导读:本文包含了双特异性蛋白激酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:RIP3,流感病毒,特异性CD8~+T细胞
双特异性蛋白激酶论文文献综述
秦波音,王超,刘洋,谭丹,方钟[1]（2019）在《受体相互作用蛋白激酶-3参与甲型流感病毒H1N1感染C57BL/6小鼠诱导特异性CD8~+T细胞应答》一文中研究指出目的研究受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein 3, RIP3)在C57BL/6小鼠感染甲型流感病毒H1N1 PR8后,在特异性CD8~+T细胞免疫应答中的作用。方法用剂量为0.7×10~3半数组织细胞感染剂量(50%tissue culture infective dose, TCID_(50))的甲型流感H1N1 PR8病毒株,通过滴鼻方式分别感染RIP3敲除(RIP3~(-/-))和野生型(WT)的C57BL/6小鼠。在感染后第8天(day post infection, d.p.i)分离小鼠脾细胞,使用流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测流感抗原特异性CD8~+T细胞数量及功能:MHC I表位肽四聚体法(tetramer staining)染色流感特异性CD8~+T细胞,细胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining, ICS)检测CD8~+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2等效应性细胞因子水平和与CD8~+T细胞杀伤功能有关的颗粒酶(granzyme B)的表达情况。结果 0.7×10~3 TCID_(50)流感病毒感染后,WT小鼠中流感抗原特异性CD8~+T细胞比例为RIP3~(-/-)小鼠的2.71倍;WT小鼠中CD8~+T细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力均显着高于RIP3~(-/-)小鼠(P<0.01);且WT小鼠CD8~+T表达granzyme B水平显着高于RIP3~(-/-)小鼠(P<0.01)。结论本研究在甲型流感病毒感染的小鼠体内发现敲除RIP3分子可导致流感感染诱导的特异性CD8~+T细胞数量减少、功能降低,表明RIP3是参与流感抗原特异性CD8~+T细胞的诱生及功能发挥的关键分子之一。(本文来源于《中国实验动物学报》期刊2019年05期）
郑帅,刘燕,朴春梅,刘婷婷,王吉静[2]（2019）在《巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶基因的小鼠模型构建》一文中研究指出目的:构建巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶(AMPK)基因的小鼠模型,并观察对血压的影响。方法:利用胚胎显微注射法构建AMPKα1基因第3外显子两端携带loxP位点的小鼠模型,和集落刺激因子1受体启动子诱导表达Cre酶的小鼠模型,交配繁育出巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型。鼠尾DNA做PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导敲除AMPK,Real-time PCR检测小鼠骨髓细胞AMPK RNA水平。检测Cre阴性小鼠注射与不注射他莫昔芬的血压差异,以及Cre阴性和阳性小鼠注射他莫昔芬5d后的血压差异。结果:鼠尾DNA PCR鉴定出AMPKα1 loxP为纯合阳性、且Cre为阴性或阳性的小鼠。与Cre阴性小鼠相比,他莫昔芬显着降低了Cre阳性小鼠骨髓细胞AMPK mRNA[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657),P<0.017]。他莫昔芬对Cre阴性小鼠血压的影响不显着[收缩压(122.9±3.183)vs.(124±6.878) mmHg,1 mmHg=0.133 kPa,P=0.427],而AMPK敲除鼠血压显着低于对照组[收缩压(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg,P=0.037]。结论:成功构建巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型,证实敲除鼠血压降低。(本文来源于《心肺血管病杂志》期刊2019年07期）
