为(116.3±8.6)min-1;心室肌细胞体积较大,可伸出伪足并交织成网,呈短梭形、多角形或不规则形,搏动频率为(92.4±9.3)min-1,3种细胞的搏动频率差别均有统计学意义(P<0.01)。3种细胞的静息电位分别为(-41.3±4.0),(-50.7±2.9)及(-59.8±2.1)mV,差别无统计学意义(P>0.05)。心室肌细胞的APD20,APD50和APD90均较心房肌细胞延长,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论 3种细胞形态各异,窦房结细胞具有自发性搏动,心室肌细胞动作电位时程较心房肌细胞长。(本文来源于《福建医科大学学报》期刊2018年04期）
余奕言[7]（2018）在《血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对心房肌细胞小电导钙激活钾通道（SK2）作用机制研究》一文中研究指出目的:肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS)的激活与房颤(Atrial Fibrillation,AF)的发生密切相关,是导致心房电重构和结构重构的作用机制之一。而小电导钙激活钾通道(Small conductance calcium-activated potassium channels,SK通道)尤其是SK2作为SK通道中最重要的亚型与房颤的发生和发展密切相关。研究表明在快速起搏的犬模型上,SK通道的阻滞剂NS8593显着降低AF的发生率和房颤持续时间。本课题组前期结果也表明,在快速起搏的犬模型上,快速起搏组(pacing组)血清及左房组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度升高,pacing+AngⅡ组房颤的诱发率也明显增加,而pacing+AngⅡ+缬沙坦(Valsartan)组可明显抑制这一作用,SK通道阻断剂NS8593可明显抑制pacing+AngⅡ组房颤的诱发率和持续时间。因此推测AngⅡ可能通过影响SK2通道来参与房颤的发生发展,但其分子机制还不清楚。方法:(1)检测AngⅡ对大鼠心房组织及细胞SK2通道基因和蛋白的表达变化:(1)采用微量渗透压泵的方式泵入AngⅡ(200ng/kg/min,持续14天),建立AngⅡ慢性处理的大鼠模型,14天后取出心房组织,用qRT-PCR检测KCNN2基因的表达,用Western blotting技术检测SK2蛋白的表达变化;(2)采用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶的方法分离乳大鼠心房肌细胞,并随机分为control组、1.5μM AngⅡ组、1.5μM AngⅡ+10μM Valsartan(AngⅡ 1型受体阻滞剂)组、1.5μM AngⅡ+10μM PD123319(AngⅡ 2型受体阻滞剂)组,处理72h后分别用qRT-PCR及Western blotting检测SK2基因和蛋白表达的变化;(2)生物素法提取膜蛋白检测Ang Ⅱ对乳鼠心房肌细胞膜上SK2通道蛋白以及表达在HEK293T细胞系上的SK2通道膜蛋白的影响。(3)免疫共沉淀法检测表达在HEK293T细胞系上SK2通道蛋白与AT1R或AT2R之间的相互作用关系。(4)细胞免疫荧光结合全内反射成像技术检测AngⅡ对乳鼠心房肌细胞上SK2通道蛋白转运的影响。(5)流式细胞术检测AngⅡ对表达在HEK293T细胞系上的SK2通道蛋白转运的影响。(6)通过全细胞膜片钳技术检测AngⅡ(1.5uM)对单独表达SK2、共表达SK2+AT1R和共表达SK2+AT2R的细胞系CHOK1-SK2-GFP上的SK2通道电流幅度的差异。结果:(1)AngⅡ增加大鼠心房组织和心房肌细胞SK2通道基因和蛋白的表达:(1)AngⅡ增加SD大鼠心房组织KCNN2基因的表达(n=7,P<0.05),同时也明显增加SK2通道总蛋白的表达(n=7,P<0.01);(2)1.5μM AngⅡ增加乳大鼠心房肌细胞KCNN2通道基因的表达(n=5,P<0.01),且10μM Valsartan可抑制这一效应(n=5,P<0.01);1.5μM AngⅡ上调乳鼠心房肌细胞SK2通道蛋白的表达(n=5,P<0.01),同样可被10μM Valsartan所逆转(n=5,P<0.01);(2)AngⅡ增加SK2通道膜蛋白的表达:(1)1.5μM AngⅡ增加乳鼠心房肌组织SK2通道膜蛋白的表达(n=6,P<0.01),且可被10μM Valsartan所逆转(n=5,P<0.05)。(2)在SK2和AT1R共表达的HEK293T细胞系上,1.5μM AngⅡ增加SK2通道膜蛋白的表达(n=5,P<0.05);而在SK2和AT2R共表达的HEK293T细胞系上,1.5μM AngⅡ并不引起SK2通道膜蛋白的增加(n=4,P>0.05)。(3)SK2与AT1R之间存在蛋白间相互作用:在共表达SK2和AT1R或共表达SK2和AT2R的HEK293T细胞系上,通过免疫共沉淀检测SK2与AT1R/AT2R之间的相互作用发现SK2与AT1R之间存在蛋白间相互作用,而SK2与AT2R之间的相互作用不明显。(4)1.5μM AngⅡ促进SK2通道向膜上转运:(1)1.5μM AngⅡ促进乳鼠心房肌细胞上SK2通道蛋白的转运;(2)在共表达SK2和AT1R的HEK293T细胞中,1.5μM AngⅡ可促进SK2向膜上的转运(n=3,P<0.01);而在共表达SK2和AT2R的HEK293T细胞中,1.5μM AngⅡ对SK2蛋白向膜上的转运没有明显的影响(n=3,P>0.05);在单独表达SK2的HEK293T细胞中,1.5μM AngⅡ对SK2向膜上的转运也没有明显的影响(n=3,P>0.05)。