刘北[1]2016年在《葛根素通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬发挥对心肌肥厚的保护作用》文中研究表明研究背景心肌肥厚(cardiac hypertrophy)是心脏应对神经内分泌激活以及压力超负荷的适应性代偿反应。在早期阶段,心肌主要通过肌节数目的增多以及体积的增大平衡增大的室壁张力,进而维持心泵输出的稳定以及满足机体生长发育及代谢的需要。如果刺激因素的持续存在,必将发生包括心肌细胞肥大、心肌细胞丢失、间质纤维化等在内的恶性心肌重构(myocardial remodeling)。神经内分泌-细胞因子系统的激活,与心室重构互为因果,形成恶性循环,逐渐进展为失代偿性的心肌收缩功能障碍,即心力衰竭(heart failure)。因此,深入探讨心肌肥厚相关分子学机制,寻找潜在靶点有效干预以及延缓心肌肥厚发生发展对减少心力衰竭发生以及改善预后意义重大。自噬(Autoghagy),是细胞在应激情况下所做出的一种非损伤性应答反应,其通过对自身胞质内物质和(或)细胞器进行包裹吞噬形成自噬体(autophagosome),进一步与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体(autolysosome),最终将吞噬物降解。通过自噬,降解产物供给细胞重新利用或排出细胞外,因此对细胞结构、功能以及代谢平衡的维持具有重要意义。在生理情况下,细胞维持一种较低水平的自噬,其主要目的在于清除长寿蛋白和衰老受损的细胞器。当受到各种生理或病理刺激因子的作用时,自噬显着激活。作为一种细胞应对内外环境变化的重要反应机制,自噬降解并清除受损或衰老的细胞器以及错误折迭蛋白,进而稳定细胞形态和结构,维持细胞正常功能以及延缓细胞衰老。此外,自噬还有助于清除入侵的微生物防治感染的发生。既往研究证实,在心肌肥厚的不同阶段,自噬呈动态改变,在疾病进展过程中发挥双重作用。Tanaka等通过构建Lamp-2-/-小鼠,结果发现小鼠心脏与体重的比值明显增大,心肌收缩功能显着降低,同时发现大量自噬泡在横纹肌中的线粒体,肝细胞、胰腺的泡腺细胞内堆积。Nakai等通过特异性敲除Atg5基因构建自噬缺陷小鼠模型,与正常小鼠比较,接受主动脉缩窄术的小鼠更快发展为心室肥大,同时伴有更严重的左室功能障碍。在高血压或其他原因导致的左心室肥厚中,心肌细胞自噬水平显着降低,心肌肥厚进展显着加快。上述研究表明,自噬介导的降解反应对拮抗病理性心肌细胞肥大具有重要意义。此外,自噬缺陷可导致细胞碎片(异常蛋白质和受损线粒体等细胞器)不能被及时清除,继而诱导细胞凋亡(Apoptosis)的发生。研究证实,通过阻止线粒体膜通透性改变,线粒体自噬可有效抑制包括细胞色素C、Caspase等在内的促凋亡因子,发挥拮抗细胞凋亡的作用。因此,以自噬调控作为潜在靶点对心血管疾病的防治具有重要意义。葛根素(Puerarin)是一种从豆科植物野葛根(Pueraria lobata)中提取的黄酮类单体,其化学名称为4',7-二羟基-8-β-D-葡萄糖异黄酮。众多国内外研究表明,葛根素药效广泛,可应用于肿瘤、糖尿病、神经退行性变以及炎症等多种临床疾病的治疗。在心血管系统中,葛根素具有抑制离子通道、抗血小板活化、抗细胞凋亡以及扩张血管等生物学功能。临床使用葛根素注射液治疗高血压患者,结果发现与安慰剂组患者比较,葛根素治疗可显着降低血压。细胞实验表明,葛根素可通过抗氧化效应抑制血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大,以及H2O2诱导的心肌细胞凋亡。在自噬方面,有限的研究表明葛根素在酒精性肝细胞损伤以及阿尔兹海默病细胞模型中具有自噬调控作用。此外,作为一种植物雌激素,葛根素也可能通过雌激素样作用或雌激素受体发挥对自噬的调控。尽管如此,目前尚无研究探讨葛根素是否通过调控自噬在心肌肥厚中发挥保护作用。因此,在总结既往相关文献的基础上,本研究提出假设：作为一种潜在的自噬活性药物,葛根素可能通过自噬调控在压力超负荷大鼠中发挥减轻心肌细胞肥大和抑制凋亡的心肌保护作用。本研究分别通过腹主动脉缩窄术构建压力超负荷大鼠模型以及异丙肾上腺素刺激H9C2细胞肥大,观察自噬的时序性变化特征。通过葛根素治疗心肌肥大模型,观察自噬以及心肌细胞结构和功能的变化。通过对自噬相关蛋白的基因表达进行特异性干扰,观察对葛根素心肌保护作用的影响,进而对葛根素调控自噬的分子生物学机制进行初步探讨。第一章 葛根素对心肌肥厚过程中自噬的影响目的：分别通过动物和细胞实验,观察自噬在心肌肥厚中的时序性变化特点。在心肌肥厚模型基础上,观察葛根素治疗对心肌细胞自噬的影响。方法：通过腹主动脉缩窄术(aortic banding, AB)构建大鼠心肌肥厚模型,分别在AB术后1w、2w、3w以及6w获取大鼠心肌组织,使用免疫印迹法(Western blot)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ、P62以及Beclinl的时序性表达。将所有大鼠分为4组,即假手术组(Sham组),腹主动脉缩窄术组(AB组),AB组+葛根素治疗组(Pue组,100mg/kg-d腹腔注射)以及AB+雷帕霉素组(Rapa组,1.2mg/kg-d腹腔注射)。治疗3周后分别通过Western Blot和免疫组织荧光法检测自噬标志蛋白LC3、P62以及Beclinl的表达。体外实验给予异丙肾上腺素1μM(ISOpreterenol,ISO)分别刺激H9C2细胞3h、6h、12h及24h,通过Western Blot检测LC3II在ISO刺激下的时序性表达。分别给予Pue(1μM、5μM、10pM以及20μM)预刺激H9C2细胞18h,再给予ISO1μM继续刺激6h,检测并比较不同浓度Pue处理下LC3II的表达。给予氯喹10μM(chloroquine, CQ)预处理H9C2细胞16h,再给予ISO及Pue等处理,通过GFP-LC3转染检测并比较各处理组中的自噬体。结果：LC3II、P62以及Beclinl在Sham组与AB术后1w中比较,差异无显着性。与Sham组比较,AB术后2w及3w,LC3II显着下调(0.04±0.02 vs.0.10±0.02,P<0.01；0.05±0.03 vs.0.10±0.02,P<0.01),P62显着上调(0.37±0.06,vs.0.18±0.04,P<0.01；0.31±0.06 vs.0.18±0.04,P<0,01),Beclin1无显着差异,而在AB术后6w与Sham组比较,LC3II、Beclin1显着上调(0.15±0.03 vs.0.10±0.02,P<0.05；0.36±0.03 vs.0.19±0.02,P<0.05),P62显着下调(0.05±0.03 vs.0.18±0.04,P<0.01)。与AB组比较,AB术后给予Pue或Rapa治疗3周,LC3II表达明显上调(0.23±0.01 vs.0.03±0.01,P<0.01；0.25+0.04 vs.0.03+0.01,P<0.01),p62表达明显下调(0.03±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.01；0.03±0.01 vs.0.22±0.01,P<0.01)。Beclin1在四组之间的比较无统计学意义。体外实验中,与对照组比较,ISO1μM刺激心肌细胞3h,6h可分别显着下调LC3II表达(0.85±0.04 vs.0.33±0.01,P<0.01；0.81±0.34 vs.0.33±0.01,P<0.01),而刺激12h,24h可分别显着上调LC3II(0.134±0.04 vs.0.33±0.01,P<0.01；0.13+0.06 vs.0.33±0.01,P<0.01)。与ISO组比较,Pue组(5μM、10μM、20μM)可呈浓度梯度依赖性上调LC3II(0.39+0.01,0.53+0.04,及0.96±0.15分别vs.0.19±0.01,P<0.01),而LC3II在Pue(10M)组与ISO组的比较无显着差异(0.22±0.02 vs.0.19±0.01,P=0.69)。通过GFP-LC3转染观察自噬流的改变。与Con组(41.11+11.56)比较,CQ10μM(140.87±28.07)孵育心肌细胞可显着增加自噬体形成(P<0.01)；ISO+CQ(21.21±9.05)共孵育心肌细胞,较ISO组(11.35±4.69)自噬体增加没有统计学意义(P=0.34)；与ISO组比较(11.35±4.69),Pue+ISO组(45.50±6.81)显着增加自噬体(P<0.01),Pue+CQ+ISO组(119.4812.54)较Pue+ISO组自噬体进一步显着增多(P<0.01)。结论：心肌肥厚早期自噬被显着抑制,心肌肥厚后期自噬被显着激活。与雷帕霉素相似,葛根素治疗在心肌肥厚中具有自噬激活作用。第二章 葛根素在心肌肥厚中通过调控自噬发挥心脏保护作用目的：观察葛根素在心肌肥厚中对心肌细胞肥大和凋亡的抑制作用。通过干扰自噬调控,观察对葛根素心肌保护作用的影响。方法：体内实验分为四组：Sham组,AB组,Pue+AB组(100mg/kg.d腹腔注射6周)及Rapa+AB组(1.2mg/kg.d腹腔注射6周)。心脏超声心动图测定心室厚度及收缩功能；处死动物后测量心脏/体重质量比、左心室/体重质量比；苏木精-伊红(HE)染色以及Masson染色评价心肌细胞肥大及间质重构；qRT-PCR检测心肌组织肥大基因ANP、β-MHC mRNA表达。Western Blot险测cleaved-caspase3 (C-Casp3), Tunnel染色检测组织心肌细胞凋亡；体外实验分为对照组(Con)、ISO组(1μM刺激H9C2细胞48h)、Pue组(1μM、5μM、20μM分别与ISO1μM共刺激心肌细胞48小时)。通过鬼笔环肽染色测量心肌细胞表面积,qRT-PCR检测ANP和β-MHC mRNA表达。通过Hoechst33342染色、Western Blot检测C-Casp3评价并比较心肌细胞凋亡。在给予3-甲基腺嘌呤10mM(3-Methyladenine,3-MA)或特异性干扰Atg5基因表达的基础上,Western Blot检测LC3II的表达评价对葛根素调控自噬的影响。通过鬼笔环肽染色测量心肌细胞表面积、qRT-PCR检测肥大基因表达观察对葛根素改善心肌细胞肥大的影响。通过]Hoechst33342染色、免疫沉淀法检测C-Casp3以及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术评价对葛根素抑制心肌细胞凋亡的影响。结果：与Sham组比较,AB组ANP、β-MHC mRNA均明显上调(8.21±0.48 vs.1.05±0.08,P<0.01；11.26±0.71 vs.1.30±0.27,P<0.01)。与Rapa相似,给予Pue治疗6周,ANP、β-MHC mRNA均较AB组显着下调(1.40±0.28 vs.8.21±0.48,P<0.01；1.47±0.10 vs.11.26±0.71,P<0.01)。术后6周行心脏超声多普勒检查,]LVEF与LVFS在四组之间比较,差异不具有统计学意义。与Sham组(134.78±5.68,215.64±1.14,128.53±4.76,222.32±5.57)比较,左室肥厚指标LVPWd、LVPWs、IVSd以及IVSs在AB组(234.95±9.53,333.62±9.80,199.23±7.42,313.64±16.64)显着增加(P<0.01)。与AB组比较,Pue组LVPWd、LVPWs、IVSs以及IVSd显着减小(152.66±8.37,230.20±3.47,133.89±3.01,246.28±4.71)。HW/BW和LVm/BW在AB组(4.53±0.44,3.18±0.29)与Sham组(2.69±0.16,1.84±0.08)比较均显着增大(P<0.01),在Pue组(3.00±0.38,1.74±0.43)及Rapa组(2.82±0.12,1.97±0.23)分别较AB组显着减小(P<0.01)。病理结果显示,心肌细胞面积及间质纤维化在AB组较Sham组明显增加,在Pue和Rapa组分别较AB组明显减小。Tunel法检测心肌细胞凋亡率,结果表明：与Sham组(0.002±0.001)比较,AB术后6周心肌细胞凋亡率(0.101±0.022)明显增加(P<0.01)。AB术后分别给予葛根素和雷帕霉素治疗,可较AB组明显减少心肌细胞凋亡(0.008±0.002vs.0.101±0.022,P<0.01；0.008±0.002 vs.0.101±0.022,P<0.01)。C-Casp3蛋白表达在AB组(1.20±0.22)较Sham组(0.04±0.02)显着上调(P<0.01),Pue组(0.04±0.01)与Rapa组(0.05±0.01)较AB组显着下调。体外实验结果表明,ANP、P-MHC mRNA水平在ISO组(3.50±0.52,3.98±0.30)中较Con组(0.93±0.22,0.85±0.19)表达显着上调(P<0.01),在Pue (1μM)组与ISO组比较,无显着差异(3.00±0.18 vs.3.50±0.52,P=0.06；3.73±0.33 vs.3.98±0.30,P=0.18),在Pue(5μM及20μM)组中分别较ISO组显着下调。心肌细胞表面积在ISO组较Con组明显增加(703.00±18.57 vs.299.00±26.14,P<0.01),在Pue(1μM)组与ISO组比较无显着差别(683.50±18.72 vs.703.00±18.57,P=0.20),在Pue(5μM,20μ)分别较ISO组显着减小。Hoechst33342检测的细胞凋亡率在ISO组与Con组比较显着增加(0.13±0.02 vs.0.03±0.02,P<0.01),在Pue(1μM)组与ISO组比较无显着差异(0.11±0.01 Vs.0.13±0.02,P--0.34),在Pue(5μM,20μM)组分别较ISO组显着减少。与Pue组比较,3-MA+Pue+ISO组心肌细胞LC3II表达明显下调(0.28±0.17 vs.1.12±0.30,P<0.01)、细胞表面积显着增大(821.87±41.45 vs.392.29±23.42,P<0.01)、ANP及β-MCH mRNA表达明显上调(3.48±0.24 vs.1.36±0.08,P<0.01；4.75±0.37 vs.1.48±0.09,P<0.01)以及心肌细胞凋亡显着增加(Hoechest33342染色：0.15±0.03 vs.0.05±0.03,P<0.01；流式细胞术：16.61±0.77 vs.5.82±0.27,以及C-Casp3:1.56±0.01 vs.0.11±0.03,P<0.01)。进一步使用RNAi技术特异性下调自噬相关基因Atg5,与Control-SiRNA (C-siRNA)中细胞比较,Atg5及LC3II表达分别在SiRNA-Atg5 (Si-Atg5)转染的细胞中显着下调。LC3II表达在Con组(Si-Atg5)、ISO组(Si-Atg5)以及Pue组(Si-Atg5)之间差异无统计学意义。心肌细胞表面积、ANP和β-MCH基因表达以及心肌细胞凋亡分别在Pue组(Si-Atg5)与ISO组(Si-Atg5)比较差异无显着意义。结论：葛根素具有抑制心肌细胞肥大和细胞凋亡的作用。自噬可能是葛根素发挥心脏保护作用的机制之一。第叁章 葛根素通过AMPK/mTOR信号通路发挥自噬调控作用目的：观察葛根素在心肌肥大中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过特异性干扰AMPK基因表达,观察对葛根素调控自噬以及心肌保护作用的影响方法：ISO(1μM)分别体外刺激心肌细胞3h、6h、12h以及24h。Pue(1μM、5μM、10μM以及20μM)与ISO(1μM)共孵育心肌细胞6h,western blot检测p-AMPK、自噬标志蛋白LC3以及凋亡蛋白C-Casp3, Hocchest33342染色观察心肌细胞凋亡。