李明翰[3]（2019）在《蛋白激酶C通路特异性甲状旁腺素模拟肽在连续应用时对骨骼系统作用的研究》一文中研究指出背景:甲状旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是正常人体内的钙调节激素,N端34个氨基酸多肽(PTH(1-34),特立帕肽)是临床上治疗骨质疏松的促骨形成药物,但仅限于间断使用。这是由于其兼具破骨作用,因此在体内连续应用会显着促进骨吸收;近年来的研究都主要着重于提高其成骨作用、避免破骨作用,但进展甚微。PTH能够与甲状旁腺素Ⅰ型受体结合,激活蛋白激酶C(PKC)通路,从而改善和提高松质骨骨量,并且它还能够改善骨小梁的微观结构。在我们前期实验中,我们已经验证并合成了能够特异性激活PKC通路的PTH模拟肽(MY-1),通过对其进行离体和在体实验,我们发现MY-1肽具有促进成骨细胞分化,但不激活破骨细胞分化和增殖的作用。体内实验研究发现,MY-1肽拥有与PTH(1-34)相近的改善或延缓去势后造成的骨量丢失的作用。PTH肽连续作用对骨代谢的影响是研究它破骨效应研究的重要方式。目的:通过我们前期合成的特异性激活PKC通路的PTH模拟肽进行体内和体外实验,探讨适于PTH持续灌注对骨骼系统的作用研究合适的动物模型,评价MY-1肽连续应用时的骨质变化。方法:取5只8周龄小鼠(C57BL/6J)提取股骨和胫骨的骨髓基质细胞(BMSC)、骨髓源巨噬细胞(BMMs);成骨诱导BMSC细胞,对细胞采用茜素红染色、钙定量分析、碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性测定,破骨诱导BMMs,对细胞进行TRAP染色及抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定;提取3日龄左右乳鼠(C57BL/6J)的颅骨原代成骨细胞,通过RT-PCR测定特异性成骨基因表达水平。取24只6周龄C57BL/6J雌性小鼠,适应性喂养一周后,随机取12只小鼠行卵巢切除术,术后观察一周,对OVX-TPTD组和TPTD组植入ALZET2004型微量缓释泵模拟连续使用TPTD。在第2周末行颈椎脱臼法处死后常温固定,取其胫骨进行MicroCT扫描,对松质骨进行定量分析,取胫骨做石蜡切片,进行HE及TRAP染色,观察骨小梁和破骨细胞分布情况,观察胫骨生长板厚度。取18只7周龄C57BL/6J雌性小鼠,通过对处理组植入ALZET2004型微量缓释泵模拟连续使用PTH(1-34)和MY-1肽。在第2周末行颈椎脱臼法处死后常温固定,取其胫骨进行MicroCT扫描,对松质骨进行定量分析,取胫骨做石蜡切片,进行HE及TRAP染色,观察骨小梁和破骨细胞分布情况,观察胫骨生长板厚度。结果:(1)胫骨松质骨骨量的测定,骨小梁体积分数PTH(1-34)组低于SHAM组,但MY-1组骨小梁体积分数与SHAM组略高于SHAM组,且明显高于PTH(1-34)组。OVX组显着低于SHAM组,PTH+OVX组显着高于OVX组。胫骨上段病理切片显示:骨小梁所占面积百分数,PTH(1-34)组、MY-1组与SHAM组显着性差异,OVX组显着低于SHAM组,PTH+OVX组显着高于OVX组。胫骨上段骨小梁发生区的厚度PTH(1-34)组和OVX组明显低于SHAM组,MY-1组与SHAM组无统计学差异,PTH+OVX组明显高于OVX组。(3)BMSC成骨诱导结果:茜素红染色示,PTH(1-34)组较对照组红色结节面积较少MY-1组红色结节面积明显高于对照组;碱性磷酸酶染色示,CON组、PTH(1-34)组、MY-1组均出现深蓝色染色,且PTH(1-34)组和MY-1组染色明显较对照组深,ALP定量检测示,酶活性在PTH(1-34)组出现降低、MY-1组的酶活性显着提升,PTH(1-34)vsMY-1;(4)BMMs破骨诱导结果:TRAP染色提示PTH(1-34)组和MY-1组TRAP阳性细胞数目明显增高,且均较CON组更多,但MY-1组破骨细胞增多数目较少;抗酒石酸酸性磷酸酶定量测定显示PTH(1-34)组和MY-1组的酶活性与CON组相比均有升高,但PTH(1-34)组TRAP酶活性高于MY-1组,两组间有统计学差异。(5)颅骨原代和BMSC细胞RT-PCR结果:成骨相关特异性基因(ALP、BSP、OC、OPG)表达,PTH(1-34)组相比对照组明显抑制,MY-1组相对于对照组明显上调。PTH(1-34)组相对于对照组,Rankl基因表达明显上调,MY-1组与对照组相比则表现出抑制。结论:细胞和动物实验综合显示,MY-1肽具有比PTH更好的促进成骨分化的作用,并且未表现出和PTH 一样的促进破骨分化的作用。由于MY-1肽在PKC通路的特异性,提示PKC信号通路可能特异性促进成骨分化。MY-1肽具有局部应用的可能。在研究甲状旁腺素连续应用的过程中,我们发现去卵巢小鼠和正常小鼠显现的效果不一致,雌激素对PTH连续应用的影响、机理和临床效应需要深入研究,但提示我们在实验动物模型的选择和研究结果解读需要更加慎重。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-05-07）
勾向博[4]（2017）在《蛋白激酶C亚型特异性调控慢激活延迟整流钾电流及其分子机制》一文中研究指出延迟整流钾电流(I_K)包括快激活I_Kr和慢激活I_Ks两种成分,其中KCNQ1和KCNE1分别编码I_Ks通道的孔区α亚单位和辅助β亚单位。I_Ks是大动物2、3相复极的重要电流。已有报道,KCNQ1及KCNE1基因突变引起I_Ks减小或者增大,致动作电位复极延迟或加速,心电图上分别表现为长QT综合征(long QT syndrome,LQT1或者LQT5)和短QT综合症(short QT syndrome,SQT2)。在高血压、冠心病和心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等病理状态下,均伴有I_Ks减小,而这是造成获得性LQT综合征的重要原因。LQT和SQT均以高发室性心律失常为特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能调节具有重要意义。