(5)AngⅡ对SK2通道电流幅度的影响:(1)1.5μM AngⅡ可增加转染了AT1R的CHOK1-SK2-GFP细胞系上的SK2通道电流幅度;(2)1.5μM AngⅡ对转染了AT2R的CHOK1-SK2-GFP细胞系上的SK2通道电流幅度没有明显的影响;(3)1.5μM AngⅡ对没有转染受体的CHOK1-SK2-GFP细胞系中的SK2通道电流幅度也没有明显影响。结论:RAAS激活与房颤的发生密切相关,AngⅡ可通过AT1受体增加SK2通道蛋白向膜上转运,表现为I_(SK)增加。AngⅡ上调SK2通道参与了心房电重构过程,这可能是房颤发生和维持的机制之一。(本文来源于《西南医科大学》期刊2018-05-01）
陈晨,王瑞,蔡忠琦,杨易,林琨[8]（2017）在《大蒜素对大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流的影响》一文中研究指出目的观察大蒜素对大鼠单个心房肌细胞钾电流的作用。方法灌流酶法分离大鼠单个心房肌细胞,细胞外局部灌流法给药,采用全细胞膜片钳技术记录大鼠单个心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)。结果在+50 m V电压下,30μmol·L-1大蒜素可使大鼠心房肌细胞Ito峰值由(20.5±2.2)p A/p F降低至(11.3±2.1)p A/p F(P<0.01,n=12),电流-电压曲线下移,该过程呈浓度依赖性和电压依赖性特点,半数抑制浓度(IC50)为(19.0±2.5)μmol·L-1。门控动力学研究显示,大蒜素可使Ito通道稳态激活曲线右移,恢复时间延长导致激活过程减慢,且失活后再激活延迟。结论大蒜素可通过抑制通道的激活及失活后的恢复而降低心房肌细胞Ito。(本文来源于《医药导报》期刊2017年11期）
张松,沈冰冰,李飞,朱启仁,王志荣[9]（2017）在《白藜叁醇通过下调microRNA-21减轻快速电刺激所致心房肌细胞电重构》一文中研究指出目的:研究白藜叁醇(resveratrol,RSV)对快速电刺激(rapid electrical stimulation,RES)导致乳鼠心房肌细胞电重构时微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)表达的影响,探讨RSV通过miR-21参与电重构的可能机制。方法:采用胰酶、Ⅰ型胶原酶双酶法及差速贴壁法分离培养乳鼠心房肌细胞。通过RES建立乳鼠心房肌细胞房颤模型,心房肌细胞随机分为4组:空白对照(control)组、RSV组、RES组和RSV+RES组。为了证实RSV是否通过调控miR-21的表达参与电重构,除了上述4组,另增加过表达和沉默miR-21组:RES+阴性对照组(RES+NC组)、RES+miR-21 mimics组、RES+miR-21 mimics+RSV组、RES+miR-21 inhibitor组和RES+miR-21 inhibitor+RSV组。CCK-8法检测心房肌细胞活性以确定RSV最佳作用浓度及时间,q PCR法检测各组细胞内miR-21及L型钙离子通道CACNA1C、CACNB2 mRNA的表达水平,Western blot检测L型钙离子通道Cav1.2和Cavβ_2 的蛋白表达水平。结果:与control组相比,RES组miR-21表达明显上调(P<0.05),加入RSV预处理后miR-21表达下调(P<0.05)。与RES+miR-21 mimics组相比,RES+miR-21 mimics+RSV组miR-21表达下调(P<0.05),而CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ_2 蛋白表达量增加(P<0.05)。与RES组比,RES+miR-21 inhibitor和RES+miR-21 inhibitor+RSV组的miR-21表达下调(P<0.05),CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ_2 蛋白表达量增加,但RES+miR-21 inhibitor组与RSV+RES组比,miR-21表达、CACNA1C和CACNB2 mRNA及Cav1.2和Cavβ_2 蛋白表达量的差异无统计学显着性。结论:在快速电刺激乳鼠心房肌细胞模拟房颤模型中,RSV干预可能通过下调miR-21表达而调控其下游靶基因这一途径来减轻心房肌细胞电重构。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2017年08期）
