王忆霄牛丽丽边艳超温建勋姜丽丽肖瑞（通讯作者）
（内蒙古医科大学分子病理学重点实验室内蒙古呼和浩特010059）
【摘要】目的：探讨CDK1（周期素依赖激酶1）在Rｄ小鼠视网膜中的表达。方法：取14、21、28ｄ的Rd小鼠眼球(实验组)、B6小鼠眼球（对照组）眼球进行HE染色，观察视网膜形态学结构变化，免疫组织化学检测CDK1在不同日龄小鼠视网膜上的表达。结果：CDK1在Rd与B6小鼠视网膜的内核层细胞中表达，且随着发育阶段的增加表达量下降。与正常B6小鼠比较，CDK1在Rd小鼠视网膜中的表达没有显著差异。结论：Rd小鼠视网膜细胞发育过程中，细胞增殖仅局限于视神经节细胞，而内外核层细胞减少并消失，细胞G2-M期的调控因子CDK1不直接参与Rd小鼠视网膜的发育调控，提示Rd小鼠视网膜细胞退化很可能发生在G1-S期，而不是G2-M期。
【关键词】视网膜色素变性；细胞周期；CDK1
【中图分类号】R778.11【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2018）12-0177-03
视网膜色素变性（retinitispigmentosa，RP)是一类以进行性感光细胞和色素上皮细胞功能丧失为共同表现的遗传性营养不良性退行病变,且具有高度的遗传异质性[1]。目前研究RP的主要动物模型为Rd小鼠[2]，因其视锥细胞的存活时间比视杆细胞较长，并且随着病变的发展，该小鼠视网膜细胞层逐渐发生变性。
周期素依赖激酶1（CDK1）为CDK家族中的一个重要分支，并在真核细胞周期调控中起着关键性的作用，CDKs存在于细胞周期中所需的含量是稳定的，根据细胞周期中的时相不同，不同的cyclins的集聚与相应CDKs结合并被激活。激酶激活后可以促进DNA合成，调节细胞周期相变中细胞转录等重要功能。细胞周期运行过程中拥有3个调控点，分别是G1/S调控点和G/M调控点还有纺锤体组装调控点[3]。细胞周期的核心机制是细胞周期蛋白激酶CDKs结合了细胞周期蛋白cyclins后被激活，然后驱动细胞周期运行，其中CDK1是细胞周期运行并通过G1/S期的关键蛋白[4-6]。
1.材料和方法
1.1动物
野生型小鼠(C57BL/6J，文中简称B6)和Rd1(PDE6brd1，CBA/J)小鼠购自南京大学生物所，于内蒙古医科大学分子病理学重点实验室配种饲养，循环光照(光照12h，黑暗12h)，环境温度约为25℃，无菌环境下饲养。
1.2实验试剂
PBS缓冲液（pH7.2～7.4)，柠檬酸缓冲液（0.01mol)，DAB显色剂，即用型免疫组化试剂盒（迈新试剂公司），抗体CDK1(1:25）（生工生物）。
1.3实验设备
徕卡全自动脱水机（ASP200S），徕卡石蜡包埋机（EG1150H+C），徕卡石蜡切片机（Shandonfinesse325），徕卡摊片机（H11210），徕卡烤片机（H11220），虚拟显微镜（motic1500)。
1.4标本采集和准备
将出生14d、21d、28d的Rd和B6小鼠各5只，断髓处死，取出眼球至10%的甲醛溶液中浸泡24h后，取出将其房水扎破后浸蜡。全自动脱水机ASP200进行脱水、使眼球矢状面向上包埋、切片。
1.5HE染色
常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察后拍照。
1.6免疫组化
梯度脱水后枸橼酸缓冲液高压修复，CDK1抗体浓度（1:25）4℃过夜，按试剂盒说明操作，梯度脱水，中性树胶封固，镜下观察拍照。
2.结果
2.1正常小鼠视网膜矢状切面图
正常小鼠视网膜矢状切面图见图1。
图1正常小鼠视网膜矢状切面图
2.2常规HE染色结果
Rd小鼠视网膜经过HE染色显示，第14d外核层细胞层有明显减少，第21d外核层细胞层只为单层，第28d减至为不连续的单层，第56天基本观察不到视网膜的内外核层。由此表明结果，Rd小鼠视网膜外核层细胞从出生后随时间的变化，层数逐渐减少，第21d减至近单层，直至28天视网膜基本观察不到。
