汤兴俊[1]2003年在《热稳定性β-葡聚糖酶发酵工艺及发酵动力学研究》文中研究表明β-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业产生的负面影响。本研究从菌种的选育入手，研究了菌株的产酶特性，用响应面策略优化发酵培养基和培养条件，纯化了β-葡聚糖酶，研究了β-葡聚糖酶的酶学性质及酶促反应动力学，确定了分批发酵工艺及发酵动力学模型，并进行了中试放大研究。探讨了双水相纯化β-葡聚糖酶工艺，筛选适宜的纯化体系，最后研究了β-葡聚糖酶在麦芽糖化过程中的应用效果，并建立了降解β-葡聚糖的动力学方程。主要研究结果如下： 1．从土壤中筛选的菌株ZJF-1所产β-葡聚糖酶的最适反应温度为65℃，有较宽的温度范围内酶活性较高，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。经紫外线和硫酸二已酯复合诱变，突变株ZJF-1A5 β-葡聚糖酶产酶水平明显提高，为出发菌株的2.42倍。糊精、大麦粉等多糖有利于B. subtilis ZJF-1A5 β-葡聚糖酶的产生，葡萄糖、蔗糖等易利用性碳源不利于菌体生物量的积累和β-葡聚糖酶的产生，β-葡聚糖酶受分解代谢产物阻遏调节。B.subtilis ZJF-1A5 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的产生与菌体生物量和菌体生长状态密切相关，提高发酵产酶水平的关键是提高菌体生物量和解除葡萄糖效应。酵母浸膏为B. subtilis ZJF-1A5产β-葡聚糖酶的最佳氮源，其次为豆饼粉；试验中选用的无机氮源均不利于β-葡聚糖酶的产生。KH_2PO_4和CaCl_2浓度对β-葡聚糖酶的产生有较大影响，而MgSO4·7H_2O浓度对菌体生长和β-葡聚糖酶的产生影响不大。装液量影响β-葡聚糖酶的产生反映出溶氧产酶有显着影响。B. subtilis ZJF-1A5β-葡聚糖酶有较高的基础代谢产率，受大麦β-葡聚糖诱导。 用响应面方法优化的发酵培养基组成为(g/L)：糊精，38.00；酵母浸膏，29.91；大麦粉，12.00；KH_2PO_4，1.34；CaCl_2，0.432；MgSO_4·7H_2O，0.1。以优化的培养基发酵48h，β-葡聚糖酶活性为235.87U/mL，高于相关报道的酶活。B. subtilis ZJF-1A5菌体生长和β-葡聚糖酶、α-淀粉酶及中性蛋白酶间均为半部分藕联，在对数生长期，叁种酶活性均随菌体生物量的增加而增加，当菌体生长进入对数生长后期至稳定期，叁种酶活迅速增加。 2利用Sephadex G-100和DEAE-Cellulose 52分离纯化了β-葡聚糖酶，并研究了酶学性质和酶促反应动力学。该酶具有严格的底物专一性，只水解含有β-1，3和β-1，4键的β-1，3-1，4-葡聚糖，不水解仅含β-1，3或β-1，4键的β-葡聚糖，为内β-1，3-1，4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)。β-葡聚糖酶的最适反应pH6.5，最适反应温度为65℃，在较宽的温度范围内有较高的酶活性。酶的 热稳定性受Ca‘’浓度和底物的影响，添加 Ca‘’和底物均可提高酶的热稳定性， 延K6ti的半哀JgJ。酶活性受金属离子影响，FCJ、AI卜对p刁，3刁，4－葡聚糖gh 活性有明显的抑制作用，x＼wa＼win入、wigy对酶活性的影响不大；re】、 co》、cay，尤其是coy对酶活性有明显的激活作用。确定了以大麦P．葡聚 糖和地衣多糖为底物的动力学参数：以大麦p－葡聚糖为底物的Km一3855 ＿，、、，、、＿、．＿of 248C mymL Vm。x一0．1248 m分（mL·min），动力学方程为厂．、＝二二二二上二二L；以地衣 一”3．855十＊＿ 多糖为底物的 Km－6．351 mg／mL，Vin皿－0．1951 mg／（InL，min人动力学万程为 0．19引C 6．3引＋C＿ 3为降低发酵成本，以淀粉质农副产品为原料，用响应面方法优化发酵培养基。大麦粉、玉米粉和豆饼粉浓度对卜葡聚糖酶产酶有显着的影响。经中心组合试验优化的发酵培养基为（叭）：大麦粉，63 5；玉米粉，44 8；KHoO。，l刀；MgSO。·7HZO，0．ICaCI。，0＊。以此优化的发酵培养基发酵培养48卜卜葡聚糖酶活性为250．73 U／mL，与模型预测的结果接近，并且产酶水平高于以糊精和酵母浸膏为碳氮源时的酶活性。 纤响应山可 法优化的不 广上芥人组成为（ 卜）：糊十，Y，35；酵母详，34．8；KH。PO。，4．6；MgSO。·7H。O，0二；CaCI。，0．35，培养 20h oJ生物量为 8．ZI g／L，与模2 预狈的生物1打8．36叭）栓近D乐龄牙！按不虽影且 卜侦聚糖酶J 酶水瑟和发酵进程。 发酵产酶的最适培养温度为35－37℃。装液量以250 mLH角瓶中装30 InL培养基为宜；氧载体对B．SSbtilis ZNJ 产p－葡聚糖酶的影响受氧载体种类和添加量的影响。经优化后的培养条件为：种龄 16 h，接种量3．82％（V／X摇床转速210 rpm，发酵培养基起始pH 7刀，培养温度37C，在此条件下发酵50 h，卜葡聚糖酶活性达最大，为274．48U／InL，与模型预测结果275．25 U／InL极为接近。 B．subtilis Zir1 在淀粉质原料培养基中发酵产生p．葡聚糖酶、a．淀粉酶和中性蛋白酶的类型与糊精培养基相似，为生长部分藕联型，均在菌体生长进入稳定期开始大量表达。p－葡聚糖酶和中性蛋白酶产酶水平在48 h达到最大，而 Q－淀粉酶产酶水平在54 h时达到最高。提高p－葡聚糖酶产酶水平的关?