王凌鹏,崔蕴文,罗健[10]（2017）在《转SERCA 2a基因对急性心房颤动模型心房肌细胞L型钙通道影响的研究》一文中研究指出目的:研究AAV9-SERCA 2a基因转染对急性心房颤动(房颤)动物模型心房肌细胞上L型钙通道表达的影响。方法:采用60只新西兰大白兔为实验对象,采用心包注射法转染AAV9-SERCA 2a基因;将实验对象随机分为4组:房颤组、转荧光蛋白房颤组、转SERCA 2a基因房颤组和对照组。转染后建立急性房颤模型,采用膜片钳及荧光免疫组织化学法检测心房肌细胞上L型钙通道的电流变化及其L型钙通道蛋白表达的情况。结果:转SERCA 2a基因房颤组心房肌细胞上LVDCCa1c蛋白表达明显高于房颤组(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义。转SERCA 2a基因房颤组心房肌细胞上L型钙通道电流密度高于房颤组,差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义。结论:转SERCA 2a基因治疗可减少急性房颤模型心房肌细胞钙超载,减少房颤对L型钙通道电流密度的影响,对防止心脏电重构具有积极的意义。(本文来源于《临床心血管病杂志》期刊2017年05期）
心房肌细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
一、研究背景心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常,并伴有较高的致残率和致死率。AF可逐渐由阵发性房颤(paroxysmal AF)进展为持续性房颤(persistent AF),是缺血性脑卒中、充血性心力衰竭及全因性死亡率增加的主要危险因素。目前AF的具体发生机制尚不明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。Calpain是一类钙离子依赖激活的半胱氨酸蛋白酶,在钙超载时其可转位至胞膜上并大量激活,水解一些蛋白底物,引起细胞结构和功能的破坏。近来研究发现,房颤患者心房肌组织中激活的Calpain-1可酶解L-型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)、钠钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)等多种心肌细胞内离子通道及结构蛋白。近期发现,位于心肌横管膜(transverse tubules,T-tubules)与肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)膜之间的膜偶联结构蛋白——亲联蛋白2(junctophilin-2,JP2)可以通过稳定肌浆网钙通道雷尼丁受体2(ryanodine receptor 2,RyR2)而发挥调节心肌细胞内钙稳态的作用,而钙稳态异常被认为是AF发生发展的重要机制之一。此外,在缺血再灌注损伤、心力衰竭等动物模型中,均发现JP2蛋白可被激活的Calpain-1所降解,提示JP2也是Calpain-1的降解底物蛋白之一。因此我们推测,在心房快速搏动、氧化应激等刺激条件下,心房肌内Calpain-1激活可通过降解重要钙稳定蛋白JP2等底物,促进房颤的发生与维持;而维持正常水平的JP2蛋白可减少RyR2的异常钙泄漏,抑制延迟后除极(delayed afterdepolarization,DAD)等电触发活动、以及可能的心房重构的发生,从而发挥其维持正常心律的关键作用。二、研究目的(一)明确JP2及Calpain-1在房颤患者及实验性房颤模型中的表达规律(二)阐明Calpain-1抑制剂通过调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制(叁)探讨JP2蛋白水平变化影响小鼠房颤易感性的作用及机制研究叁、研究方法(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化规律研究1.收集于我科行体外循环下冠状动脉搭桥术或者二尖瓣外科手术患者的心房肌标本,其中术前诊断为持续性AF者28例,维持正常窦性心律(normal sinus rhythm,NSR)者16例,于体外循环转机前采集标本,迅速转移至医院生物样本库。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。2.选取共计18只成年新西兰大白兔(2.0~2.5 kg,雄性)为实验对象,按照随机数法分别纳入假手术组(sham)和RAP组(2 w、4 w),其中每组6只。沿胸骨左缘第3肋间打开胸腔,暴露心脏,将起搏电极头端缝合固定于左心房游离壁.起搏电极尾端缝合固定于胸腹壁位置上并通过皮下与起搏器相接。起搏器起搏模式为AOO,刺激频率为1000 bpm,连续刺激4 w,以建立快速心房起搏(rapid atrial pacing,RAP)兔AF模型。检测心房肌组织中JP2及Calpain-1的蛋白表达变化,以及Calpain-1酶活性的变化情况。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.实验动物的选择及分组本实验中,我们采用诱导性基因调控“Tet-off”系统构建心脏特异性Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)模型,作为房颤小鼠实验模型。在该系统中融合表达四环素(Tetracycline,Tet)调控的转录激活子(tet-controlled transcriptional activator,tTA),在缺少四环素或者强力霉素(doxycycline,Dox)时,tTA可以激活目的质粒转录;在四环素或者强力霉素作用下,缺少增强子使目的基因表达量很低或无法表达。开展作用及机制研究的时间点为撤除Dox药物饲料(即Tet-off系统开始目的基因过表达)后8周。在该时间点,分为以下叁组,即对照组(control),Calpain-1过表达组(CAPN 1-OE),以及Calpain-1过表达同时给予Calpain抑制剂(MDL28170,10 mg/kg,1/日,腹腔注射)处理组(CAPN 1-OE+MDL)。