据报道,磷酸化是通过调节通道功能从而影响心肌电生理功能的有效方式之一,其中PKC磷酸化对离子通道的调控备受关注。早期实验结果显示,PKC对克隆的小鼠、大鼠心脏的I_Ks表现明显的抑制作用,而对豚鼠心脏的I_Ks表现为增大作用,对此种属依赖性产生的原因解释为,PKC使KCNE1的Ser102位点磷酸化而抑制电流,而豚鼠缺乏此位点,故表现为增大电流。最新研究表明,PKC磷酸化KCNE1-S102后,通过加快膜蛋白内吞而下调通道功能。然而,激活PKC可增大表达人源的KCNQ1/KCNE1通道电流(KCNE1上存在S102),故KCNQ1上存在可上调通道功能的磷酸化位点。我实验研究结果发现,在豚鼠心室肌细胞(KCNE1上缺乏S102),通过激活PKC通路抑制I_Ks。综上,激活PKC对I_Ks的调控作用表现为增大电流和抑制电流两种结果。由于不同PKC亚型对通道功能可能具有相反的作用,因此我们推测PKC对I_Ks不一致的调控结果可能由不同的PKC亚型所致。有报道PKCβⅡ、ε亚型选择性增大I_Ks,而α、β1、δ亚型对电流没有明显影响;PKCε亚型中介PMA和肾上腺素α受体增大豚鼠心房I_Ks的作用。综上,PKC可显着地调控I_Ks功能,但迄今对于不同PKC亚型特异性调控I_Ks的认识非常有限。为此,本研究主要采用膜片钳电生理技术拟解决以下问题(1)激活不同PKC亚型对I_Ks的调节作用。(2)确定介导抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。(3)PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制。第一部分不同PKC亚型对I_Ks的调节作用目的:激活不同PKC亚型对I_Ks的影响。方法:构建稳定表达KCNQ1和KCNE1的HEK293细胞线,观察PMA、cPKC激动肽和PKCε激动肽对通道电流的影响。为避免电流的衰减,实验采用穿孔膜片全细胞模式记录I_Ks。结果:在稳定转染I_Ks的HEK293细胞,外液中加入PMA(100 nM)后,去极化外向电流及复极化的尾电流明显增加。在+50mV电压下,尾电流密度由37.20±6.98 pA/pF 增加到 45.39±7.01 pA/pF(P<0.05)。PMA对I_Ks的增大作用5min出现,10-15 min左右达到稳态,冲洗后不能完全恢复。由激活曲线得出给药前V_1/2和斜率因子分别为20.04±1.31 mV和15.69±0.76,应用PMA后的V_1/2和斜率因子分别为14.48±2.21 mV和16.99±1.94,PMA使I_Ks激活曲线发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,PMA可明显降低通道的激活时间常数,在+50 mV电压下,激活时间常数由926.14±128.01 ms减小到756.57±115.23 ms(P<0.05)。在电极内液中加入cPKC激动肽和PKCε激动肽及其各自乱码对照肽(所有肽都连接穿孔肽),结果如下:与cPKC对照肽相比,cPKC激动肽使I_Ks电流密度增加,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由26.26±4.46 pA/pF(cPKC 对照肽)增加到 37.13±4.72 pA/pF(cPKC激动肽)(P<0.05)。应用cPKC对照肽激活曲线的V_1/2和斜率因子分别为18.03±2.2 mV和17.8±1.5,而应用cPKC激动肽激活曲线的V1/2和斜率因子分别为8.9±2.7mV和15.6±0.9,曲线明显发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,cPKC激动肽可明显减小通道的激活时间常数,在+50 mV,激活时间常数由1142.09±168.85 ms降低到608.71±99.38 ms(P<0.05)。与PKCε对照肽相比,PKCε激动肽使I_Ks电流密度下降,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由40.81±6.78 pA/pF(PKCε 对照肽)下降到 16.68±2.26 pA/pF(PKCε 激动肽)(P<0.01),而激活曲线V1/2和斜率因子没有发生改变,激活时间常数也没有发生改变。小结:PMA和cPKC激动肽增大I_Ks,使通道激活曲线发生左移,降低激活时间常数;PKCε激动肽抑制I_Ks,但不影响激活曲线和激活时间常数。第二部分确定中介I_Ks不同调节的PKC亚型目的:前期报道血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)通过PKC信号通路抑制豚鼠心室肌I_Ks,第一部分实验发现PMA增大I_Ks,为此本部分实验确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。方法:在稳定转染I_KsHEK293细胞上,瞬时转染人的Ang Ⅱ受体AT1cDNA,观察AngⅡ对I_Ks的影响。进一步采用siRNA技术分别敲低PKCα PKCβ和PKCε亚型,观察AngⅡ和PMA对以上细胞的调节作用,从而确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。结果:首先在表达系统进一步确定Ang Ⅱ对I_Ks的影响。