通过药物(Dorsomorphin, Dor)或RNAi技术特异性干扰AMPK表达基础上给予Pue (20pM)与ISO (1μM)共培养H9C2细胞,观察对Pue自噬调控以及心肌保护作用的影响。体内实验分别在AB术后1w、2w、3w以及6w观察并比较AMPK激活的时序性变化。通过免疫共沉淀方法检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达。结果：在AB术后2w开始,P-AMPK/T-AMPK较Sham组显着下调(0.18±0.04vs.0.49±0.16,P<0.01),但在AB术后6w(0.96±0.11)较Sham组(0.49±0.16)显着上调(P<0.01)。ISO(1μM)分别予体外刺激H9c2细胞3h、6h可分别较Con组细胞显着下调P-AMPK(0.18±0.06 vs.0.93±0.04,P<0.01；0.20±0.05 vs.0.93±0.04,P<0.01),而分别刺激细胞12h、24h则较Con组细胞显着上调P-AMPK(2.22±0.25 vs.0.93±0.04,P<0.01：2.26±0.48 vs.0.93±0.04,P<0.01)。Pue(1μM)预处理心肌细胞24h,再给予ISO1μM共刺激心肌细胞6h,与ISO组比较,P-AMPK表达无显着差异(0.21±0.03 vs.0.22±0.03,P=0.87)。在Pue组(5μM、10μM及20μM)中,P-AMPK分别较ISO组表达显着增加(0.40±0.01 vs.0.22±0.03,P<0.01；0.48+0.03 vs.0.22±0.03,P<0.01；0.48±0.07 vs.0.22±0.03,P<0.01)。Pue治疗3周(0.87+0.06)可较AB组显着上调P-AMPK(P<0.01)。与Sham组比较,AB术后3周P-mTOR(1.55+0.09 vs.0.54+0.02,P<0.01)及下游蛋白P-4EBP1(2.19±0.34vs.1.09±0.018,P<0.01)、P-p70S6K(0.97+0.05 vs.0.33±0.01,P<0.01)表达显着上调；Pue治疗3周后,可分别较AB组显着下调P-mTOR(0.12±0.02 vs.1.55+0.09,P<0.01)及下游蛋白P-4EBP1(0.89±0.10 vs.2.19±0.34,P<0.01)、P-p70S6K(0.09±0.05 vs.0.97+0.05,P<0.01)。与Con组(1.07+0.19)比较,ISO组(0.14±0.11)明显抑制LC3Ⅱ表达(P<0.01)；与ISO组比较,Met组(二甲双胍1mM与ISO共刺激H9C2细胞)或Pue组(20μM共ISO共刺激H9C2细胞)可分别显着上调LC3Ⅱ(1.03±0.23 vs.0.14±0.11,P<0.01；1.20±0.35 vs.0.14±0.11,P<0.01)。与Pue组比较,Dor组(5μM预刺激H9C2细胞4h,再予Pue+ISO共刺激H9C2细胞)可显着下调LC3Ⅱ(0.09±0.08 vs.1.20±0.35,P<0.01),增大细胞表面积(745.75±41.06vs.325.00±12.91,P<0.01),上调ANP(4.08±0.44 vs.1.07±0.29,P<0.01)和β-MHC mRNA(3.99±0.25 vs.0.97±0.17,P<0.01)以及增加细胞凋亡(Hoechst33342染色：0.15±0.03 vs.0.05±0.03,P<0.01；C-Casp3:0.46±0.12 vs.0.09±0.03,P<0.01)。通过RNAi技术特异性下调AMPK表达,LC3Ⅱ在Si-AMPK转染细胞中与C-siRNA转染细胞比较明显下调,在Pue (C-siRNA)与ISO(C-siRNA)中比较差异无显着性。Pue组(Si-AMPK)与Pue组(C-AMPK)比较,LC3Ⅱ显着下调(0.05±0.02 vs.1.51±0.07,P<0.01),心肌细胞表面积显着增大(727.75±71.37 vs.342.50±74.92,P<0.01),ANP(4.18±0.49 vs.0.98±0.15,P<0.01)和β-MCH mRNA(4.03±0.22 vs.0.95±0.24,P<0.01)表达显着上调以及细胞凋亡(Hoechst33342染色：0.13±0.02 vs.0.05±0.03,P<0.01；C-Casp3表达：0.36±0.10 vs.0.09±0.02,P<0.01)显着增加。结论：AMPK/mTOR可能是葛根素发挥自噬调控和心肌保护作用的分子生物学
常丽萍[2]2017年在《芪苈强心胶囊治疗慢性心力衰竭的作用机理及代谢组学研究》文中研究说明慢性心力衰竭作为严重威胁人类健康的慢性、难治性疾病之一,是多因素相互作用的复杂病理过程,传统中医药对其临床指导价值日益凸显。中医脉络学说指出气阳虚乏是其基本病机,阳气失于温煦,运血无力,营卫失和、气化失司,津血互换障碍,导致痰瘀阻络,津液不能回流聚于络外,而发为“气分”、“血分”、“水分”病变,据此确立“气血水同治分消”治则和“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法,制定芪苈强心胶囊组方。本研究选用芪苈强心胶囊作为干预药物,揭示其对慢性心力衰竭大鼠心功能、RAAS系统、心肌微血管、肾脏水代谢等干预作用及其相关机制,同时采用代谢组学技术和生物信息学分析方法,揭示血浆内源性代谢物和药效作用之间的相关性研究,为复方中药现代化研究提供方法学探索,为佐证脉络学说科学价值提供研究数据支撑。第一部分芪苈强心胶囊对心梗后心力衰竭大鼠心功能及作用机制研究目的:探讨芪苈强心胶囊对慢性心力衰竭大鼠心功能、心脏微血管,以及肾脏水代谢的影响。方法:采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死(AMI)后心力衰竭大鼠模型,分别以结扎前后心电图ST段下降值评价AMI模型是否成功,4w后小动物超声仪检测左室射血分数小于45%判定心力衰竭模型成功,随机分组并灌胃4w、6w、8w叁个时间点后检测心功能、NT-proBNP水平、RAAS系统的变化,干预8w后观察心肌组织超微结构、心肌纤维化情况;通过观察不同时间点血浆神经调节蛋白1(NRG1)、血管生成素样蛋白4(AngPTL4)水平,以及干预8w后心肌微血管内皮细胞超微结构、心肌组织NRG1、AngPTL4蛋白/基因表达情况,揭示通络复方芪苈强心胶囊对心脏微血管,以及对血管舒张的作用;通过检测不同时间点降钙素基因相关肽(CGRP)水平,以及8w后eNOS/鸟苷酸环化酶(sGC)/环磷酸鸟苷(cGMP)/蛋白激酶G(PKG)蛋白/基因表达情况,进一步验证芪苈强心胶囊舒张血管是否与NO介导的cGMP-蛋白激酶系统途径有关;通过检测血浆精氨酸加压素(AVP)水平,以及肾脏受体v2r及水通道蛋白(aqp2)蛋白/基因表达情况,观察芪苈强心胶囊对肾脏水代谢的影响。结果:1证实芪苈强心胶囊能够抑制慢性心力衰竭大鼠心室重构及raas系统激活,减轻心肌细胞损伤,提高心功能,延缓心衰病程,改善预后超声心动图结果显示,芪苈强心胶囊明显缩小心力衰竭大鼠心室腔,改善室壁运动协调性,增加心室收缩、舒张幅度,增加血流量,有效降低左室收缩、舒张末期直径和容积,提高左室射血分数。提示芪苈强心胶囊能够改善心力衰竭大鼠心功能,且随着时间延长,效果显着。透射电镜结果显示,芪苈强心胶囊显着减少心力衰竭大鼠心肌组织病理损伤,抑制心肌细胞肥大和炎性细胞浸润,保护心肌细胞超微结构,同时抑制胶原纤维增生,提示芪苈强心胶囊能够保护心肌细胞结构,抑制慢性心力衰竭心室重构。血浆nt-probnp水平检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠血浆nt-probnp水平各时间点均显着增高(p<0.01);与model组比较,qlqx组时间依赖性的降低血浆nt-probnp水平(p<0.05,p<0.01)。血浆raas系统水平检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠血浆ri、angⅡ、ald水平各时间点均显着增高(p<0.01),且随着时间的延长血浆ri、angⅡ、ald升高显着;与model组比较,qlqx组不同程度的降低血浆ri、angⅡ、ald水平(p<0.05,p<0.01)。2揭示芪苈强心胶囊能够保护心脏微血管,舒张血管机制可能与enos/sgc/cgmp/pkg通路有关透射电镜结果显示,model组大鼠心脏微血管内皮细胞损伤严重,基底膜和连接蛋白受损,微血管官腔狭窄或畸形。芪苈强心胶囊能够显着保护连接蛋白,改善微血管内皮细胞超微结构。血浆和心肌组织nrg1、angptl4水平检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠血浆nrg1、angptl4水平均明显降低,心肌组织nrg1、angptl4蛋白和基因表达显着下降(p<0.05,p<0.01),随着时间的延长血浆nrg1、angptl4水平不断降低;与model组比较,qlqx组不同程度的升高血浆nrg1、angptl4水平,升高心肌组织nrg1、angptl4蛋白和基因水平(p<0.05,p<0.01),且随着时间的延长血浆nrg1、angptl4水平升高显着。降钙素基因相关肽(cgrp)水平检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠血浆和主动脉cgrp水平均明显降低(p<0.01);与model组比较,qlqx组升高血浆和主动脉cgrp水平(p<0.05,p<0.01)。enos/sgc/cgmp/pkg通路检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠主动脉cgrp、enos蛋白表达,以及sgc、pkgmrna表达均明显降低(p<0.01);与model组比较,qlqx组cgrp、enos蛋白水平,以及sgc、pkgmrna水平明显增加(p<0.05,p<0.01)。3揭示通络复方芪苈强心胶囊通过降低血浆精氨酸血管加压素(avp),及其受体v2r、aqp2水平,改善肾脏水代谢血浆avp水平及其与raas系统相关性分析结果显示,与sham组比较,model组大鼠血浆avp水平各时间点均显着增高(p<0.01),且随着时间的延长血浆avp始终保持高水平;与model组比较,qlqx组不同程度的降低血浆avp水平(p<0.05,p<0.01)。相关性分析显示,血浆avp与angii水平呈显着正相关(p<0.001)。肾脏v2r及aqp2表达水平检测结果显示,与sham组比较,model组大鼠显着上调v2r、aqp2蛋白和mrna表达(p<0.01);与model组比较,qlqx组不同程度的降低v2r、aqp2蛋白和mrna水平(p<0.05,p<0.01)。小结:慢性心力衰竭发展过程中心脏微血管内皮细胞和心肌细胞受到损伤,raas系统激活,血管阻力增大,血流灌注量不足,心室重构,心室壁协调性较差,肾脏水代谢障碍,心功能下降,同时nt-probnp水平不断增高,预后较差。代表性通络药物芪苈强心胶囊显着保护心脏微血管内皮细胞和心肌细胞结构,改善病理损伤,抑制raas系统激活和心室重构,舒张血管,改善肾脏水液代谢,提高心功能,有效延缓心力衰竭病程,改善预后,进一步佐证脉络学说对慢性心衰防治的指导价值。第二部分心梗后心力衰竭大鼠血浆代谢组学研究及芪苈强心胶囊干预作用目的:揭示芪苈强心胶囊不同活性成分给予慢性心衰大鼠后血浆内源性代谢物的变化,同时结合生物信息学方法分析药效作用和代谢物之间的差异性,为揭示芪苈强心胶囊不同生物活性物质在慢性心力衰竭发展中的治疗作用提示数据支持。方法:利用大孔吸附树脂柱色谱分离方法,分别以不同乙醇浓度(0%、30%、50%、70%、90%)洗脱芪苈强心(qlqx),收集洗脱液得到qlqx-h、qlqx-30%、qlqx-50%、qlqx-70%、qlqx-90%药粉,分别给予ami后心衰大鼠,利用gc-ms、oxylipins、oxidativeandnitrosativestress叁个代谢组平台技术分析大鼠血浆内源性代谢物特征;利用芪苈强心胶囊不同乙醇浓度提取物大鼠血浆代谢物差异性,采用主成分分析、偏最小二乘法等生物信息学方法分析上述代谢物与保护心脏微血管、血管舒张和利尿,抑制raas系统激活等作用之间的相关性。结果:1揭示慢性心力衰竭疾病潜在的生物标记物利用gc-ms、oxylipins、oxidativeandnitrosativestress叁个代谢组平台分析sham组与model组大鼠血浆代谢物特征,结果显示,与sham组比较,model组具有高水平疾病标记物且差异显着(p<0.05)。其中慢性心力衰竭大鼠上调的血浆代谢物溶血磷脂酸(lpac14:0、c18:1、c18:2、c18:3、c20:1、c20:3、c20:5、c22:5、c22:6)、环状溶血磷脂酸(clpac16:0,c18:0)、脂质(5,6-dihetre、12,13-dihode、12,13-dihome、9-hotre、13-kode、9-kode)、有机酸(甘油酸和丙酮酸);下调的代谢产物分别是脂质(11,12-epetre、14,15-epetre、8,9-epetre、8-iso-pga1、12s-hepe、20-hete、13,14-dihydro-pgf2a、pge2);有机酸(2-羟基丁酸,3-羟基丁酸,3-羟基异丁酸,3-羟基异戊酸,乙醇酸,甲基丙二酸,焦谷氨酸),上述代谢物可作为慢性心力衰竭潜在疾病标记物。2揭示芪苈强心胶囊干预慢性心力衰竭潜在的生物标记物结果显示:与model组比较,t3时间点qlqx治疗组大鼠血浆有机酸代谢物差异显着。干预8w后,化合物2-hydroxybutyricacid(2-羟基丁酸),methylmalonicacid(甲基丙二酸),3-hydroxybutyricacid(3-羟基丁酸)水平差异显着,提示上述有机酸代谢产物可作为芪苈强心胶囊干预慢性心力衰竭大鼠潜在的生物标记物。3揭示芪苈强心胶囊药效作用和潜在生物标记物之间的相关性叁个代谢组平台共检测出67种生物标记物,与精氨酸加压素(avp)、raas系统激活呈负相关,与降钙素基因相关肽(cgrp)、血管生成素样蛋白4(angptl4)、神经源性蛋白1(nrg1)呈正相关,提示这些代谢产物与抑制raas系统激活、利尿、扩张血管、保护心肌微血管有关。揭示上述潜在的生物活性化合物与脂质、溶血磷脂酸紊乱有关,调节脂质类物质代谢紊乱可能是芪苈强心胶囊发挥延缓慢性心衰发展治疗作用的重要途径。小结:慢性心力衰竭发生发展过程中氨基酸、脂质能量等代谢紊乱,其中以脂质代谢紊乱最为严重;2-羟基丁酸、甲基丙二酸、3-羟基丁酸等有机酸可作为芪苈强心胶囊治疗慢性心力衰竭潜在的生物标记物;芪苈强心胶囊发挥保护心肌微血管、抑制raas系统激活、利尿、舒张血管的作用与脂质、溶血磷脂酸代谢显着相关,提示抑制脂类物质紊乱可能是芪苈强心胶囊发挥延缓慢性心力衰竭发生发展的重要途径。第叁部分芪苈强心胶囊对心梗后心力衰竭大鼠脂质代谢的影响及相关作用机制研究目的:揭示芪苈强心胶囊对慢性心力衰竭脂质过氧化/硝化应激、脂肪酸能量代谢、胆固醇代谢,以及脂质重要转化途径的干预作用及其相关机制。方法:采用通过elisa、分子生物学方法测定血浆8-异前列腺素f2α(8-iso-pgf2α)、3-硝基酪氨酸(3-nt)水平和心肌组织中3-nt蛋白水平,揭示慢性心力衰竭大鼠心肌组织脂质氧化/硝化应激水平及芪苈强心胶囊的干预作用;采用气相色谱法检测心肌组织中脂肪酸构成,以了解心肌组织中n-3系和n-6系pufas水平及其与血浆游离脂肪酸(ffa)的相关性;围绕胆固醇、脂肪酸等脂质代谢的关键转录因子、脂肪酸能量代谢的关键激动/限制酶类,以及脂质转化lox、cox两大途径,通过检测心肌组织中蛋白/基因表达水平,揭示慢性心力衰竭大鼠上述的代谢过程及芪苈强心胶囊的干预作用机制。结果:1揭示芪苈强心胶囊能够抑制脂质过氧化/硝化应激水平与sham组比较,model组大鼠血浆8-iso-pgf2α、3-nt水平以及心肌组织3-nt蛋白表达明显升高(p<0.05,p<0.01);与model组比较,qlqx组显着降低血浆8-iso-pgf2α、3-nt水平以及心肌组织3-nt蛋白表达(p<0.05,p<0.01)。