伪狂犬病毒被膜蛋白pUL21与宿主胞质动力蛋白互作研究

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是伪狂犬病的病原,给我国乃至全球生猪健康养殖带来了巨大的危害。PRV具有神经侵染性（neuroinvasiveness）和神经毒性（neurovirulence）,能够在神经元中建立潜伏感染（latent infection）。PRV经过膜融合进入宿主细胞质后,衣壳-被膜复合体（capsid-tegument complex）沿微管朝着细胞核的方向进行逆行运输（retrograde）。此举的目的在于将病毒基因组运输至细胞核,以进行DNA复制。因此,衣壳-被膜复合体的逆行运输具有重要的生物学意义。胞质动力蛋白（cytoplasmic dynein）是宿主细胞内微管上负责逆行运输的马达蛋白,PRV的逆行运输需要胞质动力蛋白的参与,但其具体机制尚未阐明。本研究利用双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）技术筛选了与PRV内层被膜蛋白pUL21相互作用的胞质动力蛋白,发现pUL21通过其羧基端与胞质动力蛋白轻链Roadblock-1互作,并在此基础上开展了进一步的研究,具体内容如下:1 pUL21是PRV的内层被膜蛋白本研究提取纯化了成熟的PRV胞外病毒粒子。在使用表面活性剂和不同浓度的KCl处理病毒粒子后,利用Western blot分析残留在衣壳上的蛋白质成分。结果表明,pUL21与内层被膜蛋白VP1/2一样,都与衣壳紧密连结,不会随着KCl浓度的升高而从衣壳上完全脱离。因此,pUL21是PRV的内层被膜蛋白。2 PRV pUL21与胞质动力蛋白轻链Roadblock-1互作本研究克隆了11个宿主细胞胞质动力蛋白基因,利用双分子荧光互补技术筛选出与PRV被膜蛋白pUL21互作的胞质动力蛋白轻链Roadblock-1;利用免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation,Co-IP）验证了蛋白质的互作;利用间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）研究了pUL21和Roadblock-1的亚细胞定位,结果表明,pUL21与Roadblock-1在核周的细胞质中共定位;利用截短的方法确定蛋白质的互作区域,发现Roadblock-1与pUL21的羧基端互作。3 pUL21羧基端的功能根据定位蛋白质互作区域的实验结果,本研究利用PRV细菌人工染色体构建了缺失pUL21羧基端的PRV突变株及其回复突变株。在上皮细胞中,缺失pUL21羧基端的PRV增殖滴度不受影响,但传播能力下降;在体外培养的神经元中,缺失pUL21羧基端的PRV在轴突中的逆行运输效率降低,但顺行运输效率不受影响;在动物体中,缺失pUL21羧基端的PRV神经侵染性和毒力受到了一定程度的影响。

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摘要

Abstract

缩略语表

1 前言

1.1 文献综述

1.1.1 伪狂犬病简介

1.1.2 伪狂犬病毒的分类地位

1.1.3 伪狂犬病毒的结构

1.1.4 伪狂犬病毒的复制周期

1.1.5 伪狂犬病毒的潜伏感染

1.1.6 被膜蛋白pUL21研究进展

1.1.7 胞质动力蛋白简介

1.1.8 α疱疹病毒蛋白与微管马达蛋白互作研究进展

1.1.9 双分子荧光互补技术简介

1.2 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞

2.1.2 病毒

2.1.3 菌种

2.1.4 质粒

2.1.5 抗体与染料

2.1.6 实验动物

2.1.7 试剂

2.1.8 仪器与设备

2.1.9 试剂的配制

2.1.10 引物

2.2 方法

2.2.1 传代细胞培养

2.2.2 胞外病毒粒子的纯化与KCl处理

2.2.3 Western blot

2.2.4 提取细胞总RNA

2.2.5 反转录

2.2.6 PCR

2.2.7 目的片段与载体的连接

2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.10 质粒的提取

2.2.11 质粒转染

2.2.12 免疫共沉淀

2.2.13 间接免疫荧光

2.2.14 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

2.2.15 利用BAC构建重组病毒

2.2.16 病毒生长曲线的测定

2.2.17 病毒滴度的测定与空斑大小比较

2.2.18 病毒基因组的少量提取

2.2.19 鸡胚背根神经节细胞培养与微流体系统

2.2.20 小鼠攻毒实验

2.2.21 兔多克隆抗体的制备

2.2.22 统计学方法

3 结果与分析

3.1 pUL21是伪狂犬病毒的内层被膜蛋白

3.1.1 胞外病毒粒子的纯化与KCl处理

3.1.2 Western blot检测病毒粒子

3.2 筛选与pUL21互作的胞质动力蛋白

3.2.1 克隆胞质动力蛋白基因

3.2.2 克隆被膜蛋白基因

3.2.3 BiFC筛选互作蛋白

3.3 验证pUL21与Roadblock-1互作

3.3.1 分析Roadblock-1的氨基酸序列

3.3.2 免疫共沉淀验证蛋白质互作

3.3.3 间接免疫荧光研究蛋白质共定位

3.4 PRV pUL21缺失株的生物学特性研究

3.4.1 PRV pUL21缺失株在上皮细胞中的增殖与传播

3.4.2 PRV pUL21缺失株在神经元轴突中的运输效率

3.4.3 缺失pUL21对PRV毒力的影响

3.5 定位pUL21与Roadblock-1作区域

3.5.1 克隆截短的被膜蛋白pUL21基因

3.5.2 利用免疫共沉淀技术确定互作区域

3.6 PRV UL21 CΔ300的生物学特性研究

3.6.1 构建PRV UL21 CΔ300

3.6.2 PRV UL21 CΔ300在上皮细胞中的增殖与传播

3.6.3 PRV UL21 CΔ300在神经元轴突中的运输效率

3.6.4 缺失pUL21羧基端对PRV毒力的影响

4 讨论

4.1 pUL21是PRV的内层被膜蛋白

4.2 双分子荧光互补技术筛选互作的蛋白质

4.3 免疫共沉淀验证蛋白质互作

4.4 间接免疫荧光试验研究蛋白质定位

4.5 利用截短蛋白研究蛋白质互作区域

4.6 缺失pUL21羧基端对PRV神经侵染性的影响

4.7 PRV在神经元轴突中的逆行运输模型

5.结论

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 燕凯

导师: 陈焕春,刘正飞

关键词: 伪狂犬病毒,胞质动力蛋白,逆行运输,神经侵染性

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000113

总页数: 91

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伪狂犬病毒被膜蛋白pUL21与宿主胞质动力蛋白互作研究

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