在稳定转染I_Ks的HEK293细胞上,共转染人AT1 cDNA,外液中加入Ang Ⅱ(100 nM)后2-3 min去极化外向电流及复极化的尾电流均明显减小,10-15 min左右达到稳态,在+50 mV,尾电流密度由55.40±11.03 pA/pF减小到42.29±8.89pA/pF(P<0.05),抑制作用冲洗后不能完全恢复。其中约400%细胞在给药后1 min出现一过性微弱增大(约7%)。在0.1-1000 nM范围内,Ang Ⅱ以浓度依赖性方式抑制I_Ks,以I_Ks尾电流抑制率为纵坐标做Ang Ⅱ抑制I_Ks的量效曲线,经Hill方程拟合后得到IC50=7.5 nM。Ang Ⅱ对I_Ks的半数激活电压及激活时间常数都没有影响。转染siRNA特异性敲低PKC亚型的表达,观察Ang Ⅱ(K100 nM)和PMA(100 nM)对抑制、增大I_Ks的影响。结果发现,转染PKCα+PKCβ siRNA后,Ang Ⅱ对I_Ks的抑制作用与转染对照siRNA无明显差别;而转染PKCε siRNA特异性敲低PKCε表达后,Ang Ⅱ对尾电流的抑制(+50 mV下)显着弱于对照(10.95%vs 26.06%,P<0.05),表明Ang Ⅱ对电流的抑制由PKCε中介。转染(乱码)对照PKC siRNA后,PMA使I_Ks(+50 mV下)增加31.84%,分别敲低PKCα、PKCβ的表达,PMA对尾电流的增加幅度较对照显着减弱,分别为16.82%(P<0.05)、10.58%(P<0.01);共同敲低 PKCα 和 PKCβ后,电流增强作用几乎消失;敲低PKCε的表达不影响PMA的作用(28.87%vs 31.84%,P>0.05)。表明PMA对电流的增强作用由cPKC的PKCα和PKCβ中介。小结:以上的实验表明,AngⅡ对克隆人的I_Ks呈现抑制作用,此抑制作用由PKCε中介,而PMA对I_Ks的增强作用由PKCα和PKCβ中介。第三部分PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制目的:分析不同PKC亚型对I_Ks调节的分子机制。方法:分别突变KCNQ1、KCNE1上PKC的潜在磷酸化位点,观察Ang Ⅱ和PMA抑制、增强电流作用的改变,分析不同PKC亚型对通道调控的分子机制。结果:KCNQ1上N端有2个、C端有4个评分较高的PKC潜在磷酸化位点,分别是S95、T96和S409、S464、T513、S577,而KCNE1上只有一个潜在PKC磷酸化位点,即S102。将上述KCNQ1上6个和KCNE1上的1个潜在磷酸化位点分别突变为丙氨酸,另外同时将KCNQ1 上N端2个或C端4个潜在磷酸化位点突变,分别为 KCNQ1-2M(含 N 端 S95A 和 T96A)和 KCNQ1-4M(含 C 端 S409A、S464A、T513A、S577A)。经检测,上述所有突变通道的动力学特征与野生型一致。我们发现,Ang Ⅱ(100 nM)对 KCNQ1/KCNE1-S102A突变通道尾电流的抑制程度明显小于对野生型通道的抑制(10.84%,vs 30.59%,P<0.05),以上结果提示KCNE1上的S102是PKC抑制通道功能的磷酸化位点。同时我们注意到,KCNE1上S102突变后AngⅡ对通道的抑制作用并没有完全消失,推测除S102外,KCNQ1上也存在抑制通道功能的磷酸化位点。进一步的实验表明,Ang Ⅱ对KCNQ1N端突变通道(KCNQ1-2M)尾电流的抑制程度为11.71%,显着弱于对野生型通道的作用(30.59%,P<0.01),而KCNQ1的C端突变(KCNQ1-4M)和并不影响Ang Ⅱ的抑制作用(30.62%,P>0.05)。以上结果说明,KCNQ1的N端参与PKC对通道功能的抑制。分别突变N端的S95和T96均可减弱Ang Ⅱ对通道的抑制作用,对S95A和T96A通道的抑制分别为15%(P<0.01)和16.33%(P<0.01),说明S95和T96都参与PKC抑制通道功能。联合突变KCNQ1的N端与 KCNE1 的 S102 后,Ang Ⅱ 对通道(KCNQ1-2M/KCNE1-S102A)的抑制作用几乎消失(2.76%,P<0.01)。以上结果说明PKC在I_Ks上有叁个抑制位点,分别是KCNQ1上的S95、T96和KCNE1上的S102。KCNE1上S102突变并不影响PMA增大I_Ks的作用,我们推断KCNQ1亚基有增强通道功能的位点。PMA对KCNQ1-2M/KCNE1和KCNQ1-4M/KCNE1通道的电流增加分别为31.74%和3.18%,N端突变与野生型通道作用无明显区别(P>0.05),而C端突变几乎取消了其增强作用。结果说明KCNQ1亚基C端参与PKC对通道作用的增强性调控。进一步分别突变C端四个位点,结果显示,PMA对S409A、S464A、T513A、S577A突变通道电流分别增加12.98%、8.56%、6.37%以及11.71%,均较野生型显着降低。结果说明KCNQ1亚基C端的S409、S464、T513以及S577是PKC增强通道功能的磷酸化位点。我们进一步在HEK293细胞上表达克隆的豚鼠KCNQ1/KCNE1通道,将KCNQ1上N端唯一的潜在磷酸化位点S96突变为丙氨酸后,Ang Ⅱ对突变通道的抑制作用几乎消失,进一步表明KCNQ1上N端磷酸化抑制通道功能。小结:KCNQ1亚基存在PKC抑制、增强通道功能的位点,N端磷酸化抑制通道功能,而C端磷酸化增强通道功能;KCNE1上的S102磷酸化则抑制通道功能。(本文来源于《河北医科大学》期刊2017-04-01）