2揭示芪苈强心胶囊能够改善脂肪酸能量代谢气相色谱分析心肌组织多不饱和脂肪酸构成,血浆ffa水平检测及相关性分析结果显示,与sham组比较,model组大鼠心肌组织n-6系pufas和血浆ffa显着升高,n-3系pufas明显降低(p<0.05,p<0.01),且ffa与n-6系pufas呈显着正相关(p<0.001),与n-3系pufas(c18:3、c22:5)呈负相关(p<0.01),提示pufas和ffa水平与慢性心力衰竭发生发展密切相关,n-6系pufas水平增高,释放入血的ffa水平升高,细胞毒性增强,n-3系pufas水平下降,心肌组织不饱和脂肪酸构成紊乱。芪苈强心胶囊能够明显降低血浆ffa和心肌组织n-6系pufas水平,升高n-3系pufas水平(p<0.05,p<0.01),改善pufas构成和能量代谢,减少毒性脂质堆积,延缓慢性心力衰竭进程。心肌组织脂肪酸转位酶(fat/cd36)、脂肪酸β氧化过程限速酶(cpt-1)、脂肪酸合酶(fas)、多聚(adp-核糖)聚合酶-1(parp-1)蛋白和mrna水平检测结果显示,与sham组比较,model组降低fat、cpt-1蛋白和mrna表达,上调fas、parp-1蛋白和mrna表达(p<0.05);与model组比较,qlqx组不同程度的升高fat、cpt-1蛋白和mrna表达,降低fas、parp-1蛋白和mrna表达(p<0.05,p<0.01),揭示芪苈强心胶囊通过促进脂肪酸转运和利用,抑制脂肪酸合成,从而减少脂肪酸堆积,减轻心肌能量耗损和衰竭,改善心肌能量代谢。3揭示芪苈强心胶囊通过胆固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(scap)/胆固醇调节元件结合蛋白(srebp-1c)/乙酰辅酶a羧化酶-1(acc1)途径调节胆固醇代谢心肌组织scap/srebp-1c/acc1蛋白和mrna水平检测结果显示,与sham组比较,model组不同程度的上调scap、srebp-1c/p-srebp-1c、acc1/p-acc1蛋白和/或mrna表达(p<0.01,p<0.05);与model组比较,qlqx组降低scap、srebp-1c/p-srebp-1c、acc1/p-acc1蛋白和/或mrna表达(p<0.05,p<0.01),提示慢性心力衰竭状态下胆固醇合成过度激活,脂质合成增加,易产生心肌组织脂质堆积,引起脂毒性。芪苈强心胶囊可抑制胆固醇合成过度激活,改善脂质代谢,scap/srebp-1c/acc1途径调节胆固醇代谢可能是改善脂质代谢的重要机制之一。4证实芪苈强心胶囊通过lox和cox两种途径改善脂质代谢,发挥防治慢性心力衰竭的作用心肌组织15-脂氧化酶(15-lox)、胞质型磷脂酶a2(cpla2)、p38丝裂原激活的蛋白激酶及其磷酸化(p38mapk)、环氧化酶-2(cox-2)蛋白和mrna水平检测结果显示,与sham组比较,model组上调cpla2、p38mapk及其磷酸化、cox-2蛋白和/或mrna表达(p<0.01,p<0.05);与model组比较,qlqx组不同程度的降低cpla2、p38mapk及其磷酸化、cox-2蛋白和/或mrna表达(p<0.01,p<0.05),提示慢性心力衰竭病理状态下p38mapk及其磷酸化通路激活lox途径,促进cpla2高表达,加重脂质过氧化状态,cox-2途径被激活,促进花生四烯酸(aa)合成前列腺素,诱导炎症反应。芪苈强心胶囊能够下调15-lox、cpla2、cox-2蛋白和/或基因表达,抑制p38mapk及其磷酸化通路,提示芪苈强心胶囊可通过lox和cox两种途径改善脂质代谢。小结:慢性心力衰竭大鼠脂质过氧化及硝化应激反应增强,n-6系pufas水平增高,脂肪酸堆积,释放入血的ffa水平增高,细胞毒性增强,n-3系pufas水平下降,脂肪酸构成紊乱,胆固醇代谢、以及lox和cox脂质代谢途径过度激活,脂质合成增加引起脂质堆积。芪苈强心胶囊通过下调8-iso-pgf2α、3-nt表达,抑制体内脂质过氧化和硝化应激反应,改善pufas构成和能量代谢,促进脂肪酸的转运、摄取和利用,减少脂肪酸的合成和堆积,改善能量代谢,通过scap/srebp-1c/acc1途径调节胆固醇代谢,可通过p38mapk及其磷酸化通路抑制lox途径和cox途径激活,改善脂质代谢。结论:1以脉络学说为指导探讨慢性心力衰竭中医病机特点,指出营卫失和、气化失司导致的气阳虚乏是其基本病机,阳气失于温煦,运血无力,瘀血络阻,津血互换障碍,导致痰瘀阻滞脉络,津液不能回流聚于络外,从而发为“气分”、“血分”、“水分”病变,叁者互患加重,日久结聚成形,导致络息心积。据此确立“气血水同治分消”治则,制定芪苈强心胶囊组方。2揭示慢性心力衰竭发展过程中心脏微血管内皮细胞和心肌细胞均出现损伤,RAAS系统激活,心室重构,心功能下降,肾脏水代谢障碍。芪苈强心胶囊可保护心脏微血管内皮细胞和心肌细胞超微结构,抑制RAAS系统激活和心室重构,通过eNOS/sGC/cGMP/PKG途径舒张血管,通过抑制AVP及其受体V2R、AQP2表达,改善肾脏水代谢,提高心功能,发挥“益气温阳、活血通络、利水消肿”的作用,进一步佐证了脉络学说防治慢性心力衰竭的重要价值。3采用代谢组学研究技术,利用生物信息学分析方法,揭示慢性心力衰竭发展过程中氨基酸、脂质能量等代谢紊乱,芪苈强心胶囊保护心脏微血管、抑制RAAS系统激活、利尿、舒张血管的作用与脂质、溶血磷脂酸代谢显着相关,提示芪苈强心胶囊抑制脂类物质紊乱在延缓慢性心衰进程中起到重要作用,为复方中药现代化研究提供了方法学借鉴。4揭示芪苈强心胶囊通过下调8-iso-PGF2α、3-NT表达,抑制体内脂质过氧化及硝化应激反应;通过改善心肌组织不饱和脂肪酸的构成,降低血浆FFA水平,减少脂质堆积,通过促进脂肪酸的转运、摄取和利用,从而减少心肌脂肪酸的合成和堆积,改善能量代谢;揭示芪苈强心胶囊可能通过SCAP/SREBP-1c/ACC1途径调节胆固醇代谢,可能通过LOX和COX途径改善脂质代谢。
郎玉苗[3]2016年在《肌纤维类型对牛肉嫩度的影响机制研究》文中认为嫩度是决定牛肉品质的关键指标之一,是影响消费者选择购买与否的主要衡量指标和其市场接受性的关键因素。宰后成熟对牛肉品质特别是牛肉嫩度影响显着,是提高牛肉嫩度、整体提升牛肉品质的重要措施。肌纤维是组成肌肉的基本单位,肌纤维类型与牛肉品质存在一定的相关性关系。然而,目前肌纤维类型与嫩度之间的关系仍存在争议,肌纤维类型影响牛肉嫩度的机制仍在探讨中。本研究以不同肌纤维类型组成的背最长肌、半腱肌和腰大肌为研究对象,分析肌纤维类型组成对牛肉嫩度及宰后嫩化速率的影响。采用ATPase组织化学染色、RT-PCR、免疫印迹和透射电镜的方法,初步从糖酵解、肌原纤维蛋白降解以及肌纤维超微结构变化角度揭示肌纤维类型对牛肉嫩度的影响;同时采用i TRAQ技术对叁个部位肌肉的蛋白组学进行了研究,进而从蛋白组学角度揭示不同肌肉的嫩度差异机制。该研究为精细成熟奠定了理论基础。本研究包括四部分,具体研究结果和结论如下:1.利用ATPase酶染色法和RT-PCR方法测定了背最长肌、腰大肌和半腱肌的肌纤维特性,并研究了肌纤维特性与牛肉品质的关系。肌纤维直径为I型<IIA型<IIB型。腰大肌、背最长肌和半腱肌分别具有最高的I型、IIA型和IIB型的肌纤维数目百分比和面积百分比。腰大肌具有较高的p H24h、弹性和压力失水率,较低的剪切力、硬度和回复性;背最长肌和半腱肌具有较高的剪切力、硬度和回复性。半腱肌的L*和h值高于背最长肌和腰大肌(P<0.05)。肌纤维直径和面积与剪切力和硬度显着正相关(P<0.05)。I型肌纤维比例与剪切力和硬度负相关(P<0.05),而IIB型肌纤维比例与剪切力和硬度正相关(P<0.05)。总体看,提高I型纤维比例和降低IIB型纤维比例能够改善牛肉嫩度。2.研究了不同肌纤维类型组成的背最长肌、腰大肌和半腱肌宰后成熟过程中牛肉品质的变化规律。宰后早期,腰大肌的p H下降速率高于背最长肌和半腱肌。腰大肌的压力失水率高于背最长肌和半腱肌。随着成熟时间的增加,背最长肌、腰大肌和半腱肌的剪切力值均显着降低(P<0.01)。在21 d成熟期内,背最长肌的剪切力始终高于半腱肌和腰大肌,半腱肌的剪切力值始终高于腰大肌(P<0.05)。叁种肌肉的嫩化速率为半腱肌>背最长肌>腰大肌。肌纤维直径和面积与△WBSF极显着正相关(P<0.01)。I型肌纤维的数量百分比与%change WBSF(r=-0.303)负相关;I型肌纤维的面积百分比与△WBSF(r=-0.474)负相关。IIB型肌纤维的数量百分比(r=0.378)和面积百分比(r=0.383)与△WBSF呈正相关。腰大肌的硬度、弹性、粘着性和咀嚼性均低于背最长肌和半腱肌,并且随着成熟时间的增加,这些值逐渐降低。半腱肌的L*值、腰大肌的a*值分别为最高。随着成熟时间的延长,a*、b*、C和h值呈增加的趋势。总的来说,肌纤维类型组成影响牛肉成熟嫩化速率,I型肌纤维比例高的腰大肌的嫩化速率低,IIB型肌纤维比例高的半腱肌的嫩化速率高。3.研究了不同肌纤维类型组成的背最长肌、腰大肌和半腱肌宰后糖酵解和肌纤维超微结构变化,以及肌钙蛋白T、肌间线蛋白和μ-钙蛋白酶的降解变化。宰后1 h和6 h,腰大肌的R250和R248最高,半腱肌的最低;而R258与此相反。宰后叁部位肌肉的R250和R248呈增加的趋势,R258呈降低的趋势。肌纤维超微结构结果显示腰大肌的肌节长度大于背最长肌;半腱肌的Z线降解快于腰大肌。腰大肌的肌钙蛋白T浓度明显低于背最长肌和半腱肌。宰后1 h,背最长肌和半腱肌即出现了38、36、30和28 k Da的降解条带,而腰大肌的30 k Da和28 k Da条带出现在宰后6 h,由此可见背最长肌和半腱肌的肌钙蛋白T降解速率要快于腰大肌。背最长肌和腰大肌分别在宰后3 d和宰后1 h出现肌间线蛋白的50 k Da和47 k Da降解条带。半腱肌中肌间线蛋白的50 k Da降解条带出现在宰后1 h,而47 k Da条带出现在宰后21 d。宰后1 h,叁部位肌肉中μ-钙蛋白酶均发生自溶,但背最长肌和半腱肌的μ-钙蛋白酶的浓度始终高于腰大肌。总的来看,腰大肌中肌钙蛋白T的降解速率低于半腱肌,而腰大肌中肌间线蛋白的降解速率快于背最长肌和半腱肌。这些差异可能与肌纤维类型组成和肌肉特异性有关。4.采用i TRAQ技术对宰后24 h的牛背最长肌、腰大肌和半腱肌进行了差异蛋白组学分析。共鉴定到1123个蛋白,对叁部位肌肉进行两两比较,其中蛋白丰度差异倍数在1.2倍以上的差异蛋白质在ST_121-VS-LT_113组、PM_115-VS-LT_113组、ST_121-VS-PM_115组分别为64、112和153个。叁组中共同的差异表达蛋白为11个,如慢型肌钙蛋白T、肌球蛋白调节轻链2、细胞色素c、热休克蛋白β6等。对所有鉴定的差异蛋白进行生物信息学分析,GO注释结果显示这些蛋白主要涉及细胞过程、代谢过程和应激防御等,主要分布在细胞、细胞器和膜内,具有结合功能、催化活性、酶调节活性和抗氧化活性等;COG分析将这些蛋白分为24类,分别为通用功能预测、翻译后修饰、伴侣蛋白、能量产生和转化、细胞骨架、糖的运输和代谢等;KEGG分析结果显示这些蛋白主要参与代谢、氧化磷酸化、柠檬酸循环和心肌收缩等途径。分析与嫩度形成相关的蛋白结果显示,这些差异蛋白主要通过柠檬酸循环、氧化磷酸化、细胞防御与应激、细胞骨架和调节蛋白以及蛋白水解等途径参与宰后肌肉组织变化,从而影响嫩度。总体来看,肌纤维类型可以通过肌肉的糖酵解、肌原纤维蛋白表达量和降解变化以及蛋白组学的差异表达来部分解释不同部位肌肉背景嫩度和嫩化速率的差异。具有较高I型肌纤维的牛肉嫩度更好,但嫩化速率较低;而具有较高IIB型肌纤维的牛肉嫩度较差,但嫩化速率较高。因此,从肌纤维类型组成角度研究不同部位肌肉的嫩度差异机制具有一定的意义,该研究为分部位精细成熟提供理论基础。
王世强[4]2016年在《TGF-β1/Smad信号通路在运动性心肌纤维化发生中的作用研究》文中研究表明研究目的:研究目的:运动性心律失常一直是体育科学和医学领域十分关注的医学问题,部分运动性心律失常的发生与长期反复大强度运动对心脏的病理性损伤有关,往往影响到运动员的身体健康、系统训练以及比赛成绩。近年研究发现,反复大强度运动造成的心肌损伤纤维化可能与运动性心律失常的发生有关,而损伤纤维化的与高强度运动持续时间关系如何?心肌不同部位纤维化程度是否存在差异?尚不明确。TGF-β1/Smad信号通路是介导纤维化损伤的关键途径,其是否参与了运动性心肌纤维化的调节,目前尚未发现报道。因此,本研究通过建立长期反复大强度运动诱导的心肌损伤纤维化动物模型,探讨TGF-β1/Smad信号通路及其下游因子在运动性损伤心肌纤维化过程中的调控作用。第一部分:长期运动对大鼠心肌损伤和胶原蛋白的影响研究方法:72只SD大鼠分为3组,安静组(C)、中强度组(M)和大强度组(H)。每组又分为8周组、12周组和16周组,每组8只,分别运动8周、12周、和16周。M组跑台速度为15m/min,坡度为5°(相当于58.4±1.7%VO2max负荷强度),H组跑台速度为28m/min,坡度为10°(相当于81.0%±3.5%VO2max负荷强度),每天运动1小时,每周运动5天。小动物超声心动仪检测大鼠心肌结构和功能变化,Elisa法检测大鼠心肌c Tn I的变化,透射电镜和HE染色观察大鼠心肌超微结构和组织形态学改变。样本碱性水解法间接检测大鼠心肌胶原蛋白含量的变化,天狼星红染色观察大鼠胶原蛋白在心肌不同部位的分布,并计算CVF(cardial volume fraction,CVF)的变化。免疫荧光组织化学法和RT-PCR检测心肌I型胶原和III胶原的分布和含量变化。观察随运动时间和运动强度的变化,心肌不同部位心肌损伤程度和胶原蛋白含量的变化。免疫荧光组织化学法检测α-SMA的分布和表达。研究结果:(1)随着运动时间的增加,M组和H组大鼠体重均显着性降低。M组和H组大鼠心脏重量指数逐渐增加。(2)8周运动后,M组和H组左心室结构指标变化不明显。M组LVEF显着增加,而H组无明显改变。M组和H组右心室RVDs和RVDd显着增加,RVFS和RVEF无明显改变。16周运动后,M组和H组LVDd和LVDs均出现显着增加,H组增加的幅度更大。H组左心室LVEF和LVFS均有显着性降低。M组和H组RVDs和RVDd均有不同程度增加,H组RVEF显着性降低,而M组无明显改变。(3)8周、12周和16周运动后,H组c Tn I的含量均显着增加,而M组无明显改变。(4)透射电镜显示,运动各周期M组和H组均发现线粒体增多聚集。H组肌纤维断裂缺失,闰盘不连续,而M组无明显肌纤维损伤。运动各周期,HE染色显示H组心肌有不同程度的损伤,右心室心肌的损伤程度大于左心室,而M组未见明显的心肌损伤。(5)随运动时间的延长,H组心肌羟脯氨酸和CVF逐渐增加,12周和16周心房和右心室出现显着性改变,而左心室无明显变化。M组羟脯氨酸和CVF也具有增加趋势,但无明显差异。(6)随运动时间的延长,H组I型胶原蛋白增加的幅度逐渐增大。16周H组心肌I型胶原的表达均有显着性的增加,心房和右心室增加的幅度要大于左心室。(7)随运动时间的延长,M组和H组III型胶原蛋白的表达逐渐增加,12周和16周心房、右心室和左心室III型胶原均具有显着性增加,H组的增加幅度大于M组。(8)16周运动后,H组右心房和右心室Col-I和Col-III蛋白的比值显着升高,而左心室变化不明显。M组的比值也有所增加,但无显着性差异。(9)运动各周期,M组和H组均未发现大鼠心肌α-SMA蛋白的表达。研究结论:长期中等强度运动使左、右心腔增大,增强了心脏的射血功能,可能与中强度运动促进胶原蛋白的适度增加有关。长期大强度导致大鼠心脏射血功能降低,心肌发生损伤,心肌胶原蛋白过的增加,主要发生在心房和右心室。长期大强度运动造成I/III胶原蛋白比例失调,心房和右心室发生纤维化,可能是导致心脏功能异常和运动性心律失常的重要病理机制。心肌未检测出肌成纤维细胞,提示长期大强度运动导致的胶原蛋白的增加可能是纤维化的早期阶段。