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甲酰甘氨酸生成酶定点固载β2微球蛋白纳米抗体制备免疫吸附剂

2020-12-10阅读(187)

甲酰甘氨酸生成酶定点固载β2微球蛋白纳米抗体制备免疫吸附剂

论文摘要

降低长期接受血液透析治疗的终末期肾病患者体内累积升高的β2微球蛋白（β2-microglobulin,β2m）的浓度,缓解透析相关淀粉样变引发的临床症状是现阶段血液透析的重要目标之一。β2m作为肾衰竭及肾透析患者体内大量蓄积的毒素分子,难以通过传统的基于体积排阻原理的透析材料有效地去除。随着人们对抗原抗体间特异性相互作用的理解的深入,近年来出现了一类以抗体为免疫亲和配基的吸附材料,主要包括单克隆抗体及scFv片段。以抗体为配基的吸附材料相比于传统的化学小分子配基吸附剂具有更高的β2m结合能力以及表观吸附速率,但传统的固定化方法易使抗体失活,亲和配基密度难以提高,吸附特异性有待增强,因此免疫亲和吸附剂并没有快速发展起来。VHH抗体是近年来出现的一种分子量小、亲和力高、稳定性高的生物活性分子,其所具备的一系列优势特性证明了它在血液净化领域具有广阔的应用前景。本论文报道了一种较为简单的VHH抗体吸附剂的制备方法:基于甲酰甘氨酸生成酶（formylglycine-generating enzyme,FGE）的定点修饰能力,在VHH抗体C末端引入醛基,在琼脂糖凝胶上定点固载VHH抗体,制备β2m血液净化吸附剂,并评价了其在血液中吸附β2m的能力。具体过程如下:（1）原核表达β2m VHH抗体及FGE酶:将C末端融合有组氨酸纯化标签（His-tag）及可被FGE定点识别的醛基标签（Ald-tag）的β2m VHH抗体质粒转化至表达菌株E.coli Shuffle（T7）中,对菌株进行扩大培养并诱导表达VHH。一部分菌体经破碎纯化得到高收率、高纯度的VHH抗体（产量:400 mg/L培养基;纯度:95%以上）。一部分菌体的破碎后上清液经50%醋酸溶液沉淀处理（pH 7.4调至pH 4.0）,在几乎不损失目的蛋白的情况下提高VHH在上清液中的纯度至60%左右,便于后续实验中从上清液内直接催化并固载VHH。甲酰甘氨酸生成酶（FGE）在E.coli BL21（DE3）中诱导表达,破碎后经镍金属离子螯合层析进行纯化,每升TB培养基的FGE产量可达300 mg。（2）酶催化条件的优化及β2m VHH抗体的活性表征:通过优化VHH抗体与FGE酶的投料比、DTT的添加量、反应时间、反应温度,发现当抗体与酶的投料比为20:1,在添加有1 mM DTT的三乙醇胺缓冲液（pH 9.0）中,20℃催化4 h即可得到90%的催化转化效率。通过Biacore T200测定催化前后VHH抗体对β2m的亲和力分别为1.220×10-7M和2.308×10-7 M,表明催化后的VHH仍保持较高的抗原结合活性。在菌体破碎后上清液中优化催化条件,最终也能得到79%的催化效率,为上清液中VHH抗体的一步定点固载奠定基础。（3）VHH抗体吸附剂的合成及性能评价:通过合成带有不同种类的间隔臂的琼脂糖凝胶介质（主要包括酰肼末端及氨基末端两类）,发现席夫碱反应（醛基-氨基）相比于腙键连接（醛基-酰肼）能够得到更高的抗体偶联密度（约2.0 mg/mL）,吸附剂对β2m的最大吸附容量为0.89 mg/mL。上清液中一步定点固载制备的β2m VHH抗体吸附剂对β2m的吸附容量为0.75 mg/mL,实验中显示该吸附剂的非特异性吸附水平较低。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 1 文献综述
  •   1.1 肾衰竭与透析相关淀粉样变
  •     1.1.1 概述
  • 2 微球蛋白概述'>    1.1.2 β2微球蛋白概述
  • 2 微球蛋白的去除方法'>    1.1.3 β2微球蛋白的去除方法
  •   1.2 VHH
  •     1.2.1 VHH概述
  •     1.2.2 VHH的生物学特性
  •     1.2.3 VHH抗体的应用
  •   1.3 抗体的定向修饰
  •     1.3.1 抗体定向修饰概述
  •     1.3.2 甲酰甘氨酸生成酶（FGE）
  •     1.3.3 基于甲酰甘氨酸生成酶的定向偶联
  •   1.4 本论文研究目的、意义
  • 2m VHH抗体及FGE的原核制备'>2 β2m VHH抗体及FGE的原核制备
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与设备
  •     2.2.1 材料与试剂
  •     2.2.2 主要仪器及耗材
  •   2.3 实验方法
  • 2m VHH抗体重组表达载体的构建'>    2.3.1 β2m VHH抗体重组表达载体的构建
  •     2.3.2 重组质粒的转化