魏卓,罗速[5]（2016）在《蛋白激酶C-δ特异性脱氧核酶对HepG2细胞生长的影响》一文中研究指出蛋白激酶C(PKC)存在于细胞浆内,是一类由钙激活的磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与神经传导、肿瘤生长及细胞生长、分化和凋亡等生理病理过程密切相关。依据对二酰基甘油(DAG)和Ca2+的依赖不同,PKC可以分为传统型(cPKC)、新型PKC(nPKC)和非典型PKC(aPKC)[1-3]叁类。蛋白激酶C-δ(PKC-δ)属于nPKC,其激活物是DAG(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2016年01期）
李军华,周薇[6]（2014）在《p38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂SB203580对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-6和IL-1β的影响》一文中研究指出目的观察p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂SB203580对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-6和IL-1β的影响,探讨p38MAPK在溃疡性结肠炎中的可能作用。方法 45只健康SD大鼠随机均分为正常对照组、模型组、SB203580组。采用叁硝基苯磺酸(TNBS)制备大鼠溃疡性结肠炎模型,免疫组织化学方法检测大鼠肠组织活化转录因子2(p-ATF2)表达,ELISA法检测大鼠血清白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)表达水平,并观察肠道大体形态和组织学改变;同时分析p-ATF2水平与IL-6及IL-1β含量的关系。结果与正常对照组相比,模型组大鼠肠组织p-ATF2水平、血清IL-6及IL-1β含量显著增高(P<0.05),SB203580组p-ATF2表达与血清IL-6、IL-1β水平均明显低于结肠炎模型组(P<0.05),p-ATF2水平与IL-6及IL-1β含量呈正相关(P<0.05)。结论 p38MAPK抑制剂SB203580通过下调p-ATF2活性及IL-6、IL-1β表达,对TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠起保护作用。(本文来源于《安徽医学》期刊2014年07期）
唐丽霞[7]（2014）在《对虾白斑综合症病毒WSV083是一种双特异性蛋白激酶》一文中研究指出对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)隶属于线性病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus),是一种无包涵体,具有双层囊膜,杆状型的双链环状DNA病毒。该病毒致病能力强,传播范围广,是危害对虾养殖业的主要病原之一,至今依然没有有效的防治方法。在病毒感染增殖过程中,病毒极早期基因编码的蛋白质起着非常关键的调控作用。wsv083是WSSV的极早期基因,预测其编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。病毒蛋白激酶的作用对象可以是自身的蛋白质也可以是宿主的蛋白质,而VP28和VP19是WSSV的两个主要的囊膜蛋白,且它们有着苏氨酸磷酸化修饰。那么WSV083能否介导VP28和VP19的磷酸化修饰?我们以此作为切入点,展开了针对WSV083的研究上作。结果发现：1、VP28和VP19的苏氨酸残基磷酸化修饰并不由WSV083所介导；2、WSV083能进行自身丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化,是一个双特异性蛋白激酶(Dual-specificity protein kinase,DSK);3、WSV083序列的S134,T66,Y165和Y304为磷酸化位点；4、WSV083以点状定位于细胞核内,而突变体失去激酶活性后以散状定位于细胞核内,推测其靶向与激酶活性有直接关系。(本文来源于《厦门大学》期刊2014-04-01）
陈朝武[8]（2014）在《蛋白激酶特异性辅助分子伴侣CDC37在乙肝相关肝细胞癌中过表达的调控研究》一文中研究指出研究背景：原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一种恶性程度高、进展快、预后差的肿瘤。HCC作为最常见的恶性肿瘤之一,大部分患者诊断时已处于疾病的中晚期,失去手术治疗的机会,并且具有侵袭性强、易复发转移等特性,给治疗带来了困难。虽然目前对肝癌的诊疗水平有所提高,但治疗效果仍不十分理想。由于其较高的病死率、有限的治疗手段以及复杂的发病机制,使肝癌的防治成为世界性的难题。HCC呈全世界性分布,发病率因地区而异,我国、东南亚和非洲等地区均是高发地区。目前普遍认为HCC的发生是多种因素共同作用的结果,这些因素包括病毒、寄生虫感染、黄曲霉素的摄入和自身遗传因素等。