第二部分:TGF-β1/Smad信号途径在运动性心肌纤维化中的调节作用研究方法:RT-PCR和Western Blot法检测纤维化关键因子(TGF-β1)、通路调节因子(Smad-2、Smad-3、Smad-4、Smad-7)、下游胶原降解调节因子(MMP-1、TIMP-1、MMP-2和TIMP-2)和胶原合成调节因子(CTGF和micro RNA-21)在C组和H组大鼠心肌中的表达,探讨其在运动性心肌纤维化发生过程中调节作用。研究结果:(1)8周运动后,H组心房、右心室和左心室TGF-β1的表达均显着增加。12周和16周H组心房和右心室TGF-β1的表达均显着增加,而左心室变化不明显。随着运动时间的延长,H组TGF-β1的表达有逐渐降低的趋势。(2)大强度运动对心肌Smad-2和Smad-3无明显影响。(3)随着运动时间的延长,Smad-4的表达逐渐增加,而Smad-7的表达逐渐降低。16周运动后,心肌Smad-4的表达显着增加,而Smad-7的表达显着降低,心房和右心室的变化幅度均大于左心室。(4)心肌MMP-1的表达变化不明显。12周和16周后,心房和右心室TIMP-1的表达显着性增加。随着运动时间的延长,H组MMP-1的表达具有逐渐降低趋势,TIMP-1的表达逐渐升高。心房和右心室MMP-1/TIMP-1的比例显着降低,而左心室无明显变化。(5)随运动时间的延长,H组心肌MMP-2的表达逐渐增加。16周后,MMP-2显着增加,TIMP-2无明显变化,心肌MMP-2/TIMP-2的比值显着增加,心房和右心室MMP-2、MMP-2/TIMP-2的增加幅度大于左心室。(6)随运动时间延长,CTGF具有逐渐增加趋势,但8周和12周均无显着变化。16周后,H组心房CTGF的表达显着性增加,而左、右心室CTGF均无明显变化。(7)运动8周、12周和16周,H组心肌mi R-21的表达显着性增加,心房和右心室增加的幅度大于左心室。研究结论:长期大强度运动引起TGF-β1的持续高表达,通过信号通路蛋白Smad-4和Smad-7介导,进而造成MMP-1/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2的比例失调、CTGF的表达增加、mi R-21持续表达上调,使胶原蛋白的降解发生异常,同时增加了胶原蛋白的合成,导致胶原蛋白的过度堆积诱发了心肌纤维化,可能是心脏功能发生异常和心律失常的分子机制。心房和右心室TGF-β1/Smad通路及下游调控因子的变化幅度大于左心室,可能是心房和右心室的损伤程度较大和发生纤维化的分子机制。
郝燕[5]2017年在《巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）与冠心病严重程度和预后的相关性分析》文中研究指明研究背景冠心病是全世界范围内发病率第一的心血管疾病,在中国由于危险因素如吸烟、肥胖、高血压、高脂血症、糖尿病等的盛行,使得近几十·年来冠心病的发病率迅速上升。冠心病的发生机制非常复杂,其中各种因素导致的炎症及氧化应激反应越来越受到广大医学者的关注。急性冠脉综合征是冠心病中急性发病的临床类型,冠状动脉粥样硬化斑块破裂、糜烂、溃疡并发血栓形成、血管收缩、微血管栓塞至部分或全部血管腔阻塞被认为是急性冠脉综合征的主要原因,常可异致心肌梗死、心力衰裒竭、致死性心律失常甚至死亡等一系列严重后果。而急性冠脉综合征中,无明显血流受阻的轻度冠脉狭窄的斑块破裂所异致的急性冠脉综合征是重度狭窄所致急性冠脉综合征的10倍甚至10倍以上。心源性猝死患者的病理学研究表明,急性冠脉综全征的发生主要是由于冠状动脉易损斑块破裂导致的冠脉内不同时间和不同程度的血栓栓塞。在西方社会,心源性死亡是导致65岁以上人群死亡的首要原因,在所有的与心脏相关的死亡中,几乎一半是突发并不可预期的,因此,早期发现冠心病病人冠脉病变存在不稳定斑块显得十分重要,如何在斑块破裂之前即进行早识别、早治疗已成为我们面临的重大挑战。目前易损斑块的识别仍然是一个难题,尚无准确的方法,有报道说,可以通过冠脉造影观察病变的复杂程度来反映斑块的易损性,如斑块破裂,斑块出血,或血栓的形成,也就是说冠脉造影证实的复杂病变提示该病变处斑块易于破裂或已经破裂,不过由于冠状动脉造影是一种侵入性的过程,需要在导管室完成,科学家和医生希望能找到无创的方式来检测易损斑块,并且这种方式最好是即使在无症状的隐匿型冠心病患者也适用。大量研究已经证实了炎症反应与易损斑块之间有强烈的相关性,因此,炎性标志物有可能成为易损斑块的预测因子。巨噬细胞迁移抑制因子是巨噬细胞产生的一类促炎症因子,也是糖皮质激素诱导的免疫调节因子,具有类似趋化因子的功能,促进细胞定向迁移。自1966年被发现以来,巨噬细胞迁移抑制因子在人体内的功能,尤其是它在固有免疫、免疫细胞招募和炎症反应等方面的研究取得了很大的进展。已经有研究表明,血清巨噬细胞迁移抑制因子在脓毒血症、炎症、自身免疫疾病和动脉粥样硬化的发病机制中发挥了重要作用,研究证实,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平在急性冠脉综合征患者中会有明显升高,并且和颈动脉粥样硬化斑块不稳定性有关。然而,在冠心病病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉粥样硬化斑块的不稳定性之间的关系尚无准确说法,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与冠脉造影的影像学表现之间的关系仍不清楚。研究目的本研究的目的是测定冠心病病人血淸巨噬细胞迁移抑制因子水平,研究它与血管造影证实的冠状动脉复杂病变的相关性,从而进一步探讨血清巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉粥样硬化易损斑块之间的关系。研究方法1.研究对象在这项研究中,我们收集了2013年5月至2015年1月至山东大学附属省立医院就诊的已经明确或怀疑冠心病的病人,这些患者均接受常规冠状动脉造影。经筛选总共有232例的冠心痛患者纳入研究中。这些患者又进一步分为急性冠脉综合征(n =134)和稳定型心绞痛(n =98)两个亚组,同纳入了同时期76名冠状动脉造影证实冠状动脉未见明显狭窄的非冠心病患者作为对照组。有心力衰竭、心肌病、感染性疾病、活动性炎症性疾病、肾功能衰竭、严重肝病、癌症、外周动脉疾病或血液病的患者被排除在外。急性冠脉综合征组包括急性心肌梗死和不稳定型心绞痛。急性心肌梗死定义为胸痛持续了大于30分钟,从胸痛发作至到达医院时间在28天内,在12导联心电图上新的ST-T改变或新的左束支传导阻滞,有心肌损伤标志物(肌钙蛋白T或肌钙蛋白Ⅰ)的升高。不稳定型心绞痛定义为自发性心绞痛,恶化型心绞痛,或初发型心绞痛,无心肌损伤标志物的升高。稳定型心绞痛即稳定型劳力性心绞痛定义为在入院前1-3个月内,疼痛诱发因素、疼痛的频率、持续时间、疼痛程度、疼痛缓解的方式没有变化。2.造影结果分析冠脉造影是在导管室中通过右侧桡动脉或股动脉进行常规的多方位投影,造影图像由两位有经验的介入专家进行分析,分析造影结果的人并不知道患者是我们实验的研究对象,根据Ambrose形态学分类把冠状动脉狭窄归类为简单病变或复杂病变。复杂的病变被定义为至少存在一个如下的特点:偏心性斑块,形态不规则或扇形边界,或两者并存;偏心性狭窄,由一个或多个悬挂边缘,形成一个凸向腔内的窄颈阻塞;斑块溃疡;冠状动脉内血栓导致的充盈缺损。除此之外为简单病变。3.血样收集和生物学标志物的检测分析血标本的采集是在冠脉造影之前采患者的空腹静脉血,从肘静脉将静脉血抽到促凝采血管,室温放置30分钟后3000g离心15分钟,分离血淸后-80℃保存待用。空腹血糖、甘油叁酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均使用标准的实验方案,在Hitachi7600全自动生化分析仪测定(Hitachi Co.,Tokyo,Japan)。血清中巨噬细胞迁移抑制因子水平定量测定使用商业酶联免疫吸附法测定(ELISA)试剂盒,批内和批间变异系数均小于10%,根据制造商的方案(R&D Systems,Minneapolis,MN)进行测定。4.数据分析数据分析采用SPSS 16.0(SPSS.Inc.,Chicago.IL),结果为正态分布的连续变量表示为均值±标准差,非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距)。巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉病变程度的比较,两组间的比较采用t检验、Mann-Whitney秩和检验或卡方检验。叁组或多组比较采用单因素方差分析、H检验或卡方检验。单因素方差分析中当各组之间有显着差异时即原假设Ho被拒绝时采用Bonferronicorrected post hoc test进行分析,即事后校正法对原置信水平·进行修正。多元logistic 回归分析用以评估巨噬细胞迁移抑制因子与稳定型心绞痛患者复杂病变的关系,P值小于0.05被认为是有显着统计学差异。研究结果1.研究人群的基本情况本研究人群的年龄和男女性别比例构成反应了一个相对典型的冠心病人群的年龄和性别比例特征。与对照组相比,稳定型心绞痛组研究人群的血压(收缩压 135.44±19.78 VS.127.37±12.58 mmHg,P<0.05;舒张压 83.36±11.52 VS.79.13±9.95 mmHg,P<0.05)、总胆固醇(4.62±0.99 VS.4.20±0.83 mmol/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(2.68±1.00VS.2.49±0.92mmol/L,P<0.05)有明显升高的趋势,而高密度脂蛋白胆固醇的水平比对照组明显降低(1.03±0.30VS.1.12±0.28 mmol/L,P<0.05)。与对照组相比,急性冠脉综合征组研究人群的血压(收缩压136.03±17.29 VS.127.37±12.58 mmHg,P<0.05;舒张压 84.11±10.64 VS.79.13±9.95 mmHg,P<0.05)、空腹血糖(5.63[4.92-6.67]VS.5.15[4.67-5.81]mmol/L,P<0.05)、总胆古醇(4.88± 1.05VS.4.20±0.83mmol/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(2.93±0.73VS.2.49±0.92mmol/L,P<0.05)有着明显升高的趋势,而高密度脂蛋白胆固醇的水平比对照组明显降低(1.03±0.20 VS.1.12±0.28 mmol/L,P<0.05)。在冠心病组研究人群中,急性冠脉综合征组的病人比稳定型心绞痛组病人的低密度脂蛋白胆固醇明显升高(2.93±0.73 VS.2.68±1.00 mmol/L,P<0.05)。2.血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平稳定型心绞痛组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(1.35[0.88-3.05]VS.0.18[0.14-0.33]ng/mL,P<0.05)。在冠心病组研究人群中,急性冠脉综合征组的病人的血淸巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于稳定型心绞痛组(3.06[1.97-5.201 VS.1.35[0.88-3.05]ng/mL,P<0.05)。3.稳定型心绞痛组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平根据冠状动脉造影的影像结果,稳定型心绞痛组病人被分为简单病变(n =50)和复杂病变(n = 48)两个亚组,我们的研究显示,复杂病变组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于简单病变组(1.98[1.02-4.01]VS.0.98[0.67-2.23]ng/mL,P<0.05)。多元logistic 回归分析显示血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的升高与复杂病变的存在成独立相关(OR:1.46,95%CI:1.13-1.88;P =0.004)。4.急性冠脉综合征组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平根据冠状动脉造影的影像结果,急性冠脉综合征组病人被分为3个亚组:没有复杂病变(n =12);一处复杂病变(n =71);多处复杂病变(n =51),我们的实验显示,在急性冠脉综合征组的病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与复杂病变数量之间有明显的正相关关系(没有复杂病变1.89[0.66-2.30]ng/mL,一处复杂病变 2.68[1.97-4.76]ng/mL,多处复杂病变 3.94[2.35-5.36]ng/mL,P<0.05)。研究结论根据本实验的研究结果,冠心病患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平和冠脉造影所示的复杂病变存在相关性。在稳定型心绞痛组患者中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的升高与复杂病变的存在成独立相关,鉴于其在易损斑块形成的病理生理过程中发挥的作用以及冠脉造影所示复杂病变与斑块易损性的关系,我们推测血清巨噬细胞迁移抑制因子有可能成为预测此类病人存在复杂病变和不稳定斑块的生物学标志物;在急性冠脉综合征组的病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与复杂病变数量之间有明显的正相关关系,因此血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平可能成为一种生物学标志物反应急性冠脉综合征病人冠脉病变的复杂程度,由于多发的复杂病变与急性冠脉综合征患者的不良临床转归相关,因此,我们推测,血清中的巨噬细胞迁移抑制因子也可能是急性冠脉综合征患者疾病进展的一个预后标志物。研究背景心绞痛是由于暂时性心肌缺血引起的以胸痛为主要特征的临床综合征,稳定型劳力性心绞痛指心绞痛发作的程度、频度、性质及诱发因素在1-3个月内无显着变化。典型的心绞痛症状对诊断有重要价值,但是大约40%的稳定型心绞痛患者存在无症状的心肌缺血,临床症状与稳定型心绞痛的病变程度和预后没有直接关系。在过去的几十年中,由于诊断技术的更新,有效药物治疗的完善和越来越成熟的血运重建技术,很多冠心病稳定型劳力性心绞痛的病人得到了及时有效的救治,但是稳定型心绞痛仍然有很高的非致死性心肌梗死发生率和心血管病相关的死亡率。冠状动脉粥样硬化是稳定型心绞痛的主要原因,随着人们对稳定型心绞痛发病机制和临床转归认识的不断深入,尤其是一·些导致冠状动脉粥样硬化斑块不稳定和破裂的机制、冠状动脉血流和心肌需氧关系的研究,目前人们认为稳定型劳力性心绞痛治疗的主要目标是防止急性冠脉综合征的发生和改善缺血的症状,提高患者生活质量,其中预防急性冠脉综合征的发生尤为重要。临床工作中我们要对稳定型心绞痛进行危险分层,主要包括临床表现、对负荷试验的反应、左心室功能及冠状动脉造影显示的病变情况等,冠状动脉造影无疑仍是目前诊断冠心病的"金指标"和决定治疗策略的最重要手段,但但但在实际工作中医生应首先进行无创性检查,包括运动心电图、负荷超声心动图或心肌灌注扫描等,这些检查可以评价有轻、中度症状的患者的病情,并有助于危险分层,从而指导今后的治疗。但是这些无创评估手段很多也存在敏感性低、费用高等缺点,因此人们期待有更经济、安全、精确的可以用于稳定型心绞痛危险分层和预测患者预后的新的方法。谨慎的选择高危人群进行侵入性的检查和治疗不仅可以避免医疗资源的浪费,而且可以避免检查和治疗过程中的风险以及疾病并发症等相关风险,从而使更多人受益。除了传统的危险因素,各种生物学标志物也被用于评估稳定型心绞痛的危险分层和预后,如超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因了-α等。