本部分纳入实验小鼠共计75只,其中选择无Calpain-1过表达的αMHC-tTA小鼠(Calpain/tTA-/+)作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+),雌雄不限,共计50只,采用随机数字法分为CAPN1-OE组和CAPN 1-OE+MDL组,每组25只。2.Calpain抑制剂调控小鼠房颤易感性的作用研究采用STG-3008型多通道电刺激器(MultiChannel Systems,Germany),通过连接Millar 1.1F多电极电生理导管(EPR-800,Millar Instruments),外接Labchart Pro信号采集系统(AD Instruments,Australia)同时记录心脏表面电信号和体表心电图,明确食管腔内电刺激导管的合适位置,开展经食管心脏程序性电刺激和记录。采用经食管心脏程序性电刺激方法检测各组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。3.标本收集完成相应电生理检测后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测各组心房组织JP2表达变化;采用活性检测试剂盒,评估各组心房组织Calpain 1的酶活性。4.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞钙稳态的机制研究通过Langendorff灌流酶解法成功分离成年小鼠心房肌细胞,进行5μM Fluo-4AM钙荧光标记后在激光共聚焦显微镜下检测钙稳态变化情况。激发波长/发射波长分别为488 nm/505–530 nm。刺激强度15 V/cm,频率1 Hz的规律电刺激暂停5 s后,检测钙火花(Ca~(2+)sparks)发生频率的变化。在此基础上,为了进一步明确撤药4周时JP2-OE的保护作用机制,采用钙指示剂(5μM Rhod-2 AM)小鼠心脏整体灌流的方法,原位观察整个心房组织(in situ whole heart imaging)的钙稳态异常,如钙波(Ca~(2+)waves)的发生频率情况。5.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌细胞电重构的机制研究采用经食管心脏程序性电刺激方法,行S1S2刺激,比较心房有效不应期(atrial effective refractory period,AERP)的变化情况;采用心脏整体灌流心肌细胞膜荧光指示剂(5μM MM 4-64)30 min后,原位观察整个心房组织横管(Transverse tubules,T-tubules)结构的变化情况。6.Calpain抑制剂调节小鼠心房肌结构重构的机制研究在进行完相应电生理实验之后,剪取小鼠心房肌组织称重(atrium weight),测量小鼠胫骨长度(tibia length),计算心房重量/胫骨长度(atrium weight/tibia length,AW/TL);小鼠心脏4%PFA灌流固定处理后,采用Masson trichrome染色法,检测小鼠心房纤维化程度;剪取小鼠心房肌标本,采用Western blot检测心房中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1,α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA),以及I型胶原蛋白(collagen I,Col I)等经典促纤维化信号通路的蛋白表达变化。(叁)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.心肌特异性JP2过表达小鼠、Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型的构建本实验中,我们首先构建了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE),并将其与业已建立的Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)杂交,以产生Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.实验动物的选择及分组按照基因型不同,本部分实验分为以下叁组,即对照组小鼠(control),Calpain-1过表达小鼠(CAPN 1-OE)以及Calpain和JP2共同过表达小鼠(CAPN 1-OE×JP2-OE)。共计纳入小鼠75只,其中选择有且仅有tTA基因阳性表达,即Calpain/tTA-/+或Calpain/JP2/tTA-/-/+的基因型小鼠作为对照组,雌雄不限,共计25只;选择仅Calpain-1心脏特异性过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN1-OE组,雌雄不限,共计25只;选择心脏特异性Calpain-1/JP2共同过表达组小鼠(Calpain/tTA+/+或Calpain/JP2/tTA+/-/+)为CAPN 1-OE×JP2-OE组,雌雄不限,共计25只。在此基础上,按照撤除Dox药物饲料(即Calpain或者Calpain/JP2过表达激活)的时间,再细分为撤Dox饲料4周组(Dox withdrawal 4 w),以及撤Dox药物饲料8周组(Dox withdrawal 8 w)。