其中乙型肝炎病毒(HBV)感染与HCC的发生密切相关,就全球范围来讲,HBV慢性感染仍然是HCC最重要的病因。我国是HBV感染的高发地区,全国估计有近1亿慢性HBV感染者,HBV感染是引起我国肝癌高发病率的主要原因,但其致病机制尚不十分清楚。肝癌的发生是多种因素共同作用的结果,其过程涉及一系列的分子事件,包括多个基因及多条细胞信号转导通路的改变。而蛋白激酶(Protein Kinase, PK)在信号转导中发挥着重要的作用,其稳定和成熟需要分子伴侣蛋白的帮助。热休克蛋白90(Heat shock protein90, HSP90)是最为重要的一种分子伴侣,其发挥作用的过程中需要多种辅助分子伴侣的共同参与,其中CDC37(Cell Division Cycle, CDC37)是最重要的辅助分子伴侣之一CDC37分子可作为辅助分子伴侣,特异性地介导多种蛋白激酶与HSP90的结合,对维持蛋白的稳定性和激酶活性有重要意义,在细胞周期、信号转导和基因表达中都起着重要的作用,并且与肿瘤的发生发展密切相关。研究表明,CDC37可在多种肿瘤细胞中过表达,而将其作为靶点抑制它的表达可同时抑制多条信号通路,能更有效地抑制肿瘤细胞的生长。目前有关CDC37与肝癌方面的研究较少,部分研究表明其可在肝癌细胞中表达增高,本文通过研究进一步明确CDC37在HBV相关肝癌组织中的表达情况,并希望从不同角度探讨CDC37在HBV相关肝细胞癌中过表达的机制,为肝癌的防治提供参考。研究目的：我们前期及本文的研究发现CDC37在HBV相关肝癌组织中过表达,本研究拟从病毒及宿主两方面对CDC37在HBV相关HCC中过表达的机制进行探讨,为HCC的防治及明确CDC37在其它肿瘤中过表达的机理提供参考。1、采用Wsetern的方法对CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况进行分析,以进一步明确其是否在HCC中过表达,以便下一步对其过表达的机制进行探讨。2、研究HBV的复制和不同基因的表达是否会影响肝细胞内CDC37的表达水平,从而促进肝癌的发生发展。3、通过分析不同nicroRNA对CDC37基因mRNA3'UTR荧光素酶报告基因活性的影响,探讨相应microRNA是否与CDC37过表达有关。4、探讨CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式是否与CDC37基因过表达相关。研究方法：1、采用Wsetern的方法对CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况进行分析收集南方医院2012-2013年42例HBV相关HCC患者手术后组织标本,分别留取其肿瘤及癌旁正常肝组织,提取组织蛋白,用Western blot方法分析CDC37蛋白在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并进一步分析CDC37的表达与临床病理特征的关系。2、HBV的复制和不同基因的表达对CDC37表达水平的影响首先扩增HBV6种基因P、preS1、preS2、S、C和X,并构建至pCMV表达载体,分别转染Huh7和HepG2细胞系,Western blot检测CDC37表达水平；另外将含CDC37基因启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL3与HBV的6种基因表达质粒分别共转染Huh7和HepG2细胞系,检测荧光素酶信号。其次分别构建B、C、D和CD重组体4种HBV基因型毒株的1.28拷贝全基因质粒,运用AdEasy腺病毒系统进行重组和包装后分别感染Huh7和HepG2细胞系,并检测CDC37表达水平。3、调控CDC37表达的microRNA(1)调控CDC37基因表达的microRNA基因克隆：分别用miRBase, Targetscan, miRanda以及RNA22软件对可能调控CDC37表达的nicroRNA分子进行了预测,并用合成的microRNA前体分子与克隆有CDC37基因mRNA的3'UTR的载体pMIR-REPORT分别共转染Huh7, HepG2以及293T细胞,对预测的可能调控CDC37表达的microRNA分子进行筛选。本研究中我们首先扩增了5种可能影响CDC37表达的microRNA分子miR-155、miR-503、miR-877、miR-885和miR-181, PCR产物纯化后用Kpn I和Xba I双酶切,再与经同样酶切的pcDNA3.1载体连接并转化至JM109感受态细胞。对经过初步鉴定的阳性克隆提取质粒并进行酶切,测序证实扩增序列的正确性。构建的microRNA表达质粒分别命名为pcDNA3.1-MIR155、pcDNA3.1-MIR181pcDNA3.1-MIR503、pcDNA3.1-MIR877、pcDNA3.1-MIR885。(2) pMIR-Luc-Cdc37表达载体的构建：提取肝组织总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增CDC37基因mRNA的3'UTR, PCR产物纯化后用Spe I和HindⅢ双酶切,再跟经同样酶切的pMIR-REPORT荧光素酶报告载体(Ambion公司)连接并转化至JM109感受态细胞。对经过初步鉴定的阳性克隆提取质粒并进行酶切、测序鉴定。