韩晶[2]2009年在《以麦糟为原料生物法制备嗜热β-葡聚糖酶技术的研究》文中提出β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在啤酒和饲料生产中产生的负面影响。因此,在啤酒和饲料工业中β-葡聚糖酶发挥着重要作用。与国外相比,我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚,且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差,不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求,寻求嗜热β-葡聚糖酶高产菌株一直是人们关注的焦点和研究的方向。因此,提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本论文从菌种分离筛选入手,通过物理、化学诱变选育获得产嗜热β-葡聚糖酶酶活较高的突变株AS35并研究了其产酶特性,通过单因素试验和响应曲面法优化了摇瓶发酵产酶条件,初步分离纯化了β-葡聚糖酶,揭示了粗酶液的部分酶学性质,最后探讨了添加保护剂对粗酶液热稳定性和储藏稳定性的影响,为工业化生产和应用提供理论依据和参考。主要结论如下:1、从吐鲁番采集的高温土样中分离筛选出一株产嗜热β-葡聚糖酶活力较高的野生菌株X-5,37℃发酵培养60 h,发酵液酶活性达8.64 U/ml。经形态学和生理生化鉴定,初步确定野生菌株X-5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。2、对野生菌株X-5采用紫外辐射和硫酸二已酯复合诱变,获得产酶水平明显提高的突变株AS35,同等条件下发酵酶活性达15.83 U/ml,是出发菌株X-5的1.83倍,传代试验证明该突变株产酶性能比较稳定。3、通过单因素试验和响应曲面实验,对其摇瓶发酵产嗜热β-葡聚糖酶的培养基进行了优化,最佳培养基组成为(g/L):麦糟粉47.476、玉米粉15.0、蛋白胨11.539、(NH_4)_2SO_4 3.0、K_2HPO_4 2.310、CaCl_2 1.0、NaCl 5.0、MgSO_4·7H_2O 0.4、FeSO_4·7H_2O 0.01、Tween-80 0.096 ml/100ml。验证实验表明β-葡聚糖酶活性达30.66 U/ml,与模型预测的结果31.33 U/ml接近,相对误差为2.13%。在此基础上,通过单因素优化实验研究了发酵环境因子对菌株AS35产酶能力的影响。优化结果为:种龄18h、接种量12%、摇瓶装液量50 m1/250 m1、摇床转速210 r/min、培养温度36℃、初始pH 7.0、最佳发酵时间60h。在上述优化工艺条件下,发酵液中β-葡聚糖酶活性最高达32.12 U/ml,比工艺优化前(15.83 U/ml)提高了近1倍。4、对该酶的性质研究表明:该酶在55℃-65℃之间酶活力较高,最适反应温度为60℃;最适反应pH为5.5,在pH4.0-7.0范围内有较高的稳定性,在4℃保存24h后,残余酶活均在85%以上;在lmmol/L的浓度下,Fe~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+),尤其是Co~(2+)对酶活性有明显的激活作用;K~+、Na~+、Mn~(2+)、Mg~(2+)对酶活性的影响不大; Cu~(2+)、Zn~(2+)对酶活性有轻微的抑制作用; Pb~(2+)、Fe~(3+)、A1~(3+)对酶活性有明显的抑制作用,酶活性几乎完全被抑制。5、黄原胶、甘油和CaC1_2等保护剂,能够在一定程度上提高酶液的热稳定性。经正交实验和验证实验,最终选择了组成为黄原胶3 g/L,CaC1_2 2.0 mmo1/L和甘油30 g/L的复合保护剂。复合保护剂提高了该酶的热稳定性,使酶的主要活力损失范围由50℃-70℃提高到了55℃-70℃;复合保护剂和1 g/L苯甲酸钠配合使用能明显提高酶液的储藏稳定性,在室温下放置1.5个月,相对残留酶活高达85.23%,比对照组提高15.0%左右。