每个时间段的系列实验动物分组同上,因此本部分实验共计纳入小鼠150只。3.各组小鼠心功能基线变化情况电生理实验开始之前,利用超声心动图检测各组小鼠心脏功能的变化情况,如左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF),收缩末左室容积(end-systolic volume,ESV),以及舒张末左室容积(end-diastolic volume,EDV)等;并评估整体心脏重构改变,比较各组小鼠心脏重量/体重(heart weight/body weight,HW/BW)以及肺脏重量/体重(lung weight/body weight,LW/BW)的变化情况。4.JP2过表达对小鼠房颤易感性的作用研究实验方法同第二部分。在相应的时间点,采用经食管心脏程序性电刺激,首先行不同基础刺激周长(basic cycle length,BCL)的连续短阵S1S1刺激,比较标准窦房结恢复时程(corrected sinus node recovery time,cSNRT)的变化情况,评价窦房结功能变化;采用burst电刺激方案,检测叁组小鼠AF的诱发率和持续时间的变化情况。5.标本采集完成相应电生理实验之后,处死小鼠收集心脏标本,用于后续分子生物学、共聚焦成像等实验研究。采用Western blot检测心房中JP2及Calpain-1的蛋白表达水平变化;采用钙蛋白酶Calpain活性检测试剂盒,评估各组小鼠心房肌组织中Calpain 1的酶活性变化情况。6.JP2调节CAPN 1-OE小鼠钙稳态的机制研究实验方法同第二部分。检测各组小鼠心房肌细胞钙火花发生频率变化情况;采用钙荧光指示剂心脏整体灌流方法,原位观察心房组织的钙波等钙泄漏事件发生情况。7.JP2调控CAPN 1-OE小鼠心房电重构的机制研究经食管心脏电刺激程序同第二部分。检测各组小鼠心房有效不应期AERP的变化情况;采用离体心脏原位T管成像技术,检测左右心房组织T管结构重构情况。8.JP2调节CAPN 1-OE小鼠结构重构的机制研究实验方法同第二部分。采用大体标本成像、心房重量/胫骨长度AW/TL评价叁组小鼠心房腔扩大情况;采用Masson染色法,检测各组小鼠心房纤维化程度;采用Western blot方法,检测各组小鼠心房组织中TGF-β1,α-SMA,以及Col I的蛋白表达水平变化。四、研究结果(一)Calpain-1及JP2在房颤患者和实验性房颤模型中的变化及相关性研究1.房颤患者心肌标本中JP2及Calpain-1的表达规律持续性房颤患者心房肌组织中JP2蛋白表达水平显着下降,Calpain-1蛋白水平及其酶活性均显着升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关。2.快速心房起搏兔房颤模型中JP2及Calpain-1的表达规律在RAP兔房颤模型中,随着高频心房起搏时程延长,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐下降,Calpain-1蛋白水平及酶活性逐渐升高,心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关。(二)Calpain-1抑制剂调控JP2在小鼠房颤模型中的作用及机制研究1.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠异常升高的房颤易感性同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠其房颤的诱发率显着升高,房颤事件持续时长明显延长。而在撤除Dox药物饲料即日起,开始腹腔注射Calpain抑制剂MDL28170,结果提示,CAPN 1-OE+MDL处理组中,小鼠房颤诱发率、持续时间的异常升高均明显改善。2.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌Calpain-1的过度激活同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌组织Calpain 1的酶活性显着升高,伴有JP2蛋白表达水平明显下降,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌组织中的Calpain1的酶活性显着降低,而JP2蛋白表达水平得以明显恢复。3.Calpain抑制剂显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞异常钙稳态同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌细胞钙火花异常增多;采用心脏整体钙成像技术检测发现心房肌中异常钙波发生频率明显增多。CAPN 1-OE+MDL处理组中,上述钙火花频率增高等异常钙稳态现象明显改善,而在心脏整体灌流钙荧光指示剂染色成像中,结果提示MDL处理可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的钙稳态异常。4.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房电重构同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE 8周组小鼠心房肌AERP大幅缩短,而CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌AERP这一关键电重构指标明显改善。