一株降解邻苯二甲酸二丁酯的内生细菌的分离及其降解功能研究

论文摘要

随着工业的快速发展,邻苯二甲酸酯（PAEs）作为增塑剂被大量使用导致严重的环境污染,危害人体健康。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是PAEs中的重要成员,在土壤中富集的DBP极易被植株吸收而影响农作物的生长。本研究通过在DBP污染土上移栽上海青（Brassica rapa var.chinensis）后研究植株的生长情况及抗氧化酶活性差异研究DBP对植株的胁迫影响,并从DBP污染土壤上生长的酸模植株中分离得到一株能够高效降解DBP的植物内生菌,命名为HB-T2,通过生理生化试验、16SrDNA分析鉴定菌种,研究其生长特性、对DBP的降解特性和影响因素以及PAEs其他家族成员的底物广谱性研究,初步探索菌株降解DBP的代谢途径;对HB-T2进行全基因组草图测序后寻找该菌株降解DBP的酯酶基因,原核表达后研究其对DBP及PAEs其他家族成员的降解特性;将HB-T2定殖到叶菜类蔬菜上海青中,研究菌株定殖情况及上海青体内DBP的残留,通过检测上海青抗氧化酶活性变化研究该菌株对植株的抗胁迫能力的影响。主要研究结果如下:1、从酸模植株体内分离纯化得到一株能以DBP为唯一碳源生长的内生细菌,通过生理生化试验、16SrDNA序列以及系统进化树分析发现与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似度为99%,将该菌株命名为HB-T2。在离体培养下HB-T2降解DBP的最佳条件为35℃,pH为8.0,DBP初始浓度为10mg/L,接菌量2%,降解效率为6h降解DBP达到98.9%。该菌株降解DBP的途径为DBP到邻苯二甲酸单丁酯（MBP）到邻苯二甲酸（PA）再到原儿茶酸（PCA）并最终矿化,底物广谱性研究发现HB-T2对PAEs家族中大部分成员都具有良好的降解能力,其中邻苯二甲酸甲苯基丁酯（BBP）、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二甲氧基乙酯（DMEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）的降解效果非常好。2、本章对HB-T2进行全基因组草图测序,并对其中各基因进行功能注释,在NCBI上比对的同时,查阅文献选取多个酯酶基因进行同源性分析,最终筛选出5个高同源性基因,对这5个基因进行体外原核表达后利用DBP底物验证成功筛选出具有PAEs降解能力酯酶基因,并命名为EST-3,同时发现该蛋白对PAEs家族其他成员均具有良好的降解特性,由此说明该蛋白有很高的研究价值。3、向土壤中人为添加DBP,将内生菌HB-T2定殖到上海青后移栽到含有DBP的土壤中培养21天,无定殖菌为对照组,利用液相色谱串联质谱仪（LC-MS）检测上海青植株中DBP含量,DBP胁迫下发现植株根及茎叶部分均被检出有DBP存在,其中根部含量较高;植株的根长、生物量因受DBP胁迫而显著减小,叶绿素含量无显著性差异;植物抗氧化系统同样受到影响,其中过氧化氢（H2O2）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性显著升高,超氧化物歧化酶（SOD）以及植物丙二醛（MDA）含量则无显著性差异;接菌处理后发现接种HB-T2不仅可以降解植株体内DBP含量,还能增强植物的抗胁迫能力,对植株生长状况也有一定改善,说明HB-T2与上海青植株建立了良好的互利共生关系,是一株多功能植物内生降解菌,可以与农作物协同作用规避PAEs污染。