巨噬细胞迁移抑制因子是一种促炎性因子,在有关人类的研究中,人们发现在有些心血管疾病中血清巨噬细胞迁移抑制因子的表达会上调,如冠心病。大量的证据显示巨噬细胞迁移抑制因子与动脉粥样硬化有密切的关系,并且在动脉粥样硬化的不同阶段都有表达,在动脉粥样硬化处的血管内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞和巨噬细胞都会分泌巨噬细胞迁移抑制因子,一旦被释放,巨噬细胞迁移抑制因子便与其受体CD74/CD44或CXCR2/4结合,结合后的巨噬细胞迁移抑制因子不仅可以诱导巨噬细胞粘附、迁移和向泡沫细胞转化,还影响到粥样硬化斑块的不稳定性,巨噬细胞迁移抑制因子在粥样硬化斑块的细胞结构、易损性和破裂方面起了十分重要的作用,并最终对引发冠状动脉内血栓形成的发生和发展产生了重要影响。近期有研究发现巨噬细胞迁移抑制因子在高血压、糖尿病、肥胖等代谢综合征的人群中也有显着升高。通过诸多研究我们相信巨噬细胞迁移抑制因子是动脉粥样硬化发生发展的重要因素,但是巨噬细胞迁移抑制因子是否是冠心病的独立危险因素仍存在争议,巨噬细胞迁移抑制因子是否与冠心病的的预后相关,目前仍没有定论,国内外相关的研究也较少。高血压是冠心病的重要危险因素,这一点已是不争的事实,无论人种或地域,血压和心血管事件危险性之间的关系连续一致,持续存在并且独立于其他危险因素。相当一部分冠心病的患者同时合并有高血压,并且与不合并高血压的冠心病患者相比,患有高血压的患者的冠心病的发病时间更早、疾病进展的速度更快并且预后也更差,临床中早期发现和恰当的检查、治疗无疑对于此类患者会有更大的获益。研究目的本研究的目的是测定冠心病稳定型心绞痛合并高血压和不合并高血压患者血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平,研究血清巨·噬细胞迁移抑制因子与稳定型心绞痛合并高血压患者发生主要不良心血管事件的相关性。研究方法(1)研究对象和分组在这项研究中,我们收集了 2014年10月至2015年10月至山东大学附属省立医院就诊的冠心病稳定型劳力性心绞痛患者,所有病人均在本次或既往入院诊治过程中做过冠状动脉造影明确有冠心病,总共有196例患者纳入研究中。根据是否患有高血压病,这些患者又被分为稳定型劳力性心绞痛合并高血压病组(n=101)和稳定型劳力性心绞痛不合并高血压病组(n =95)两个亚组,同时纳入了同时期50名冠状动脉造影证实冠状动脉未见明显狭窄的非冠心病患者作为对照组,有心力衰竭、1型糖尿病、继发性高血压、心肌病、感染性疾病、活动性炎症性疾病、肾功能衰竭、严重肝病、癌症、外周动脉疾病或血液病的患者被排除在外。稳定型劳力性心绞痛定义为冠心病劳力性心绞痛患者在入院前3个月内,疼痛诱发因素、疼痛的频率、持续时间、疼痛程度、疼痛缓解的方式均没有变化。(2)造影结果分析冠脉造影是在导管室中通过右侧桡动脉或股动脉进行常规的多方位投影,造影图像由两位有经验的介入专家进行分析,分析造影结果的人并不知道患者是我们实验的研究对象。(3)血样收集和生物学标志物的检测分析血标本的采集是在患者入院后第二天采患者的空腹静脉血,从肘静脉将静脉血抽到促凝管中,样品静置凝固30分钟后3000g离心15分钟,分离血清后放于-80摄氏度冰箱保存用于检测巨噬细胞迁移抑制因子,血清中巨噬细胞迁移抑制因子水平定量测定是使用商业酶联免疫吸附法测定试剂盒,批内和批间变异系数均小于10%,根据制造商的方案(R&D Systems,Minneapolis.MN)进行测定。低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和血清C反应蛋白在患者抽血后送交医院检验科,均使用标准的实验方案,在Hitachi7600全自动生化分析仪测定(Hitachi Co.,Tokyo,Japan)。(4)患者的随访所有患者接受随访,随访的方式为电话随访、门诊复诊或者查阅住院记录,随访频率为每90天一次,随访结束时间直到365天或者时间不足365天但是患者发生主要不良心血管事件,主要不良心血管事件为心源性死亡、非致死性急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、手术进行冠状动脉血运重建、心衰和因冠心病出现其他并发症而再次入院。比较患者入院时血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与365天内主要不良心血管事件的发生之间的关系。(5)数据分析数据分析采用SPSS 16.0(SPSS.Inc..Chicago,IL),结果为正态分布的连续变量表示为均数±标准差,非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距)。正态分布资料两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布资料采用秩和检验。计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验。相关分析采用Pearson相关性检验。多因素分析采用l ogi stic回归模型分析。应用Kaplan-Meier曲线和Log-Rank检验比较两组间非校正的发生主要不良心血管事件的生存率。应用多元Cox 回归分析发生主要不良心血管事件的独立危险因素。P小于0.05为差异有统计学意义。研究结果(1)研究人群的基本情况冠心病稳定型心绞痛组和对照组的基本临床资料:叁组之间年龄、性别、高密度脂蛋白胆固醇水平、左室射血分数无显着差异(P>0.05);与对照组相比,冠心病稳定型心绞痛合并高血压病组研究人群的收缩压(138.55± 19.46 VS.118.68±11.55mmHg,P<0.05)、C反应蛋白(5.10±2.40VS.4.32± 1.98mg/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(3.4±0.57 VS.2.44±0.58 mmol/L,P<0.05)均有明显升高的趋势,吸烟人数(52.9%VS.42.0%,P<0.05)和患有2型糖尿病的人数(46.1%VS.0,P<0.05)有显着差异;在冠心病稳定型心绞痛合并高血压病组的病人中,患有2型糖尿病的患者显着高于稳定型心绞痛不合并高血压组(46.1%VS.28.6%,P<0.05)。(2)血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平稳定型心绞痛合并高血压组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(2.53[1.95-3.14]VS.0.16[0.14-0.23]ng/mL,P<0.05);稳定型心绞痛不合并高血压组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(1.93[0.94-2.34]VS.0.16[0.14-0.23]ng/mL,P<0.05);在稳定型心绞痛组研究人群中,合并高血压的病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于不合并高血压组(2.53[1.95-3.14]VS.1.93[0.94-2.34]ng/mL,P<0.05)。(3)主要不良心血管事件的发生情况总共有196名冠心病稳定型心绞痛患者完成了随访,稳定型心绞痛合并高血压组病人发生主要不良心血管事件的人数为32人(31.7%),其中发生非致死性心肌梗死的人数为2人,发生不稳定型心绞痛者为25人,未发生急性冠脉综合征而进行冠状动脉血运重建者5人;稳定型心绞痛不合并高血压组病人发生主要不良心血管事件的人数为14人(14.7%),其中发生不稳定型心绞痛者12人,未发生急性冠脉综合征而进行冠状动脉血运重建者2人。稳定型心绞痛合并高血压组病人发生主要不良心血管事件患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于未发生者(3.22[3.06-3.34]VS.2.18[1.41-2.64]ng/mL,P<0.05);稳定型心绞痛不合并高血压组病人发生主要不良心血管事件患者巨噬细胞迁移抑制因子水平与未发生者相比无显着差异(2.37[0.98-2.85]VS.1.73[0.93-2.20]ng/mL,P>0.05)。Kaplan-Meier分析发现,在稳定型心绞痛合并高血压组,与血清巨噬细胞迁移抑制因子水平较低者相比,巨噬细胞迁移抑制因子水平较高者主要不良心血管事件的发生有显着升高的趋势(P=0.001),而在稳定型心绞痛不合并高血压组患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的高低与主要不良心血管事件的发生无明显相关性(P=0.6072)。(4)血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与预后的关系在稳定型心绞痛合并高血压组病人中,采用单因素COX回归分析发现,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平(风险系数为1.62,95%的置信区间为1.23-2.13,P=0.001)、2型糖尿病(风险系数为1.86,95%的置信区间为1.25-2.76,P=0.002)、低密度脂蛋白水平(风险系数为1.43,95%的置信区间为0.98-2.10,P=0.043)与主要不良心血管事件的发生有显着的相关性,将単因素COX回归分析中P值小于0.3的危险因素,包括吸烟、2型糖尿病、C反应蛋白、低密度脂蛋白胆固醇、巨噬细胞迁移抑制因子水平,做多元COX回归分析发现,巨噬细胞迁移抑制因子水平与主要不良心血管事件的发生有显着相关性(风险系数为1.55,95%的置信区间为1.15-2.08,P=0.004),对主要不良心血管事件的发生有显着独立预测价值。研究结论我们的研究结果表明稳定型心绞痛合并高血压病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显升高,并且巨噬细胞迁移抑制因子水平升高越明显主要不良心血管事件的发生率越高,因此,我们的研究结果表明,血清中的巨噬细胞迁移抑制因子可能是提示冠心病稳定型心绞痛合并高血压患者发生主要不良心血管事件的一种显着、独立的预测因子。
徐群[6]2016年在《自噬在硫化氢保护糖尿病心肌损伤中的作用的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指发生于糖尿病患者的一种以心肌结构和功能异常为主要表现的特异性心肌病,它独立于冠心病、高血压病、心脏瓣膜病等心脏病变,是糖尿病患者死亡的主要原因之一。其病理特征包括：心肌细胞肥大、变性、灶性坏死,心肌细胞外间质胶原沉积及纤维化等。临床表现为心脏舒张和/或收缩功能障碍,易并发心力衰竭、心律失常甚至猝死。DCM常始于一段临床潜伏期,治疗往往被延迟和忽视,导致预后不良。探讨其发病机制将为DCM的早期干预及延缓病情进展提供可能。DCM的确切发病机制还不清楚,它涉及多种因素的共同参与包括高血糖、高胰岛素血症、异常脂肪酸代谢、氧化应激、心脏自主神经病变和局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活等。自噬(autophagy)是细胞回收细胞质和处理多余的或有缺陷的细胞器的过程,在健康和疾病中起着至关重要的作用。鉴于糖尿病是一种代谢紊乱性疾病,而自噬是体内的主要平衡机制可消除受损的细胞器、长寿或异常蛋白质和细胞质的多余的部分,因此推测自噬在体内营养平衡和糖尿病的发展中起着不可或缺的作用。研究证实,自噬可加速游离脂肪酸及晚期糖基化产物(advanced glycation end products, AGEs)的分解、改善心肌缺氧和代谢紊乱、减少氧化应激(oxidative stress, OS)、缓解胰岛素抵抗(insulin resistance, IR),因此在维持心肌细胞稳态以及改善糖尿病患者的心功能方面发挥重要作用。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第3种新型气体信号分子。研究表明,内源性H2S参与了许多心血管系统的生理与病理生理过程。在DCM模型中,腹腔注射或口服H2S可以对抗心肌肥厚,改善糖尿病心脏组织学改变,降低纤维化的程度,并改善了糖尿病状态。在体外研究中同样发现,H2S可减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。其机制主要包括：抗炎、抗氧化以及抗细胞凋亡。然而,H2S对糖尿病心肌损伤的保护作用是否通过调节心肌细胞自噬实现,目前尚未见相关报道。本研究采用高脂喂养+小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,在体内探讨自噬在糖尿病心肌病中的作用及H2S的干预研究。研究目的1.构建2型DCM大鼠动物模型；2.明确自噬相关因子在2型DCM大鼠心肌内的表达；3.探讨H2S对DCM的保护作用是否通过调节心肌细胞自噬实现。研究方法1.构建2型糖尿病大鼠动物模型5周龄雄性SD大鼠34只,适应性喂养1周后随机分为2组：对照组(N=10只)和糖尿病模型组(N=24只)。对照组大鼠喂以基础饲料,糖尿病模型组大鼠喂以高脂饲料。4周后行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)和腹腔胰岛素耐量试验(IPITT),对经高脂喂养后出现胰岛素抵抗的大鼠一次性给予腹腔注射STZ 40mg/kg。STZ注射1周后,测定FBG≥11.1mmol/L者认为糖尿病模型构建成功。糖尿病模型组再次分为糖尿病对照组(DM组,N=12)和NaHS (H2S的外源性供体)治疗组(DM+NaHS组,N=12)。NaHS+DM组予以腹腔注射NaHS溶液14μmol/(kg · d)。给药6周后处死大鼠,留取标本。2.实验末进行以下检测：(1)血清学指标检测包括：各组大鼠禁食过夜,收集外周静脉血检测空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油叁酯(TG)及空腹胰岛素(FINS)水平等,计算胰岛素敏感指数(ISI)。(2)血压和心率的测量：利用大鼠尾动脉血压测量仪测量大鼠尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)和心率(HR),每只大鼠测量3次取平均值。(3)超声心动图：分别测量左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(FS)并计算左室射血分数(LVEF)；测量二尖瓣舒张早期血流速度峰值(E)和舒张晚期血流速度峰值(A)、E/A比值、E波减速时间(EDT)；等容舒张时间(IVRT)。依此来评价各组大鼠的左室舒张及收缩功能。(4)组织形态学分析：通过HE和Masson染色,分别观察心肌的形态结构和心肌内胶原的分布情况,定量分析心肌组织胶原含量,评价心肌纤维化程度。(5) TUNEL染色：取各组大鼠的心脏组织切片行TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡率。(6) Western blot检测：提取各组大鼠的心肌组织蛋白,Western blot检测心肌组织内Bax、Bcl-2、LC3、Atg5的蛋白表达。所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析,连续变量以均数±标准差(Mean ±SD)表示,以p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.实验动物基本情况实验中观察,与对照组(NC组)大鼠相比,糖尿病模型组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状。