(3)细胞转染：采用脂质体转染法将上述5种microRNA重组表达质粒和pMIR-Luc-Cdc37表达质粒共转染48孔板中的Hu7和293细胞,阴性对照为pcDNA3.1空载体,用pRL-TK质粒作为内参平衡不同孔之间的转染效率。(4)转染效果的测定：转染48小时后裂解细胞检测荧光素酶信号,以验证哪种microRNA对CDC37基因具有抑制作用,从而明确哪种microRNA可调控CDC37基因的表达。4、CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式与过表达的关系对22例接受肝脏手术的肝癌患者,分别提取癌组织和癌旁组织中的基因组DNA, PCR法扩增CDC37基因启动子区含微卫星区段序列,并克隆至PMD-18T载体,每份标本至少挑选3个以上克隆进行测序,然后对肝癌组织和癌旁组织间、CDC37过表达的肝癌组织与相应的癌旁组织间、CDC37过表达和无过表达的肝癌组织间启动子GT微卫星多态性组成形式进行比较分析。结果：1、CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况经western分析和对相应条带灰度值的计算结果表明,肝癌组：中位数为338.53,癌旁组：中位数为133.39,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。比较肝癌不同临床病理特征分组中CDC37蛋白的表达情况显示,CDC37蛋白的高表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、肿瘤转移情况无关(P>0.05),与肿瘤结节数有关(P<0.05)。2、HBV的复制和不同基因的表达对CDC37表达水平的影响基因表达结果显示,HBV6种基因的表达对肝癌细胞系内CDC37的表达水平无明显影响,而且HBV6种不同蛋白的表达对CDC37启动子的活性无明显影响。1.28拷贝HBV全基因质粒的感染结果显示,HBV不同基因型毒株的复制对CDC37基因的表达水平亦无明显影响。3、不同microRNA表达载体对CDC37报告基因荧光素酶活性的影响本研究成功构建了5种nicroRNA表达质粒,与CDC37报告基因共转染Huh7细胞和293细胞后,荧光素酶检测结果显示,转染各microRNA重组表达质粒的孔中相应荧光素酶比值与阴性对照孔相比,并无显着下降,说明相关microRNA干扰质粒对CDC37基因并无明显抑制作用。4、CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式与过表达的关系CDC37基因启动子区存在(GT) nl-GC-(GT) n2多种类型的微卫星形式,位于CDC37启动子区约1368-1415位之间,以(GT)10-GC-(GT)9最为常见。肝癌组织和癌旁组织间CDC37启动子微卫星多态性形式的总体分布之间没有统计学差异(P>0.05)；CDC37过表达的肝癌组织与相应的癌旁组织间微卫星的总体分布也无统计学差异(P>0.05)；而CDC37过表达和无过表达的肝癌组织间微卫星的总体分布存在统计学差异(P<0.05),其中(GT)10-GC-(GT)9形式在过表达组中的频率显着高于无过表达组,差异有统计学意义(χ2=11.508, P<0.05),(GT)10-GC-(GT)12形式在无过表达组中所占比例明显高于过表达组,差异有统计学意义(χ2=15.055,P<0.05)结论：1、经Western方法对肝癌及相应癌旁正常组织CDC37蛋白含量的检测表明,CDC37在HBV相关HCC中过表达。2、HBV的复制和不同基因的表达不会明显影响CDC37的表达水平。提示HBV的复制和不同蛋白的表达不会通过上调肝细胞内CDC37的表达水平而导致HCC的发生。3、本研究未筛选到调控CDC37基因表达的nicroRNA, CDC37基因的表达是否存在microRNA调控有待明确。4、CDC37基因启动子区存在微卫星多态性,但不同的微卫星组成形式是否会影响基因的表达尚待进一步研究。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-03-18）
黄晶,任阳,余秀锋,周锡红,汪以真[9]（2013）在《猪腺苷酸活化蛋白激酶α基因(AMPKα)特异性siRNA载体的构建及干扰效果评价》一文中研究指出腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),在真核细胞生物中广泛存在,是调控机体能量代谢的关键酶。本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)AMPKα基因的有效siRNA干扰载体,并探讨AMPKα基因对脂肪分解关键酶基因表达的影响。根据猪AMPKα基因(GenBank登录号:NM-001167633)全长cDNA序列,设计合成其特异性发夹siRNA干扰片段,将其克隆插入pSilencer 4.1-CMV neo Vector干扰载体中,构建猪AMPKα基因的siRNA真核表达载体RA1和RA2,并通过PCR、双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肌内脂肪前体细胞并检测其干扰效果及对脂肪分解关键酶——激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)、脂肪甘油叁酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase,CPT1)基因表达的影响。结果表明,所构建的猪AMPKα基因的特异性siRNA表达载体RA1和RA2均可降低猪AMPKαmRNA表达(P<0.05),而且RA2干扰效果优于RA1。用RA2干扰AMPKα后,猪肌内脂肪前体细胞中AMPKα及脂肪分解关键酶HSL、ATGL和CPT1基因表达量显着下降(P<0.05)。提示,抑制AMPKα基因表达后,猪肌内脂肪前体细胞中脂肪分解和脂肪酸氧化速率降低。本研究结果为深入探讨AMPKα对猪脂肪代谢的影响机制及通过营养调控基因表达进而调控猪体脂沉积提供基础资料。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2013年09期）
