野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶慢病毒表达载体的构建及其验证

论文摘要

目的为构建野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶（HPA）的慢病毒表达载体,以探讨HPA的酶活性作用和非酶活性作用。方法根据GV358慢病毒质粒载体序列和HPA基因序列设计用于无缝克隆的引物,HPA的PCR扩增产物与线性化的GV358质粒载体连接,获得重组慢病毒质粒。将经测序验证的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒感染液并感染HEL细胞,利用Western印迹法鉴定HPA过表达效果;利用流式细胞术检测细胞表面硫酸乙酰肝素（HS）的表达量;利用ELISA检测多配体蛋白聚糖1（syndecan-1）的释放量,以验证野生型和酶活缺失型HPA慢病毒表达载体的生物学效应。结果重组慢病毒质粒测序结果符合预期;Western印迹法检测结果表明,过表达HPA的HEL细胞有明显的HPA蛋白表达;流式细胞术结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞表面HS表达量的几何平均荧光强度（160.0±8.0）明显低于空载体对照细胞（345.0±15.2）（P<0.01）;ELISA结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞培养基中多配体蛋白聚糖1的释放量（59.0±3.8）ng·L-1较空载体对照细胞（32.2±3.9）ng·L-1明显增多（P<0.01）;而过表达酶活缺失型HPA的HEL细胞系细胞表面HS的表达量（353.0±14.0）和培养上清中多配体蛋白聚糖1的释放量（30.9±2.9）ng·L-1则与空载体对照细胞相当。结论成功构建了野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒表达载体,并利用HEL细胞系对野生型和酶活缺失型HPA的生物学效应进行了验证,为研究HPA在机体病理生理过程中的作用机制提供了新的工具。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 万禄明,李素波,贠志敏,张雪,高红伟,宫锋,檀英霞

关键词: 乙酰肝素酶,酶活性,慢病毒,硫酸乙酰肝素,多配体蛋白聚糖

来源: 中国药理学与毒理学杂志 2019年12期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技

专业: 基础医学

单位: 军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所

分类号: R346

页码: 1050-1056

总页数: 7

文件大小: 1334K

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