原位观测小鼠心房肌细胞中T管结果提示,在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而MDL处理组可使CAPN 1-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善。5.Calpain抑制剂可以明显改善CAPN 1-OE小鼠心房肌的结构重构CAPN 1-OE 8周组小鼠心房可见显着的双心房腔扩大,且AW/TL显着增大,Masson染色提示心肌纤维化明显增多,WB结果显示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等纤维化相关指标均明显激活;而Calpain抑制剂MDL处理后,CAPN 1-OE小鼠心房扩张、心室肥厚显着改善,WB结果提示心房肌组织中TGF-β1,α-SMA以及Col I等蛋白表达水平显着下调,Masson染色同样证实了CAPN 1-OE+MDL小鼠心房肌纤维化程度的改善。(叁)JP2蛋白水平变化调控小鼠房颤易感性的作用及机制研究1.成功建立了Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型在该部分,首先建立了心肌特异性JP2过表达小鼠(JP2-OE)。与对照组小鼠相比,在撤除Dox药物饲料4周,即JP2过表达激活4周时,JP2-OE小鼠的心房肌组织中JP2的蛋白表达水平显着增高;将JP2-OE小鼠与CAPN 1-OE小鼠杂交,即可得到Calpain-1/JP2双基因共同过表达小鼠模型(CAPN 1-OE×JP2-OE)。2.在撤除Dox药物饲料4周时,心脏超声结果提示各组小鼠左室功能未见明显异常超声心动图结果显示,对照组小鼠,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等3组小鼠,其左室射血分数LVEF,收缩末左室容积ESV,以及舒张末左室容积EDV等未见显着差别;取小鼠心脏、肺脏等称重后,各组小鼠心脏重量/体重HW/BW、肺脏重量/体重LW/BW的变化情况等未见显着差别。3.在撤除Dox药物饲料8周时,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠均出现较明显的左室功能受损超声心动图结果显示,同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等,其LVEF显着下降,而ESV及EDV等指标显着升高,提示存在明显的左心收缩舒张功能障碍;此外,CAPN 1-OE小鼠以及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠等HW/BW显着增大,但LW/BW未见显着差别,提示存在显着的心脏肥厚,但未见明显的肺脏淤血等。4.叁组小鼠窦房结传导功能均未见明显异常在撤除Dox药物饲料4周时,检测叁组小鼠心房标准窦房结恢复时程cSNRT后发现,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标均未见异常,提示CAPN 1-OE和/或JP2-OE并未对小鼠窦房结功能产生影响。在撤除Dox药物饲料8周时,对照组小鼠、CAPN 1-OE小鼠及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠中该指标变化均未达到统计学差异,提示窦房结功能仍维持正常水平。5.叁组小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性的变化情况JP2过表达4周,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中Calpain-1酶活性均显着上升;JP2过表达8周时,CAPN 1-OE小鼠、CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌Calpain-1酶活性呈进一步升高。提示JP2-OE并不能改变Calpain-1酶活性。6.在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显着降低CAPN 1-OE小鼠房颤的诱发率和持续时间同对照组小鼠相比,CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后可诱发出房颤的比例显着增高,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率明显降低,且房颤事件发作持续时间也明显缩短。7.在撤除Dox药物饲料8周时,JP2-OE未能改善CAPN 1-OE小鼠明显升高的房颤诱发率CAPN 1-OE小鼠经burst电刺激后房颤诱发率显着增高,而JP2-OE并未使能显着改善CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠房颤的诱发率,但仍可明显缩短房颤事件的发作持续时间。8.叁组小鼠心房肌JP2蛋白表达水平变化情况在撤除Dox药物饲料4周时,JP2-OE可显着改善CAPN 1-OE小鼠心房肌组织内的JP2蛋白表达水平;但在撤除Dox药物饲料8周时则无法维持心房肌JP2正常水平,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌组织中的JP2蛋白含量也显着下降。