论文目录

摘要

abstract

1 绪论

1.1 研究背景及意义

1.2 邻苯二甲酸酯简介及现状

1.2.1 邻苯二甲酸酯理化性质及组成

1.2.2 邻苯二甲酸酯危害

1.2.3 邻苯二甲酸酯对环境的污染现状

1.2.4 邻苯二甲酸酯的限制或法规

1.3 土壤-作物系统邻苯二甲酸酯污染及治理现状

1.3.1 土壤-作物系统邻苯二甲酸酯污染现状

1.3.2 植株对PAEs的吸收富集能力影响

1.3.3 土壤-作物系统邻苯二甲酸酯治理现状

1.4 植物内生菌降解土壤-作物系统中邻苯二甲酸酯的优势

1.5 微生物降解邻苯二甲酸酯的代谢途径及机理

1.6 微生物降解邻苯二甲酸酯的降解基因

1.7 邻苯二甲酸酯的提取检测技术研究进展

1.8 邻苯二甲酸二丁酯简介

1.9 研究的主要内容

2 降解DBP的内生细菌的分离鉴定、降解性能及优化

2.1 实验材料、试剂及仪器

2.1.1 供试材料及试剂

2.1.2 主要仪器及设备

2.2 实验设计

2.2.1 田间酸模DBP胁迫

2.2.2 DBP降解菌的筛选与纯化

2.2.3 分离菌株的鉴定

2.2.3.1 生理生化测定

2.2.3.2 细菌16SrDNA的测序与系统发育树的构建

2.2.4 菌株的体外降解特性研究

2.2.4.1 研究菌株对DBP的生长降解曲线

2.2.4.2 菌株降解DBP的条件优化

2.2.4.3 离体培养下DBP的提取分析方法

2.2.4.4 菌株的底物广谱性分析

2.2.4.5 DBP降解产物鉴定及降解途径分析

2.2.4.6 仪器检测方法

2.2.4.7 标准曲线的建立

2.2.4.8 添加回收率实验

2.3 结果与分析

2.3.1 降解DBP的内生菌的分离筛选

2.3.2 菌种鉴定

2.3.3 仪器检测结果

2.3.4 DBP及15种PAEs标准曲线的建立

2.3.5 添加回收率试验结果

2.3.6 菌株HB-T2对DBP的生长降解曲线及降解条件优化

2.3.7 菌株对不同PAEs降解情况分析

2.3.8 菌株降解DBP的代谢途径分析

2.4 讨论

2.4.1 降解DBP的内生菌株的分离筛选

2.4.2 HB-T2对DBP的最佳降解条件、代谢途径及广谱性分析

3.菌株HB-T2对DBP的降解基因筛选及验证

3.1 实验材料、试剂及仪器

3.1.1 供试材料及试剂

3.1.2 主要仪器及设备

3.2 实验设计

3.2.1 HB-T2 基因组测序及功能注释

3.2.2 筛选目的基因

3.2.3 目的基因的原核表达

3.2.3.1 设计引物

3.2.3.2 扩增目的基因

3.2.3.3 双酶切质粒及PCR产物

3.2.3.4 将目的基因连入质粒

3.2.3.5 重组质粒转化至感受态细胞DH5α

3.2.3.6 诱导目的基因体外表达重组酯酶及粗酶液制备

3.2.4 粗酶液降解DBP验证目的基因

3.2.5 粗酶液对14种PAEs的降解研究

3.2.6 添加回收率实验

3.3 结果与分析

3.3.1 HB-T2 基因组测序信息

3.3.2 非编码RNA预测

3.3.3 基因功能注释

3.3.3.1 COG基因功能注释

3.3.3.2 GO注释

3.3.4 HB-T25 个酯酶蛋白与已报道的降解DBP的酯酶蛋白进化关系

3.3.5 引物设计结果

3.3.6 粗酶液对DBP降解实验结果

3.3.7 基因EST-3 翻译产物对14种PAEs的降解研究

3.3.8 添加回收率实验结果

3.4 讨论

3.4.1 HB-T2 降解DBP的降解基因EST-3

3.4.2 降解基因EST-3 翻译酯酶对14种PAEs的降解能力

4 菌株HB-T2 定殖上海青后植株生长及对DBP的降解情况

4.1 实验材料、试剂及仪器

4.1.1 供试材料及试剂

4.1.2 主要仪器及设备

4.2 实验设计

4.2.1 HB-T2 菌株标记处理

4.2.2 供试土壤、植株处理

4.2.3 土壤、上海青植株DBP含量测定方案及菌株含量测定

4.2.4 上海青植株生长指标和抗氧化酶活测定方案及方法

4.2.5 样品中DBP的提取分析方法

4.2.6 添加回收率实验

4.3 结果与分析

4.3.1 添加回收率试验结果

4.3.2 接菌后土壤、上海青中DBP含量及菌含量

4.3.3 DBP胁迫以及接菌后上海青植株的生长情况

4.3.4 DBP胁迫以及接菌后上海青植株的抗氧化酶活影响

4.4 讨论

4.4.1 接种HB-T2 后对上海青植株体内DBP的含量影响

4.4.2 接种HB-T2 后对上海青植株生长情况的影响

4.4.3 接种HB-T2 后对上海青植株抗氧化酶活的影响

结论

参考文献

附录

致谢

攻读研究生期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐文君

导师: 程江峰

关键词: 内生降解菌,降解途径,降解基因,定殖,抗氧化系统

来源: 青岛科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 青岛科技大学

分类号: X53;X172

总页数: 86

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