谭穗懿段恒梁铮林刘叔文段文军通讯作者
（南方医科大学药学院广东广州510515）
【摘要】目的：用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取液中分离出不同组分，考察其抗HIV-1的活性及初步探讨其作用机制。方法：青果的氯仿萃取液用高速逆流色谱法分离出各组分；利用HIV-1假病毒检测各组分抑制HIV-1感染的活性；XTT比色法检测各组分对细胞的毒性；采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）研究各组分体外抗病毒活性的机理。结果：青果氯仿萃取液能抑制HIV-1JRFL假。结论：病毒感染活性；用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取液中分离
【关键词】青果；氯仿；HIV-1；抗病毒活性；高速逆流色谱法
【中图分类号】R453【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0472-02
我国中草药资源丰富，低毒、长效、可长期服用等优点使得中医药在我国防治艾滋病方面具有独特的优势［1］。我们小组的前期研究表明，青果水提物中依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取的各部位均显示出抑制HIV-1gp41形成六螺旋束结构的活性［2］。用高速逆流色谱法成功从乙酸乙酯萃取部位中分离出4个纯度较高并具有显著抑制HIV-1病毒感染活性的成分［3］。在本研究中，我们应用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取部位中分离各成分，并探讨其抗HIV-1感染的活性并初步研究其作用机制。
1资料与方法
11一般资料
111细胞株及质粒:HEK293T，U87CD4CCR5等细胞株以及质粒含荧光酶素（luciferase）报告基因的HIV-1缺陷型质粒pNL4-3Luc.R-E-，来源于美国NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram。质粒pJRFL由南京大学医学院公共健康中心吴稚伟教授惠赠。
112试剂:DMEM培养基、FBS、Trypsin/EDTA消化液均购自美国Gibco公司。转染试剂PEI购自上海起福生物科技有限公司，荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，XTT以及链亲合素标记的辣根过氧化酶（SA-HRP）购自美国Sigma公司。青果购于广东潮州，经南方医科大学中西药学院刘强副教授鉴定为真品。
113仪器:RE-210E型旋转薄膜蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；GeniosPro型Tecan酶标仪（美国Tecan公司）；TBE-300A高速逆流色谱仪（上海TautoBiotech公司）
12方法
121青果氯仿萃取物的制备:新鲜的青果洗净后置干燥箱内600C干燥5h，剥取果肉后继续在600℃干燥箱内烘干。粉碎后取400g，分别加水4000、2000、2000ml煮沸提取3次，提取时间分别为60、45、30min，滤过后合并三次水提液，浓缩至4000ml。取上述水提液，按水：石油醚(V/V)=2：1的比例，用石油醚萃取四次并合并，将石油醚萃取后的水提液同法用氯仿萃取，回收溶剂后真空干燥得氯仿提取物粗品。
122高速逆流色谱法分离青果氯仿萃取物的各成分:选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(420:500:420:500,v/v/v/v)为高速逆流色谱法的溶剂体系，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分混合，静置分相平衡后，分出上相和下相，使用前分别用超声波脱气40min。取约200mg青果氯仿粗提物，溶于上、下相各75ml的混合溶剂中，超声振荡使之完全溶解，得分离所用的样品溶液。根据色谱图手动收集各色谱峰流分，进样320min后停机，收集各流分，各流分用旋转薄膜蒸发器回收溶剂后，氮吹仪吹干得到粗组分。
123抗病毒活性的研究
1231HIV-1Env假病毒的包装及收获:在六孔板中接种HEK293T细胞（2×105个/孔），次日细胞长至50～60%汇合时，换用无血清的DMEM培养基，接着每孔加入混合好的转染试剂PEI12μl，2μgpNL4-3luc.R-E-质粒以及2μgpJR-FL包膜蛋白质粒。转染24h后更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，于转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min，上清分装后置于-80℃备用，即得HIV-1JFRL假病毒。