图2B6小鼠与Rd小鼠视网膜外核层P14、P21、P28的对比结果
A与B:第14d的B6小鼠与Rd小鼠的视网膜,内核层无明显变化，外核层密度及光感受器细胞层数少量减少；C与D:第21d的B6小鼠与Rd小鼠视网膜,内核层没有太大变化，外核层视网膜感光细胞层减少到一层；E与F：第28d的B6小鼠与Rd小鼠视网膜,内核层细胞层数少量减少，而外核层却消失不见，视网膜光感受器细胞层数或密度基本观察不到.(400X)
2.3免疫组化结果
免疫组化结果显示，CDK1在小鼠视网膜的内核层有少量表达，表达量的变化随着发育时间的增加而呈减少趋势。CDK1在Rd小鼠和正常小鼠视网膜的表达没有显著差异。细胞周期调控蛋白CDK1调控细胞生长，从G2过渡到M期。该结果提示在Rd小鼠视网膜细胞退化过程中CDK1对细胞周期从G2至M期的调控作用不具有显著性，其他细胞周期调控蛋白可能调控视网膜细胞的退化，需要进一步的实验研究。
图3CDK1在不同发育阶段的Rd与B6小鼠的视网膜上的表达
A,B,C,D,E.F为CDK1免疫组化结果，A1,B1,C1,D1,E1,F1为阴性对照,A与B:CDK1在出生后14天的B6与Rd的小鼠视网膜上的表达，Rd小鼠内核层内有少量的CDK1的表达C与D：出生后21天的B6与Rd的小鼠视网膜内有CDK1的表达量降低E与F：出生后28天的B6与Rd的小鼠视网膜无CDK1的表达。
3.讨论
CDK1在真核细胞中表达，真核细胞是由一组在空间、时间上有序激活的蛋白激酶来调控的，这组蛋白激酶即是细胞周期素依赖性蛋白激酶，CDKs与细胞周期素依赖性蛋白激酶调节性亚基细胞周期素共同构成细胞周期调控的最主要内容。不同的CDKs-Cyclins复合物在细胞周期的特定时相内装配，从而实现对细胞周期严格的、复杂的控制。CyclinB1/CDK1蛋白复合体引起关键的底物磷酸化，让细胞周期可以从G2期过渡到M期，CylinB1通常在S期末，经过G2期并在M期达到峰值，而在G1期则不出现[7]。以上的研究结果提示视网膜光感CDKs处于细胞周期调控的中心内容，调控着细胞的生长与分化，并发挥重要作用，是研究CDKs为调控途径的分子生物学的重要领域。CDK1调控细胞生长从G2到M期，而本文的研究结果表明Rd小鼠视网膜的退化可能发生在G1-S期，所以我们的研究结果为进一步开展应用Rd小鼠进行科研工作提供了实验依据。
【参考文献】
[1]邓新国,胡世兴.常染色体隐性视网膜色素变性的相关基因研究进展[J].国外医学遗传学分册,2002,25(5):59-64.
[2]CarterdawsonLD,LavailMM,SidmanRL.Differentialeffectoftherdmutationonrodsandconesinthemouseretina.[J].InvestigativeOphthalmology&VisualScience,1978,17(6):489-98.
[3]田翠孟.细胞周期蛋白依赖性激酶与肿瘤关系的研究进展[J].实用肿瘤杂志,2010,25(4):499-502.
[4]RosamondJ.Thecellcycle:anintroduction[J].QuarterlyReviewofBiology,1993,2(2):147-163.
[5]NurseP.UniversalcontrolmechanismregulatingonsetofM-phase[J].Nature,1990,344:503-508.
[6]NurseP.Alongtwentiethcenturyofthecellcycleandbeyond[J].Cell,2000,100:71-78.
[7]SHERRCJ.Cancercellcycles[J].Science,1996,274(5293):1672-1677.