整个实验过程中有3只大鼠死亡,其中DM组死亡2只,DM+NaHS组死亡1只,最终共31只大鼠完成实验,NC组10只,DM组10只,DM+NaHS组11只。2.各组大鼠血压、心率及代谢指标变化与NC组相比,DM组大鼠的FBG、TG、TC和FINS水平明显升高,ISI显着降低(p<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠的HR明显上升(p<0.05),叁组大鼠的SBP、DBP监测未见明显统计学差异。NaHS干预后能显着改善DM大鼠的代谢异常和受损的胰岛素敏感性(p<0.05),同时可使DM大鼠的HR显着下降(p<0.05)。3.各组大鼠左室结构及功能指标的变化DM组大鼠的心重／体重比值(HW/BW)较NC组显着增加(p<0.05)。HE染色示DM组大鼠的左室室壁增厚,心肌细胞肥大、扭曲,排列紊乱,间隙增大,细胞核大小不甚规则。Masson染色显示：与NC组相比较,DM组大鼠的心肌间质胶原沉积显着增加,胶原纤维排列紊乱。与DM组相比,NaHS干预后可显着降低HW/BW、心肌胶原纤维容积分数(CVF),差异均具有显着性(p<0.05)。超声心动图检测提示,与NC组相比,DM组大鼠在实验末表现为E/A显着降低(p<0.05),而EDT.IVRT显着升高(p<0.05),LVEF.FS变化无统计学差异(p>0.05),提示出现了左室舒张功能障碍,而收缩功能正常。NaHS干预后可显着改善糖尿病大鼠的左室舒张功能,表现为E/A较DM组显着升高(p<0.05),而EDT.IVRT显着降低(p<0.05)。4.凋亡水平在各组大鼠心肌组织的变化TUNEL染色结果显示：与NC组大鼠相比,DM组大鼠心肌细胞的凋亡率显着增加(p<0.05)；与DM组大鼠相比,NaHS干预组大鼠心肌细胞凋亡率显着降低(p<0.05)。Western blot示：与NC组相比,DM组大鼠心肌组织中Bax的表达显着增加(p<0.05),而Bcl-2蛋白的表达显着降低(p<0.05),提示凋亡水平增加,而经NaHS干预后可下调Bax表达同时上调和Bcl-2的蛋白表达,差异均具有显着性(p<0.05)。5.自噬相关因子在各组大鼠心肌组织的表达免疫组化染色显示(图5A),DM组大鼠较NC组相比,自噬相关蛋白Atg5在心肌组织内的表达明显降低,NaHS干预后Atg5的表达较DM组增加。Western blot检测显示,与NC组相比,DM组大鼠心肌组织中自噬相关蛋白Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平显着降低(p<0.05)。而经NaHS干预后可明显上调DM大鼠心肌组织中Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平(p<0.05)。结论1.通过高糖高脂喂养+腹腔注射STZ,成功建立了大鼠DCM模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台；2.在2型DCM早期,心肌内自噬水平被明显抑制,同时伴有左室重构及舒张功能减退;3.外源性H2S可改善DCM大鼠左室重构及功能障碍,其心肌保护作用与上调心肌细胞自噬、抑制凋亡有关。研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指独立于冠心病、心脏瓣膜病、高血压病等以心肌细胞功能异常为特征发生于糖尿病病人的特异性心肌病。尽管DCM的病理机制复杂,高糖仍被认为是心肌损伤的主要致病因素。事实上,高糖的心肌毒性作用已在多种细胞和动物体内证实。高糖诱导的心肌细胞死亡与氧化应激的产生、细胞凋亡加速、线粒体损伤、心肌肥厚、钙稳态失衡及纤维变性有关。体外实验同样显示,在高糖诱导的心肌细胞损伤中,高糖可直接导致活性氧和凋亡水平的升高,以及自噬水平的下降。然而,DCM的潜在机制仍然未被完全揭示,目前临床治疗仍不能有效的减少DCM和心衰的发生。因此,我们合理地提出了一个分子机制,并期望其成为治疗DCM的新的治疗策略。近来,在DCM中失调的自噬功能和硫化氢(H2S)在高糖诱导的心肌细胞毒性中的作用已引起广泛关注。自噬是一种细胞内重要的分解代谢途径,细胞内的长寿蛋白、损伤的细胞器被转运至溶酶体内分解,从而使细胞在经历饥饿或其他各种应激反应时能维持自身稳态。通常的“巨自噬”称为“自噬”,它被严格的控制通过各种正向和负向调节。众所周知,在正常环境下,低水平的自噬是细胞应激的保护机制,然而,过度的自噬却能够导致细胞损伤。最近的研究证实,高水平的自噬可出现在细胞内压力过负荷、缺血再灌注损伤、心力衰竭、心肌梗死和心肌肥厚时,由此可见自噬在多种心脏疾病的发病机制中起重要作用。事实上,有证据显示自噬反应的变化能够促进心脏维持正常功能和形态。然而,自噬在DCM中的作用更复杂。比如,抑制自噬呈现出适应性特征在STZ糖尿病大鼠(1型糖尿病模型),相反却呈现适应不良的特征在HFD诱导的糖尿病大鼠(2型糖尿病模型)。尽管许多的研究已经发现自噬水平的变化在高糖诱导的心肌细胞毒性,但是其病理生理机制仍未完全揭示。H2S是同一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)一样,在生理和病理生理条件下具有抗氧化、抗凋亡、保护线粒体功能、抗炎等作用的一种新的气体递质。近年来,不断增加的证据显示H2S具有心脏保护作用。外源性的H2S已经在STZ大鼠模型中被证实可通过ROS信号通路减少心肌坏死,并且可以通过阻滞心肌细胞凋亡挽救异丙肾上腺素诱导的大鼠收缩功能。H2S是也可促进缺血后左室功能和线粒体呼吸在心肌缺血再灌注损伤后。近来,H2S是在DCM的保护作用吸引了很多研究者的注意。H2S延缓DCM的发展通过减弱氧化应激、凋亡和炎症。H2S还能减弱高糖诱导的心肌毒性作用在H9c2细胞。尤其,H2S能恢复心肌缺血再灌注损伤的自噬水平和逆转高脂抑制的自噬活性。这些发现让我们有理由猜测H2S可能是一个潜在的治疗手段在糖尿病相关的疾病。综上研究结论我们合理地提出了一个假设：自噬在H2S对糖尿病心肌损伤的保护机制中发挥重要作用。在第一部分的实验中,我们在糖尿病大鼠体内已证实了H2S对糖尿病心肌细胞受损的保护作用,并同时观察到自噬水平的上调,提示H2S对糖尿病心肌细胞受损的保护作用可能通过上调心肌细胞自噬实现。第二部分实验我们将体外模拟糖尿病发生,建立高糖诱导的人AC16心肌细胞毒性模型,进一步在细胞水平验证自噬在H2S减弱高糖诱导的心肌毒性作用中的机制,从而为DCM的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。研究目的1.验证高糖诱导的人AC16心肌细胞的毒性作用；2.明确H2S对高糖诱导的人AC16心肌细胞毒性的保护作用；3.体外探讨自噬在H2S对高糖诱导的心肌细胞毒性的保护作用中的机制。研究方法1.细胞培养以AC16人心肌细胞系为研究对象,以5.5mmol/L的正常糖培养基作为正常对照(control),采用不同浓度的高糖(11mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmol/L)作为刺激体外模拟糖尿病状态,观察不同浓度高糖对心肌细胞活性的影响。2.体外分组干预分别观察经NaHS、Baf(自噬抑制剂)以及NaHS+Baf同时处理后对高糖诱导的心肌细胞活性的影响。细胞分组干预如下：Control组、HG组、HG+NaHS组、Control+ NaHS组、HG+ NaHS+B af组、control +Baf组。3.心肌细胞活力及损伤程度测定(1)采用Counting Kit-8 (CCK-8)法检测心肌细胞活力。计算不同刺激条件下心肌细胞存活率(细胞存活率是用存活细胞与对照组相比的百分比计算)。(2)用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测试剂盒检测不同刺激条件下细胞培养上清中LDH水平可评价细胞损伤和细胞毒性的程度。4.心肌细胞凋亡测定(1)用Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态。(2)通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定Caspase-3活性。5. Western blot检测收集各组细胞并提取细胞蛋白,利用Western blot技术检测Bax、Bcl-2、LC3、 Beclin-1, p62和β-actin的蛋白表达水平。6.统计学分析数值变量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,多组间差异显着性比较应用One-Way ANOVA方差分析法,组间两两比较采用LSD,所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析,以p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.高糖刺激降低AC16心肌细胞活性CCK-8检测结果显示,与正常对照组相比,在经33mM和44mM的高浓度葡萄糖刺激24 h后AC16心肌细胞显着降低了细胞生存能力(p<0.05),而低浓度的葡萄糖(11 mM和22mM)刺激对细胞生存能力没有影响(p>0.05)。同时发现,与对照组相比,经22mM、33mM和44mM的高浓度葡萄糖刺激后,细胞培养上清液中的LDH水平显着增加(p<0.05)。2.高糖刺激可诱导AC16心肌细胞凋亡Hoechst 33258染色检测结果显示,与正常对照组和低浓度葡萄糖组相比,33mM和44mM的高糖刺激24小时后,AC16心肌细胞可明显地表现出核碎裂和核固缩现象。与此同时还发现,与对照组相比,高糖浓度在22、33和44mM时,可显着增加Caspase-3的活性(p<0.05)。此外,Western blot结果显示,在33和44mM高糖刺激AC16心肌细胞后,较对照组可显着上调Bax蛋白表达(p<0.01)和下调Bcl-2蛋白的表达(p<0.01)。3.高糖刺激抑制AC16心肌细胞自噬Western Blot检测结果显示,与正常对照组比较,高糖(22mM,33mM和44mM)刺激AC16心肌细胞24h后可成浓度依赖性降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平(p<0.05),而P62蛋白水平被明显上调(p<0.05)。上述差异在33mM和44mM的高糖组更加具有显着性(p<0.01)。4.硫氢化钠(NaHS)预处理可减轻高糖引起的心肌细胞损伤在用33mM的高糖刺激AC16心肌细胞24小时前,分别用2001μM和400μM的NaHS预处理30分钟,测定细胞存活和凋亡。CCK-8法检测结果表明,NaHS (200和400μM)预处理后明显减弱了HG诱导的细胞活力下降(p<0.05)。另外,Hoechst33258染色结果显示,NaHS预处理后较单纯HG组改善了AC16心肌细胞的核固缩和核碎裂现象。NaHS呈浓度依赖性的逆转了HG诱导的Caspase-3活性和Bax蛋白水平上调以及Bcl-2蛋白水平下调,上述结果在400μM的NaHS干预组较HG组均具有显着性差异(p<0.05)。5. NaHS可逆转高糖刺激对心肌细胞自噬的抑制作用Western Blot检测显示,HG (33 mM)诱导后下调的Beclin-1和]LC3-Ⅱ/Ⅰ水平在分别经200μM和400μM的NaHS预处理后被明显的逆转,其中NaHS(400μM)干预组较HG组具有显着性差异(p<0.05)。同时,NaHS还呈浓度依赖性的减少AC16心肌细胞中HG诱导的p62蛋白水平的增加,上述差异在NaHS (200μM)干预组(p<0.05)和NaHS (400μM)干预组(p<0.01)均具有显着性。6.抑制自噬减弱了NaHS对高糖诱导的心肌细胞毒性的保护作用为进一步评价自噬对于H2S在心肌细胞保护中的作用,AC16细胞在HG和NaHS处理的前提下同时予以自噬抑制剂Bafilomycin A1 (Baf)预处理30分钟。CCK-8检测结果显示,HG+ NaHS+Baf组较HG+NaHS相比,AC16心肌细胞的生存能力显着降低(p<0.05)；Hoechst 33258染色结果显示,NaHS预处理后挽救的HG刺激引起的细胞形态学改变被Baf干预后抵消。同时,HG+ NaHS+Baf组与HG+NaHS相比,Bax蛋白水平明显升高(p<0.05),Caspase-3活性显着升高(p<0.01),而Bcl-2蛋白水平显着下调(p<0.01),上述差异均具有显着性。研究结论1.高糖刺激可诱导AC16心肌细胞的损伤；2.心肌细胞自噬水平的降低与凋亡的增加参与了高糖诱导的心肌损伤；3.外源性H2S可减轻高糖引起的心肌细胞损伤,逆转抑制的心肌细胞自噬；4.自噬抑制剂Bafilomycin A1抵消了外源性H2S介导的HG刺激对心肌细胞损伤的保护作用。
杨满根[7]2014年在《气候变化和土地利用变化背景下淮河流域中上游径流变化研究》文中研究指明气候变化,尤其是降水变化,直接改变了陆地水循环的强度,造成区域水文情势的改变。持续性暴雨过程是流域主要致洪暴雨过程,持续性过程降水的极值更容易造成流域的特大洪涝。另一方面,人类活动,特别是以城市化和农用地缩减为代表的土地利用/覆被变化,直接影响了流域暴雨产流过程。极端降水事件造成的洪涝及其他次生灾害更直接、更严重地影响自然生态系统和社会经济系统。在全球大多数流域,气候变化和土地利用/覆被变化的趋势将在整个21世纪继续发展。因此,研究极端过程降水对气候变化的响应,以及极端过程降水变化对流域径流和洪水的影响,并进一步研究气候变化和土地利用/覆被变化共同作用下流域径流和洪水的响应,对于深入了解流域洪涝发生机制和变化规律、制定流域气候变化适应对策等有重要意义。淮河流域地处中国东部南北气候过渡带,气候复杂,汛期降雨多以暴雨形式出现。受气候和地理条件的影响,淮河流域暴雨的范围广、强度大,大暴雨与特大暴雨在全流域都可能发生。淮河流域也是我国气候变化导致年径流量变化最大的地区之观测和预估的研究都表明,淮河流域汛期极端降水呈显着增加趋势。淮河流域汛期极端降水的显着增加可能与梅雨导致的持续性过程降水的增加有关。人类活动的影响导致淮河流域行蓄洪区面积减小、斑块破碎,泄洪、蓄洪能力减弱；城市面积的扩张,湿地、水体等面积的减少,对流域地表水文过程,特别是极端径流过程产生了重要影响。总之,不合理的人类活动不仅直接改变了地表水文过程,更降低了淮河防洪减灾工程体系的功效,直接加剧了洪涝灾害。淮河流域日益加剧的人类活动已经深刻地影响了地表水文过程。因此,有必要研究人类活动对淮河流域地表水文过程的影响以及人类活动影响下气候变化对淮河径流和极端径流的影响。本论文以蚌埠水文站以上的淮河流域中上游为研究区,运用统计分析、气候模拟和水文模拟等研究方法,从平均气候变化和极端气候变化的角度研究淮河流域气候变化的主要特征以及气候变化和土地利用／覆被变化对淮河流域径流及洪涝的影响,定量分析土地利用／覆被变化和气候变化共同作用下淮河流域径流和极端径流的响应。(1)基于1958-2009年的历史气候观测资料和Series A2排放情景下RegCM3模拟的未来(2071～2100年)气候变化情景,分析了淮河流域历史和未来气候变化的主要特点。就历史气候变化而言,研究时段内,淮河流域年平均气温显着上升,流域中部,特别是涡河和颖河流域中下游以及流域南部下游等区域,升温趋势更明显；春季和秋季气温升高,夏季气温降低,气温的年较差减小。淮河流域年降水量呈不显着的增加趋势,颖河下游和以蚌埠为中心淮河干流附近区域,年降水量的增加趋势更明显,流域南部的大部分区域年降水量呈下降趋势；夏季降水量增加,秋季降水量减少,降水的季节对比更加突出。最低气温的升高,特别是冬季最低气温的升高,导致了淮河流域平均气温的升高。淮河流域连续干旱日数显着减少,最大日降水量显着上升,干季降水频率增大而雨季降水强度增大；夏季和冬季的降水量呈增加趋势,秋季降水量呈下降趋势。夏季降水量的增加主要由降水强度的增强所致,冬季降水量的增加主要由降水频率的增大造成。就未来气候变化而言,在Series A2排放情景下,淮河流域未来(2071～2100年)年平均气温升高,年降水量增加,夏季升温幅度更大,秋季降水量的增幅更大。淮河流域汛期极端过程降水增加,流域下游南部的极端过程降水及其概率都将明显增大。