梅幼敏,宦泓,周艳,谢海燕,张汝阳[10]（2012）在《人特异性蛋白激酶-15基因在增生牙龈组织中表达的研究》一文中研究指出目的:检测细胞增殖相关基因人特异性蛋白激酶-15(specific protein kinase 15,NYD-SP15)基因在增生牙龈及正常牙龈组织中的表达,初步探讨该基因与牙龈增生发生的关系。方法:应用RT-PCR及免疫组化法检测27例正常牙龈组织(取自外伤冠折后行牙冠延长术中切除的牙龈组织)及40例牙龈增生患者(以增生表现为主的慢性牙龈炎12例、药物性牙龈增生13例、牙龈瘤15例)牙龈切除术中切除的增生牙龈组织标本中NYD-SP15 mRNA及蛋白的表达。结果:增生牙龈组织中NYD-SP15的mRNA水平显着高于正常牙龈组织(P<0.05)。免疫组化结果显示,在正常牙龈组织中该基因高表达于胞浆,在增生牙龈组织中高表达于胞核。结论:NYD-SP15表达量异常以及定位差异在人牙龈增生发生发展过程中起到一定的作用,但该基因高表达与牙龈增生发生的相关机制尚待进一步研究。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2012年10期）
双特异性蛋白激酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶(AMPK)基因的小鼠模型,并观察对血压的影响。方法:利用胚胎显微注射法构建AMPKα1基因第3外显子两端携带loxP位点的小鼠模型,和集落刺激因子1受体启动子诱导表达Cre酶的小鼠模型,交配繁育出巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型。鼠尾DNA做PCR鉴定基因型,腹腔注射他莫昔芬诱导敲除AMPK,Real-time PCR检测小鼠骨髓细胞AMPK RNA水平。检测Cre阴性小鼠注射与不注射他莫昔芬的血压差异,以及Cre阴性和阳性小鼠注射他莫昔芬5d后的血压差异。结果:鼠尾DNA PCR鉴定出AMPKα1 loxP为纯合阳性、且Cre为阴性或阳性的小鼠。与Cre阴性小鼠相比,他莫昔芬显着降低了Cre阳性小鼠骨髓细胞AMPK mRNA[(0.9263±0.1293)vs.(0.47±0.04657),P<0.017]。他莫昔芬对Cre阴性小鼠血压的影响不显着[收缩压(122.9±3.183)vs.(124±6.878) mmHg,1 mmHg=0.133 kPa,P=0.427],而AMPK敲除鼠血压显着低于对照组[收缩压(123.5±3.577)vs.(107.5±4.814)mmHg,P=0.037]。结论:成功构建巨噬细胞特异性敲除AMPK的小鼠模型,证实敲除鼠血压降低。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双特异性蛋白激酶论文参考文献
[1].秦波音,王超,刘洋,谭丹,方钟.受体相互作用蛋白激酶-3参与甲型流感病毒H1N1感染C57BL/6小鼠诱导特异性CD8~+T细胞应答[J].中国实验动物学报.2019
[2].郑帅,刘燕,朴春梅,刘婷婷,王吉静.巨噬细胞特异性敲除一磷酸腺苷激活依赖性蛋白激酶基因的小鼠模型构建[J].心肺血管病杂志.2019
[3].李明翰.蛋白激酶C通路特异性甲状旁腺素模拟肽在连续应用时对骨骼系统作用的研究[D].南方医科大学.2019
[4].勾向博.蛋白激酶C亚型特异性调控慢激活延迟整流钾电流及其分子机制[D].河北医科大学.2017
[5].魏卓,罗速.蛋白激酶C-δ特异性脱氧核酶对HepG2细胞生长的影响[J].中国实验诊断学.2016
[6].李军华,周薇.p38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂SB203580对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-6和IL-1β的影响[J].安徽医学.2014
[7].唐丽霞.对虾白斑综合症病毒WSV083是一种双特异性蛋白激酶[D].厦门大学.2014
[8].陈朝武.蛋白激酶特异性辅助分子伴侣CDC37在乙肝相关肝细胞癌中过表达的调控研究[D].南方医科大学.2014
[9].黄晶,任阳,余秀锋,周锡红,汪以真.猪腺苷酸活化蛋白激酶α基因(AMPKα)特异性siRNA载体的构建及干扰效果评价[J].农业生物技术学报.2013
[10].梅幼敏,宦泓,周艳,谢海燕,张汝阳.人特异性蛋白激酶-15基因在增生牙龈组织中表达的研究[J].南京医科大学学报(自然科学版).2012
标签：RIP3; 流感病毒; 特异性CD8~+T细胞;