  • 2m VHH抗体的表达'>    2.3.3 β2m VHH抗体的表达
  • 2m VHH抗体的酸沉淀除杂蛋白'>    2.3.4 β2m VHH抗体的酸沉淀除杂蛋白
  •     2.3.5 金属离子螯合层析纯化目标蛋白
  •     2.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  •     2.3.7 蛋白质纯度及浓度的测定
  •   2.4 实验结果与讨论
  • 2m VHH抗体的表达与纯化'>    2.4.1 β2m VHH抗体的表达与纯化
  •     2.4.2 FGE的表达与纯化
  •     2.4.3 细胞破碎上清液酸沉淀去除杂蛋白
  •   2.5 本章小结
  • 3 FGE酶的催化条件优化
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与设备
  •     3.2.1 材料与试剂
  •     3.2.2 主要仪器及耗材
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 FGE酶催化能力的验证
  •     3.3.2 FGE酶催化条件的优化
  • 2m VHH抗体破碎上清液中直接催化的条件优化'>    3.3.3 β2m VHH抗体破碎上清液中直接催化的条件优化
  • 2m VHH抗体亲和力常数的测定'>    3.3.4 β2m VHH抗体亲和力常数的测定
  •   3.4 实验结果与讨论
  •     3.4.1 FGE酶的催化能力评价
  •     3.4.2 FGE酶催化条件的优化
  •     3.4.3 VHH抗体的亲和力常数的测定
  •     3.4.4 FGE酶对上清液中VHH抗体的催化
  •   3.5 本章小结
  • 2m VHH抗体免疫吸附剂的制备及性能评价'>4 β2m VHH抗体免疫吸附剂的制备及性能评价
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与设备
  •     4.2.1 材料与试剂
  •     4.2.2 主要仪器及耗材
  •   4.3 实验方法
  • 2m VHH抗体吸附剂的合成及偶联条件优化'>    4.3.1 β2m VHH抗体吸附剂的合成及偶联条件优化
  •     4.3.2 环氧基、氨基密度的测定方法
  • 2m VHH抗体吸附剂吸附特异性评价'>    4.3.3 β2m VHH抗体吸附剂吸附特异性评价
  • 2m VHH抗体吸附剂的动力学评价'>    4.3.4 β2m VHH抗体吸附剂的动力学评价
  • 2m VHH抗体吸附剂的等温吸附曲线'>    4.3.5 β2m VHH抗体吸附剂的等温吸附曲线
  •     4.3.6 细胞破碎上清液一步制备免疫吸附剂的等温吸附曲线
  • 2m VHH抗体吸附剂的储藏稳定性'>    4.3.7 β2m VHH抗体吸附剂的储藏稳定性
  •   4.4 实验结果与讨论
  •     4.4.1 凝胶环氧基密度随时间的变化
  •     4.4.2 吸附剂合成的过程优化
  • 2m VHH抗体吸附剂的吸附特异性评价'>    4.4.3 β2m VHH抗体吸附剂的吸附特异性评价
  • 2m VHH抗体吸附剂的吸附动力学评价'>    4.4.4 β2m VHH抗体吸附剂的吸附动力学评价
  • 2m VHH抗体吸附剂的等温吸附曲线的测定'>    4.4.5 β2m VHH抗体吸附剂的等温吸附曲线的测定
  •     4.4.6 细胞破碎上清液一步制备免疫吸附剂的等温吸附曲线
  •     4.4.7 吸附剂的储藏稳定性评价
  •   4.5 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 2m VHH抗体序列'>附录A β2m VHH抗体序列
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张力军

    导师: 贾凌云

    关键词: 抗体,甲酰甘氨酸生成酶,微球蛋白,定点固载,血液净化

    来源: 大连理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,医药卫生科技

    专业: 生物学,化学,材料科学,基础医学

    单位: 大连理工大学

    分类号: R392;O647.33;TB383.1

    DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2019.000274

    总页数: 74

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