(2)基于1958-2009年的历史气候和河川流量观测资料,计算了多个降水和流量极值指标,并以汛期最大9天降水量作为汛期极端过程降水的指标,以汛期最大9天流量作为汛期极端径流的指标,从降水极值指标和汛期极端过程降水两个方面研究了降水变化对淮河流域径流和极端径流的影响。研究时段内,淮河流域流量和极端流量都呈不显着的上升趋势,汛期流量和极端流量上升趋势更大,汛期流量的增加与枯水期流量的减小导致河川流量的季节对比加大,洪涝、干旱和早涝急转的风险同时增加。来自高百分位的降水或连续过程降水的极值对流量和极端流量的影响较大,流域上游和靠近淮河干流的流域中部的降水异常增大是整个淮河流域旱涝频发的重要原因。周-旬时间尺度的强降水过程是造成淮河流域严重洪涝的直接原因；淮河流域汛期极端过程降水呈不显着的增加趋势,淮河干流上游、涡河上游和流域下游南部边缘,汛期极端过程降水的上升趋势较大；流域南部和流域西部(上游)是汛期极端过程降水的高值区,区域内多山地和丘陵的地形有利于暴雨径流的快速下泄,而流域中下游地形平坦,洪水排泄缓慢,因此汛期极端过程降水的空间特征,极易导致淮河流域中游的“关门淹”。淮河流域汛期极端过程降水的微小增加将导致其概率的大幅度响应,相同的极端过程降水变化,流域北部和流域下游极端过程降水概率的响应更敏感,洪涝风险也更大；流域下游更大的极端过程降水出现的频率更高,也更集中；下游河段的极端流量对极端过程降水变化的响应更敏感,因而淮河中下游流域洪涝风险比上游更大(3)构建了淮河流域SWAT模型,分别以参考期(1961-1990年)和情景期(2071～2100年)的RegCM3气候模拟结果驱动淮河流域SWAT模型,研究了以变暖为主要特征的气候变化对径流和极端径流的影响。构建的SWAT模型比较真实地模拟了淮河流域中上游逐月流量过程,也合理地重现了淮河流域汛期最大9天流量的特征。研究结果表明,极端排放情景下的气候变暖将导致淮河流域年平均流量增加,平均增幅在10%以上,8月和9月流量的增幅更大,河川流量的季节对比增大,汛期洪涝风险增加,旱涝急转的可能性增大。汛期极端流量对气候变化响应的幅度更大,在极端排放情景导致的气候变暖背景下,淮河流域汛期极端流量大幅度增加,干流5个水文站汛期最大9天流量的增幅都在20%以上。极端排放情景导致的气候变暖改变淮河流域汛期极端流量的概率分布,导致汛期极端流量的概率分布更加集中,更大的极端流量出现的频率更高。在极端排放情景导致的气候变暖背景下,淮河流域降水径流之间的关系更加紧密,降水对径流的影响更大,汛期极端过程降水对极端流量的影响也更大,暴雨径流是淮河流域洪涝的直接原因。(4)解译了淮河流域2000年的MrSID遥感影像,获得了2000年淮河流域土地利用/覆被现状图；基于2000年淮河流域土地利用/覆被现状,根据淮河流域土地利用/覆被变化的主要驱动因子：城市扩张、生态退耕和农业结构调整等,构建了以城市用地扩张和农业用地缩减为主要特征的淮河流域中上游土地利用/覆被变化情景；以1958～2009年的历史气候观测资料驱动SWAT模型,研究了淮河流域中上游土地利用/覆被变化对径流和极端径流的影响。结果发现,土地利用/覆被变化导致淮河流域年平均流量小幅度增加,增幅约为2.76‰,城市扩张导致了流量更大幅度的增加；土地利用/覆被变化加剧了河川流量的季节差异,城市扩张更容易导致汛期流量的大幅度增加。土地利用/覆被变化对汛期极端流量的影响更大,土地利用/覆被变化背景下,淮河流域汛期最大9天流量的增幅约为41.22‰；土地利用/覆被变化也导致了汛期极端流量的概率分布特征发生改变,更大的极端流量出现的频率更高,以城市扩张为主的土地利用/覆被变化更可能导致流域特大洪涝,淮河流域中下游特大洪涝风险增大。(5)分析了不同气候情景下土地利用/覆被变化径流响应的差异和不同土地利用/覆被背景下气候变化径流响应的差异,定量研究了气候变化和土地利用/覆被变化共同作用下淮河流域径流的响应。结果表明,气候变化减缓了土地利用/覆被变化对年平均流量增加的影响,但放大了土地利用/覆被变化对极端流量增加的影响；气候变化也放大了土地利用/覆被变化对极端流量概率分布的影响,导致了给定重现期时极端流量重现水平的增大,而且更长重现期的极端流量增幅更大。土地利用/覆被变化减缓了气候变化对年平均流量增加的影响,但放大了气候变化对极端流量增加的影响。气候变化和土地利用/覆被变化的共同作用,导致淮河流域年平均流量和极端流量的增幅进一步加大,淮河流域极端流量概率分布参数发生较大的改变,极端流量更加极端,更大的极端流量出现的频率更高。
吴豫[8]2016年在《cTnI抗体结合心肌细胞膜α-enolase激活PTEN/Akt信号通路致心功能损害》文中认为心血管疾病是临床上常见的威胁人类健康与生命的重要疾病。多种心血管疾病的最终结果均是心力衰竭,心室重构是导致心力衰竭的主要病理生理学机制。近年来尽管随着对心血管疾病早期干预、早期诊断和治疗手段的发展,其发病率呈下降趋势,急性期患者救治率也明显提高,但仍然有相当数量的患者由于存在进行性心室重构,最终发生慢性充血性心力衰竭。深入探讨心肌损伤后心室重构以及进展至心衰的免疫学发病机制,是提高心血管疾病防治效果的必要前提。自身免疫作用是促进持续的心肌免疫炎症、心肌纤维化和病理性重构的重要因素,但其病理生理机制仍不明了。心肌细胞内的蛋白成分在胚胎发育阶段很少与免疫系统接触,常被称为“遮蔽性抗原”,如心肌肌球蛋白、心肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白等。心肌细胞出现损伤时,细胞内的这些蛋白释放到血液循环中,可能刺激机体免疫系统产生抗心肌抗体。我们及其他研究者发现,多种心脏疾病患者的外周血中均存在心肌肌钙蛋白I自身抗体(Cardiac Troponin I autoantibody,c Tn IAAb)。现有研究结果显示,c Tn IAAb除了可能对临床心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I,c Tn I)的检测产生严重负性干扰、影响患者病情判断之外,还可能引起心功能的持续损伤;c Tn IAAb可能通过与心肌细胞膜上表达的c Tn I结合而引起心脏收缩功能障碍。但是c Tn AAb是引起心肌功能损伤的主要诱因还是仅仅为心肌损伤发生和进展中的标记物?c Tn IAAb如何结合至心肌细胞膜、通过何种机制引起心脏功能损伤仍不清楚;c Tn IAAb与临床疾病进展及患者预后的关系仍需要进一步的研究探索。2012年我们在121名急性心肌梗死(Acute myocardiac,AMI)患者中研究c Tn IAAb发病率及对当时各大c Tn I检测系统的负性干扰时,观察到c Tn IAAb阳性的AMI患者预后更差的现象,其中1名c Tn IAAb滴度最高的患者因为反复心梗导致心力衰竭并在住院期间死亡。在本课题中,我们在以前研究工作的基础上,继续筛查了131名AMI患者c Tn IAAb,并跟踪评价了c Tn IAAb与AMI患者左室重构的关系;严格选择了跟踪1年左右之后,出现心室重构(左心室收缩末期容积增加大于15%)的c Tn IAAb阳性AMI患者,用大肠杆菌表达的重组c Tn I全长蛋白耦联CNBr-activated Sepharose4B亲和层析柱,从患者血清中亲和层析获得了最可能导致患者心功能损伤的人c Tn IAAb,并制备了3株c Tn I单克隆抗体(c Tn Im Ab N1、c Tn Im Ab N2、c Tn Im Ab N3),以c Tn Tp Ab、c Tn Tm Ab和Ig G为对照,探索研究c Tn IAAb与心肌细胞膜直接接触引起心脏功能障碍的致病机制。本研究分为六个部分:第一部分研究目标为跟踪评价AMI患者中c Tn IAAb和左室重构之间的关系,并获取发生左室重构的c Tn IAAb阳性AMI患者血清,以期得到最可能导致AMI患者心脏左室重构的c Tn IAAb,为后续实验研究c Tn IAAb的功能奠定基础。在本研究中有131名AMI患者纳入研究。患者血清样本全部采用间接酶联免疫吸附实验检测c Tn IAAb,患者在入院和出院1年左右检测超声心动图评估左室重构。本部分研究结果显示:131名AMI患者中c Tn IAAb阳性率为17.56%(23/131)。131名AMI患者中有90人[19(c Tn IAAb阳性)VS 79(c Tn IAAb阴性))跟踪到了心脏超声波数据,且19名AMI患者发生了左室重构。经过两分类Logistic回归分析,有2个变量为AMI患者左室重构的潜在危险因素,分别是BNP峰值(OR:1.001,95%CI:1.000-1.002,p:0.028)、c Tn IAAb(OR:3.552,95%CI:1.148-10.989,p:0.028)。19名发生了左室重构的AMI患者中有10名c Tn IAAb阳性和9名c Tn IAAb阴性。这10名发生了左室重构的c Tn IAAb阳性患者血清,可供后续研究使用。第二部分研究目标为从第一部分研究中获得的c Tn IAAb阳性AMI患者血清中纯化出c Tn IAAb,并证实其可与c Tn I特异性结合。在本部分实验中我们首次报道:从c Tn IAAb阳性AMI患者中获得了约36ml患者血清,并成功地纯化出2.24mg(0.8ml,2.8mg/ml)c Tn IAAb。采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分离该纯化蛋白的条带主要在20KD和50KD附近,与免疫球蛋白相吻合;采用间接免疫荧光、间接免疫组化和Western Blotting技术证实,纯化的c Tn IAAb可以特异性识别人、大鼠、小鼠心肌组织中c Tn I,还可与大鼠乳鼠心肌细胞膜的某个蛋白相结合。由于本部分研究获得的c Tn IAAb是从10名c Tn IAAb阳性且发生左室重构的AMI患者血清中提取的,结合文献报道c Tn IAAb与AMI预后差和心功能障碍有关,我们推测纯化的c Tn IAAb也与这些患者LEDV明显增加有关,是具有致病理作用的。但是这需要更明确的实验数据加以证实。第叁部分研究目标为采用体外实验的策略,模拟c Tn IAA与心肌细胞直接接触的微环境,重点研究纯化的人c Tn IAAb与原代SD大鼠乳鼠心肌细胞共培养后,心肌细胞出现肥大、凋亡和自噬状态的变化,以验证我们的科学假设。本部分研究结果显示:将c Tn IAAb与心肌细胞共培养12h后,出现了自噬相关基因Atg5和Beclin-1 m RNA表达显着上调,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达亦增高,而在24h后这些基因和蛋白的表达都显着下调。心肌细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达则在与c Tn IAAb共培养24h后开始出现变化,48h则更为明显;随共培养时间增加促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达则逐渐减少。整个过程中,心肌细胞出现自噬和凋亡此消彼长的平衡关系;同批实验、相同剂量的c Tn Tp Ab对照和人Ig G对照则无这些变化。但是在本部分实验中并没有观察到c Tn IAAb与原代大鼠乳鼠心肌细胞共孵育后致使心肌细胞出现肥大改变。从这些实验结果得到提示:加入c Tn IAAb对于培养的原代心肌细胞是一种有害的刺激因素,心肌细胞首先表现出与自噬激活相关的基因m RNA和这些基因编码的蛋白质表达上调,自噬激活进行自我保护;当有害刺激因素持续存在的情况下,自噬的激活逐渐减弱,细胞的凋亡开始增加,但是并未出现代偿性心肌细胞肥大或肥大的趋势。完成本部分研究后,我们获得了一部分的实验结果,但是又有不少未解的问题浮现出来。首先,假设c Tn IAAb与心肌细胞膜表达的某个蛋白结合,该蛋白是什么?是c Tn I吗?其次,c Tn IAAb引起心肌细胞自噬和凋亡激活的主要抗原位点是什么?这些均成为我们下一步要研究的重点。第四部分研究目标为克服从患者血清中获得的人c Tn IAAb量有限的困难,选择一株能替代c Tn IAAb的c Tn Im Ab完成后续研究。明确实验室自制的3株c Tn Im Ab(c Tn Im Ab N1,c Tn Im Ab N2,c Tn Im Ab N3)所针对c Tn I的抗原位点位于何部位,其针对的抗原位点是否为人c Tn IAAb所针对的主要c Tn I抗原位点之一,能否与心肌细胞膜呈现结合,以及结合的细胞膜靶抗原是什么。本部分研究结果显示:采用抗原位点竞争结合的方法,发现c Tn Im Ab N1可以与c Tn IAAb竞争结合BCG823和原代乳鼠心肌细胞膜,致使c Tn IAAb与心肌细胞膜的结合率显着下降,并首次证实c Tn IAAb针对的抗原位点主要为c Tn I N端a.a.r.26-49,是c Tn IAAb针对的抗原位点中最主要的、且比例高的之一;采用c Tn Im Ab N1耦联的亲和层析柱纯化出异常表达在BCG823细胞中与之结合的蛋白分子,并通过飞行质谱技术、免疫共沉淀和Western Blotting技术等,首次明确证实该蛋白分子为α-enolase(ENO1),而不是c Tn I,且c Tn Im Ab N1可以与天然状态的α-enolase发生特异性结合。在下一部分实验中我们将采用c Tn Im Ab N1替代c Tn IAAb,明确c Tn Im Ab N1与原代乳鼠心肌细胞膜表达的ENO1结合后,心肌细胞发生了哪些生物学性状改变?本研究使用c Tn IAAb获得的研究结果能否在使用c Tn Im Ab N1后得以重现?心肌细胞发生的生物学性状改变是否在抑制ENO1表达后得以恢复?等等这些科学问题都需要更多的实验室证据给予证实。第五部分研究目标为明确c Tn Im Ab N1能否重现c Tn IAAb致心肌细胞病理变化作用?既然c Tn Im Ab可以识别心肌细胞膜表达的ENO1,c Tn Im Ab与心肌细胞共培养后,ENO1的表达发生了什么变化?这些变化是否与心肌细胞的病理改变相关?本部分研究结果显示:我们成功地将c Tn Im Ab N1替代了从AMI患者血清中提取的c Tn IAAb,在原代大鼠乳鼠心肌细胞诱导出浓度依赖的和时间依赖的凋亡应答。同时,在c Tn Im Ab N1刺激心肌细胞的过程中,ENO1的表达明显升高;采用ENO1-si-RNA抑制ENO1表达后,可以抵抗c Tn Im Ab N1刺激诱导的心肌细胞凋亡;而等浓度的小鼠Ig G对照、c Tn Tm Ab 4T19抗体对照及Negative-si RNA对照均无此现象。本部分研究结果提示我们,AMI血清中的c Tn IAAb与心肌细胞作用所引起的心肌细胞凋亡损害,不仅与c Tn IAAb中与心肌细胞膜结合的抗原位点是否占优势地位有关,也与c Tn IAAb在患者循环中的浓度和持续的时间有关。这些实验现象和结果也许可以解释,为什么在动物模型研究中c Tn IAAb对心脏功能损害作用的因果关系相对比较明确,而在临床研究中,c Tn IAAb在扩张性心肌病、缺血性心肌病等心脏疾病患者预后间的关系中却一直存在争议。既然c Tn Im Ab N1在体外实验中成功地重现了c Tn IAAb在原代乳鼠心肌细胞中诱导凋亡的生物学效应,并明确该作用是通过上调ENO1的表达实现的,那么,c Tn Im Ab N1可否在实验动物中诱导出心脏的损害?该损害是表现为心肌的炎性浸润?还是与体外实验相似的以心肌细胞凋亡为主的病理改变?这些病理改变与ENO1的表达有何关系?什么信号通路介导了这些病理变化?等等这些科学问题,均需要进一步的实验室证据加以证实。第六部分研究目标为使用c Tn Im Ab N1替代c Tn IAAb,尝试在动物体内引起心脏功能障碍和心肌组织的病理改变,并研究其相关的信号通路,旨在能够较确切地阐明c Tn IAAb或c Tn Im Ab N1致心肌损伤的作用和机制,以解释临床中所发现的部分c Tn IAAb阳性患者出现不良临床转归的可能原因,希望本部分的研究结果能丰富自身免疫性心脏疾病免疫病理损伤的发生机制,有助于寻找预防和治疗AMI后心室重构的新靶标和新策略。