1232各组分抗假病毒感染活性的检测:在96孔板中接种U87CD4CCR5细胞1×104个/孔。次日将HIV-1JFRL假病毒（50μl）和梯度稀释的化合物（50μl）混合，置于37℃预孵育30min，然后加入至细胞培养板中。48h后用荧光素酶报告基因检测试剂盒及多功能酶标仪（Tecan）检测化学发光数值，从而确定化合物抗HIV-1假病毒的活性。
124化合物对细胞毒性的检测:采用XTT法检测化合物对细胞的毒性。在96孔板中接种1×105个/ml的U87CD4CCR5细胞，每孔接种100μl。次日将不同浓度的各组分（100μl）加入细胞孔中，同时设正常细胞对照孔。培养72h后吸取细胞培养基，每孔加入200μl新鲜无酚红1640培养基以及50μl的含有002mMPMS的XTT溶液（1mg/ml），继续培养4h后倾去培养液，震荡溶解10min，用多功能酶标仪于450nm处测定吸光度。计算细胞存活率。
125ELISA法检测各组分抑制gp41六螺旋束结构形成的活性:根据文献报道［4］，将2μM衍生于gp41NHR区的多肽N36先与稀释后的待测各组分在37℃孵育30min，然后再加入2μM衍生于gp41CHR区的多肽C34，继续孵育30min。将孵育好的混合液加入到包被好兔抗N36/C34的多抗（2μg/ml，用pH88的01MTris-HCl缓冲液稀释）的96孔酶标板中，孵育1h。然后依次加入gp41六螺旋束特异的鼠单抗NC-1，生物素标记羊抗鼠IgG，SA-HRP和TMB，检测450nm处的吸光度值，判断化合物抑制gp41六螺旋束结构形成的活性。
各组分对gp41六股α-螺旋束结构形成的抑制率按下式计算。IC50用Calcusyn软件计算。
抑制率（%）=样品孔A450-PBS空白孔A450未加样品的（N36+C34）A450-PBS空白孔A450×100%
2实验结果
21青果氯仿萃取物抗HIV-1假病毒活性:我们首先考察了青果氯仿萃取物的抗HIV-1假病毒的活性，结果如图1所示。其抗病毒活性呈浓度梯度依赖的关系。
青果氯仿萃取物中分离的3个组分抗HIV-1假病毒活性为了进一步研究青果氯仿萃取物中抗艾滋病毒的活性成分，我们用高速逆流色谱法，从青果氯仿萃取物中分离出8个成分，由于组分I、II、V含量和纯度较高，因此我们主要研究这三个组分，其中组分II纯度达90%以上。我们探讨了这三个组分抗HIV-1假病毒的活性，结果如图2所示。结果如图3所示。3个组分在100μg/ml浓度下，对U87CD4CCR5细胞的没有毒性。
Elisa检测3个氯仿提取组分抑制HIV-1gp41六螺旋束的形成最后，我们探讨了3个组分抑制HIV-1感染的活性是否通过抑制HIV-1gp41六螺旋束结构的形成。结果如图4所示。在100μg/ml浓度下，组分I和组分V能抑制HIV-1gp41六螺旋束结构的形成，而组分II却不能抑制HIV-1gp41六螺旋束结构的形成。
3讨论
高速逆流色谱法以其快速、进样量大、费用低、回收率高等优点，在天然产物活性成分的分离纯化领域备受重视［5］。本研究在前期工作的基础上，利用高速逆流色谱法的快速分离与应用安全、无感染性的假病毒体系，成功从青果氯仿萃取液中分离出三个具有抗HIV-1感染的组分。在HIV-1进入靶细胞过程中，病毒跨膜糖蛋白gp41发挥重要作用，其功能是介导HIV-1包膜与靶细胞的融合［6］。而其中N-末端重复序列和C-末端重复序列参与形成的六股α-螺旋束结构在病毒融合阶段中发挥关键作用。在机制研究工作中，利用本研究团队建立的夹心ELISA法［7］，发现组分I和组分V能抑制gp41六螺旋束结构的形成，因此gp41的六螺旋束结构很可能就是组分I和组分V的作用靶点。研究结果表明，利用高速逆流色谱法，从青果氯仿萃取液中分离出三个具有显著抗HIV-1活性的组分，其中组分I、V可能作用于gp41六螺旋束结构，组分II抗病毒活性有待进一步研究，各组分有待进一步纯化，寻找抗HIV-1的活性成分，有望开发出天然产物来源的抗病毒药物。
参考文献
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［5］赵碧清，段更利.高速逆流色谱法在中药有效成分分离中的应用［J］.中成药，2007，29(9):13471349
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