提示JP2表达水平逐渐下降,是导致CAPN 1-OE小鼠房颤易感性增加的机制之一,而维持正常水平的JP2蛋白水平,是JP2-OE发挥调节房颤易感性的蛋白基础。9.JP2过表达4周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中钙火花发生频率明显改善。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房肌中自发性钙波等异常钙释放事件显着增多,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌中钙波发生频率明显改善,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。10.JP2过表达8周对房颤小鼠心房钙稳态异常的调控作用同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌细胞中可见明显异常增多的自发性钙火花。此外,离体心脏原位钙成像结果提示,同心房肌钙波发生频率异常增多的CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房肌自发性钙波发生频率未见明显减少,该离体心脏原位钙成像的结论与分离的单个心房肌细胞的结果趋势一致。11.JP2过表达4周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠经食管程序性S1S2电刺激后可发现其AERP显着缩短,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的AERP得以明显改善;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,在撤除Dox药物饲料4周时,CAPN 1-OE小鼠左、右心房肌细胞中T管形态明显紊乱,结构消失,而对照组小鼠心房肌细胞内可见规律存在的T管,且广泛分布于大部分心房肌细胞中,JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠原位心房肌细胞中的T管系统的完整性明显改善,完整、规律排列的T管系统有助于细胞电信号的精细传递。12.JP2过表达8周对房颤小鼠心房电重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠经S1S2食管电刺激后发现AERP均显着缩短;而原位观测小鼠心房肌细胞中T管系统结果提示,JP2过表达8周时,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房T管系统的完整性未见明显改善,提示此时JP2过表达未能有效改善房颤小鼠的电重构。13.JP2过表达4周对房颤小鼠心房结构重构的影响同对照组相比,CAPN 1-OE小鼠心房重量/胫骨长度AW/TL明显增大,而JP2-OE可使CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠AW/TL明显改善,而大体心脏标本也可得出同一结论,肉眼可见CAPN 1-OE小鼠双心房,尤其是左心房明显扩大,而CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔扩大明显改善;心房肌组织纤维化也是房颤维持的重要基质改变。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均显着增高,WB结果显示CAPN 1-OE及CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠的心房肌组织中经典促纤维化信号通路TGF-β1/α-SMA/Col I均明显激活,提示JP2-OE参与调控小鼠心房腔的大小,未能有效改善房颤小鼠心房纤维化信号通路的激活。14.JP2过表达8周对房颤小鼠心房结构重构的影响JP2过表达8周时,同CAPN 1-OE小鼠相比,CAPN 1-OE×JP2-OE小鼠心房腔的扩大未得到有效抑制。Masson染色结果提示,同对照组相比,CAPN 1-OE及CAPN1-OE×JP2-OE小鼠的心房纤维化程度均进一步增高。五、研究结论1.在房颤患者及房颤实验模型中,随着心房快速刺激持续存在,心房肌组织中JP2蛋白表达水平逐渐降低,而Calpain-1表达明显上调且其酶活性显着激活,且心房肌JP2蛋白水平与Calpain-1蛋白酶活性成显着负相关;2.在CAPN 1-OE小鼠房颤模型中,JP2蛋白是Calpain-1重要降解底物之一。在Calpain-1蛋白过表达8周时,MDL28170通过显着抑制Calpain-1酶活性,并改善心房肌蛋白JP2的表达水平,显着改善房颤的易感性;3.心房肌细胞JP2蛋白的变化,可通过调节房颤小鼠心房肌细胞钙稳态(钙火花、钙波等钙异常释放事件),进而影响心房电重构(AERP变化、T管结构重构)及结构重构(心房腔扩大、心房纤维化),从而影响小鼠房颤易感性(房颤的发生率及持续时间);JP2-OE作为潜在的治疗房颤的可能手段,其调控房颤易感性的作用有一定的时程性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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