张秀艳[3]2006年在《β-葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究》文中认为β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响。与国外相比,我国对β-葡聚糖酶的研究起步较晚,且研制的β-葡聚糖酶的热稳定性普遍较差,不能满足现代啤酒糖化工艺和颗粒饲料造粒的温度要求,因此提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有非常重要的意义。本课题以大肠杆菌表达系统克隆和重组表达了β-葡聚糖酶基因;建立了高通量筛选耐热β-葡聚糖酶的方法;以克隆的β-葡聚糖酶基因为起始材料,通过设计的定向进化策略和建立的筛选手段提高野生型β-葡聚糖酶的热稳定性;检验所构建的热稳定性重组菌株的遗传稳定性;对热稳定性突变株EGs2的发酵条件进行优化;筛选并优化出提高β-葡聚糖酶热稳定性的复合保护剂;估算了热稳定性β-葡聚糖酶的储藏寿命。主要研究结果如下: 从Bacillus subtilis ZJF-1A5中克隆了大小为849bp的β-葡聚糖酶基因。通过序列比对,该基因编码的氨基酸序列与Borriss R、Sun,J和Hidetoshi发表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列分别有1—3氨基酸的替换。β-葡聚糖酶基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与用同样限制性内切酶切割的载体pET28a(+)进行重组表达,得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。对酶在宿主细胞中的位置进行测定,结果显示:β-葡聚糖酶不仅分泌至细胞外,而且也存在于细胞内和周质空间。发酵上清液经硫酸氨盐析沉淀和DEAE Cellulose 52离子交换柱层析,纯化的β-葡聚糖酶经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化产品为单一条带,分子量约27KD。纯化的β-葡聚糖酶的热学性质研究表明:β-葡聚糖酶的Tm值为62.5℃,最适反应温度为55℃。 本研究将定位膜转印和肉眼可见的平板筛选策略相结合,通过对影响菌落生长、酶的表达和转印成功率的各因素的优化,建立了高通量筛选耐高温β-葡聚糖酶的方法。结果显示:每个LB平板(直径90mm)用4μl 200mg/ml IPTG;IPTG要预先涂在LB平板上;菌落密度约为100个/平板;菌落培养时间为37℃,15小时;完全钝化野生型酶的条件为100℃ 2小时。对该方法的稳定性考察结果显示:该方法的重现性为100%,假阳性率为0.16%,假阴性率为12.22%。与其它高通量筛选方法相比,以滤膜为基础的高通量筛选方法存在许多优点,如透明圈清晰,假阳性率较低,筛选通量高,操作简便,费用低等。该方法作为一种固相酶筛选方法,在鉴别热稳定性和低温下催化活性同时得到提高的变异体时非常有效。 为了提高β-葡聚糖酶的热稳定性,利用体外定向进化技术对编码β-葡聚糖酶的基因进行改造。设计的定向进化策略包括一轮的随机突变和一轮的DNA改组。应用建立的高通量筛选方法筛选热稳定性突变体,最终获得EGs1和EGs2两株热稳定性突变体。通过对野生酶和突变酶的DNA序列和酶学性质分析发现:EGs1和EGs2分别有四个和五个氨基酸替换;这些氨基酸替换使EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别比野生酶的Tm值(62.5℃)提高了3℃和5℃,达到了65.5℃和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃;两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力与野生型的一致,未见改变;在酶的最适pH值上,野生酶和EGs1突变酶为6.5,而EGs2突变酶为7.0;在酶的pH值稳定性方面,野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH 6.0-8.5的范围内放置48h,β-葡聚糖酶仍保持80%以上的酶活力。这一结果说明了定向进化在提高酶的热稳定性方面是比较有效的。
谭会泽, 冯定远[4]2005年在《饲料中的β-葡聚糖和β-葡聚糖酶的应用》文中研究表明β-葡聚糖是一类非淀粉多糖(NSP),分为水溶性和水不溶性2类。是禾本科高等植物(谷物类)细胞壁的多糖成分,在大麦、燕麦、高粱、大米和小麦等谷物胚乳细胞壁中的含量尤为丰富。由于β-葡聚糖会包裹一些营养物质,使消化酶不能接触底物,从而降低饲料的营养价值。同
参考文献：
[1]. 热稳定性β-葡聚糖酶发酵工艺及发酵动力学研究[D]. 汤兴俊. 浙江大学. 2003
[2]. 以麦糟为原料生物法制备嗜热β-葡聚糖酶技术的研究[D]. 韩晶. 石河子大学. 2009
[3]. β-葡聚糖酶的定向进化及热稳定性研究[D]. 张秀艳. 浙江大学. 2006
[4]. 饲料中的β-葡聚糖和β-葡聚糖酶的应用[J]. 谭会泽, 冯定远. 畜禽业. 2005