本部分结果显示:采用c Tn Im Ab N1可成功诱导Balb/c小鼠心脏收缩功能障碍,HE染色、masson染色和Tunel染色结果显示,小鼠心肌组织心肌胶原沉积增加、心外膜钙化斑块形成和心肌细胞凋亡轻度增加,而心脏外形和心肌组织细胞大小未见增加,这些实验结果与第叁部分实验中c Tn IAAb作用的原代乳鼠心肌细胞出现凋亡增加,而未出现心肌细胞肥大的研究结果互相印证;采用CD3、CD8、CD4、CD20、CD68对模型小鼠心肌组织进行免疫组织化学染色,未见这些免疫分子表达,表明注射c Tn Im Ab N1的I组小鼠心脏出现的功能和病理改变主要是代偿性的,而非炎性的;采用Path Scan Akt Signaling Antibody Array蛋白芯片对小鼠心肌组织Akt通路16个主要磷酸化蛋白位点进行筛查,发现注射c Tn Im Ab N1的I组小鼠心脏组织出现了第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)Ser380上调和蛋白激酶B(protein kinases B,Akt)Thr308下调,而既有文献证实PTEN缺失与心肌细胞肥大相关,这与前期心肌细胞肥大阴性的结果相互印证;当用c Tn Im Ab N1与原代心肌细胞共培养后,也出现了同样的信号分子改变,在原代心肌细胞中采用si-RNA沉默心肌细胞内的ENO1后,PTEN-Akt信号通路激活的现象减弱,与前期沉默心肌细胞ENO1后心肌细胞凋亡现象得到缓解相互呼应。总之,通过这六部分的实验结果,我们首次明确证实,c Tn IAAb不仅是AMI患者发生心肌损伤后心室重构的独立危险因素之一,而且从发生左室重构的c Tn IAAb阳性AMI患者血清中纯化得到的c Tn IAAb中,针对c Tn I的N端a.a.r.26-49位的c Tn Im Ab N1是其主要组成部分。该c Tn Im Ab N1可以通过与心肌细胞膜的α-enolase发生交叉反应而结合在心肌细胞膜上,引起心肌细胞α-enolase表达升高、PTEN-Akt信号通路激活,PTEN Ser380磷酸化增强,Akt Thr308位磷酸化减弱,最后引起的心肌细胞的改变并不是细胞肥大,而是导致了心肌细胞出现时间依赖性和浓度依赖性的凋亡增加;当采用si-RNA技术沉默心肌细胞的α-enolase,可以纠正PTEN-Akt信号通路激活和改善心肌细胞凋亡现象。接受c Tn Im Ab N1(a.a.r.26-49)注射的Balb/c小鼠模型会发生心肌组织α-enolase表达增加、非炎性代偿性胶原沉积增加、心外膜钙化斑块形成和心脏收缩功能障碍。本研究结果是对自身免疫性心脏病发病机理的重要补充,同时也给临床干预治疗自身免疫性心脏病和改善心肌损伤后自身免疫损伤提供了思路。本课题研究所采用的患者血清、组织均为临床工作的废弃物,得到长海医院医学伦理委员会和解放军第94医院医学伦理委员会研究批准;所采用的实验动物得到第二军医大
柏帅蛟[9]2016年在《基于计划行为理论视角的变革支持行为研究》文中提出在新的世纪里,组织的环境变得日益动态和复杂,新技术的层出不穷和互联网+的流行更是强化了这种趋势。由此给企业的生存和发展带来日益严峻的挑战:组织变革不再是变与不变的选择,而是一种必然;留给企业的仅仅是什么时候变革和如何变革的抉择。因此,企业如何成功地推行有计划的组织变革成为了企业管理者和研究者关注的重点之一。众多的实践经验和研究结论表明,组织变革并不能一蹴而就,甚至有很多经过周密计划的组织变革也往往以失败告终。人们慢慢发现,宏观层面的变革计划并不是决定组织变革成败的唯一因素,甚至不是最重要的因素;事实上,对于计划性组织变革而言,变革参与者在组织变革过程中的反应(包括态度和行为)对组织变革的成败具有重要的决定性作用。在此背景下,组织变革参与者的反应成为了组织变革研究的重点之一,其中尤其重要的是变革参与者的变革支持行为。但是,从研究现状来看,现有关于变革支持行为的研究相对较少,更是缺少变革领导者是否以及如何影响到变革参与者的变革支持行为的研究。从理论发展来看,虽然计划行为理论为解释人的行为决策过程提供了一个一般性理论框架,但是使用计划行为理论来解释变革情境下变革参与者的行为还需要突破一些局限性。比如,原来的计划行为理论框架主要解释了个体行为的心理机制,将态度、规范和行为控制性等视为外生的变量。但是,从组织变革管理的角度来看,理解环境因素如何影响到员工的这些信念具有重要的理论和实践价值。因此,有必要进一步讨论那些重要的环境因素对变革参与者内在心理过程的影响。比如,变革领导者对组织变革具有极其重要的意义和作用,通过深入研究变革领导者所采取的变革行为对变革参与者行为的影响,能够进一步拓展计划行为理论及其在组织变革情境下的研究。基于上述现实和理论的背景,本文采取变革管理者的视角,以计划性组织变革过程中变革参与者的变革支持行为作为研究的因变量,以变革领导者的变革动员行为作为研究的自变量,以中国军工企业的军民融合战略变革作为研究情境,希望回答叁个研究问题:一是组织变革过程中变革参与者的变革支持行为是如何形成的;二是变革领导者在变革支持行为的形成过程中起着什么样的作用;叁是变革参与者对变革领导者的信任对上述变量之间的有什么影响。论文的主体部分通过一项前导性案例研究和一项基于问卷调查的实证研究来回答这些研究问题。前导性案例研究有叁个主要目的。一是对研究情境进行了较为详细的描述,交待研究的背景信息;二是在实际的组织变革情境中初步探索了变革领导者的变革动员行为和变革参与者的变革支持行为之间的关系,为后文的实证研究模型提供了实地观察的初步证据;叁是对后续的实证测量提供重要的第一手资料,使后续的测量情境化和具体化。在实证研究部分,基于计划行为理论、社会学习理论和社会交换理论的基本思想,结合相关领域的文献,构建了一个从领导动员行为到变革参与者的变革支持行为的过程模型。该模型解释了变革领导者的变革动员行为影响变革参与者的变革支持行为的过程,以及变革参与者对变革领导者的信任对这一过程的影响。用于假设检验的数据来自实施“军民融合”战略变革的16家军工企业(科研院所),共计455份有效调查问卷。使用Mplus环境下的结构方程模型分析技术和SPSS环境下的描述性分析和多元线性回归分析对数据进行分析。结果表明:变革参与者的变革情感承诺(行为意向)对其变革支持行为具有显着的解释能力;变革参与者的变革前景预期(积极态度)、变革氛围感知(规范)和变革效能感知(控制性)对其变革情感承诺具有显着的正向影响;变革领导者的变革动员行为能够增强变革参与者对组织变革所形成的上述叁方面的信念,即变革前景预期、变革氛围感知和变革效能感知;变革参与者对变革领导者的信任能够正向调节变革领导者的变革动员行为到变革参与者的变革支持行为的链式路径,使得在高信任水平下,领导动员行为能够对变革参与者的变革支持行为产生更强的积极影响;且这种调节效应具体地表现在对构成上述链式路径的七条子路径的调节上。本研究的结果为理解计划性组织变革过程中变革参与者的变革支持行为如何形成,变革领导者如何影响到变革参与者的变革支持行为,以及如何强化变革领导者对变革参与者的变革支持行为的影响提供了实证证据。这些结果一方面拓展了人们对变革参与者的变革支持行为的理解,另一方面对计划行为理论的进一步发展做出了一定的探索。相关的结果能够为变革管理者更好地制定组织变革策略提供一定的理论指导。
田夏秋[10]2016年在《通过增加骨髓间充质干细胞的定向归巢和存活提高其治疗急性心梗疗效的实验研究》文中研究表明口服强化阿托伐他汀-联合阿托伐他汀预处理提高骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死疗效的实验研究目的：骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是进行急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后心肌修复的一种有效的干细胞来源,但疗效有限,原因之一是归巢并存活于梗死心肌的MSCs数量较少。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)与其特异性受体趋化因子受体4 (CXCchemokine receptor 4, CXCR4)构成的SDF-1/CXCR4轴在MSCs归巢、定植到损伤部位参与修复的过程中发挥重要作用。我们的前期研究表明,口服强化阿托伐他汀(atorvastatin, ATV)能改善梗死微环境促进MSCs存活,而且ATV预处理能增加MSCs表面CXCR4的表达,提高MSCs的归巢能力。本研究旨在探讨口服强化ATV联合移植ATV预处理的MSCs (ATV-MSCs)是否可以进一步改善心梗后心功能,并明确其作用是否是通过SDF-1/CXCR4轴发挥的。方法：第一部分将6-8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(Sham)、心梗对照组(AMI)、 AMI后口服强化ATV组,分别于AMI后1天、1周和2周取材,通过免疫组化、RT-PCR和ELISA测定梗死周边心肌组织SDF-1的动态变化,选择SDF-1表达高峰作为第二部分移植MSCs或ATV-MSCs的时间点。第二部分将大鼠随机分为Sham组,AMI对照组,移植MSCs组,口服强化ATV组,移植ATV预处理的MSCs (ATV-MSCs)组,口服强化ATV联合移植MSCs (ATV+MSCs)组,同时口服强化ATV联合移植ATV预处理的MSCs (ATV+ATV-MSCs)组,ATV+ATV-MSCs+AMD3100 (SDF-1/CXCR4阻滞剂)组。采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周经颈静脉注射CM-Dil标记的MSCs或ATV-MSCs (2×106细胞／只)。梗死后4周通过心脏超声和左心导管检测心功能；通过病理组织学检测归巢至梗死心肌的MSCs、炎症细胞浸润及纤维化,TUNEL法检测凋亡；通过蛋白芯片检测梗死周边心肌组织中促炎和抗炎因子的水平；通过免疫荧光法检测血管新生、内源性c-Kit+干细胞的数量以及MSCs向心肌分化情况。结果：与AMI组相比,口服强化ATV可显着提高SDF-1的mRNA和蛋白表达,在1周时达高峰,选择1周作为MSCs移植时间点。与MSCs组相比,ATV-MSCs或ATV+MSCs组能够显着提高左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)和等容收缩期左室内压力上升的最大速率(dp/dt),显着降低左室舒张末期直径(LVEDd)、左室收缩末期直径(LVESd)和左室舒张压力(LVEDP); ATV+ATV-MSCs组的LVEF和LVFS与ATV-MSCs组相比进一步提高,LVEDP和dp/dt与ATV-MSCs组和ATV+MSCs组相比均有显着改善；而加入AMD3100阻断SDF-1与CXCR4的结合后,ATV+ATV-MSCs对左心收缩和舒张功能的改善作用均被明显抑制。组织学分析显示,与MSCs组相比,ATV-MSCs和ATV+MSCs组的心肌纤维化面积显着减小,炎细胞浸润明显减轻;ATV+ATV-MSCs组炎细胞浸润进一步减少,与ATV-MSCs组相比,纤维化面积显着减小,上述作用可被AMD3100部分阻断。蛋白芯片结果显示,在梗死周边心肌组织中,与AMI组相比,ATV+ATV-MSCs组的炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α均下降最为显著,抑炎因子IL-10水平明显升高。ATV-MSCs和ATV+MSCs组归巢到梗死周边区心肌组织的MSCs数、新生动脉数和毛细血管数均明显高于MSCs组,心肌细胞的凋亡显着少于MSCs组；ATV+ATV-MSCs组的归巢MSCs数和新生毛细血管数与ATV-MSCs和ATV+MSCs组相比进一步提高,心肌细胞凋亡数继续显着减少；上述指标在给予AMD3100后均受到显着抑制。与AMI组相比,移植MSCs组的心肌组织中内源性c-Kit+干细胞数显着增多,ATV+ATV-MSCs组进一步提高了c-Kit+干细胞的数量,但并未显着增加MSCs向心肌细胞的分化。结论：ATV预处理或口服强化ATV均可以增强MSCs向梗死心肌的归巢,二者联合可通过SDF-1/CXCR4轴进一步增加MSCs的归巢和内源性c-Kit+干细胞数量,促进血管新生,抑制心肌细胞凋亡和炎症反应,减少纤维化面积,提高心肌梗死后心功能。口服强化ATV联合移植ATV预处理的MSCs可能成为提高干细胞疗效的一有效方法。球形脂联素降低缺氧无血清诱导骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究目的：骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在恶劣的梗死微环境中的低存活率极大限制了其治疗急性心肌梗死的疗效。脂联素(adiponectin,APN)是一种脂肪细胞分泌的细胞因子,球形脂联素(globular adiponectin, gAPN)是其C端球形结构域,可以抗多种细胞凋亡,并具有干细胞调控特性。脂联素主要通过与细胞表面的脂联素受体1(AdipoR1)或受体2(AdipoR2)结合发挥生物学作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是调控细胞能量代谢的核心分子,在调节细胞凋亡中发挥重要作用。因此我们在体外建立缺氧无血清(hypoxia and serum deprivation, H/SD)模型来模拟心肌梗死后体内缺血缺氧的微环境,探讨脂联素能否减少MSCs的凋亡,并明确发挥作用的受体和下游的信号通路。方法：分离并培养3-4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓MSCs,将第3代细胞随机分为正常对照组、H/SD对照组、不同浓度梯度gAPN组(0.01 μg/mL,0.1 μg/mL、 1μg/mL)、通过小干扰RAN (small interfering RNA, siRNA)干扰AdipoR1组、干扰AdipoR2组、干扰AdipoRl+AdipoR2组、AMPK通路抑制剂Compound C组(10μM)。在荧光显微镜下观察Hocchst33342染色阳性细胞,Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞的凋亡比例,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性；荧光探针JC-1染色检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)的变化,并进一步采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平及AMPK及其磷酸化蛋白的水平。结果：gAPN剂量依赖性的降低H/SD诱导的MSCs凋亡,表现为核皱缩和变性(Hocchst33342染色阳性)细胞减少,早期凋亡(Annexin V+/PI-)细胞和晚期凋亡(Annexin V+/PI+)细胞均呈剂量依赖性减少,Caspase-3活性降低,在1μg/mL浓度时最为明显。干扰AdipoR1的表达可明显抑制gAPN的抗凋亡作用,而干扰AdipoR2的表达对gAPN的抗凋亡作用无显着影响。gAPN各组AMPK的磷酸化水平升高,加入Compound C抑制AMPK的磷酸化后,gAPN的抗凋亡作用被显着抑制。此外,gAPN升高抗凋亡蛋白Bcl-2、抑制促凋亡蛋白Bax的表达,抑制了线粒体膜电位的丧失,而干扰AdipoR1表达或加入Compound C后gAPN的上述作用被部分抑制。结论：gAPN可以剂量依赖性抑制H/SD培养条件诱导的MSCs凋亡,其机制可能是通过与AdipoR1结合后激活AMPK通路,进而抑制线粒体途径的凋亡。
参考文献：
[1]. 葛根素通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬发挥对心肌肥厚的保护作用[D]. 刘北. 南方医科大学. 2016
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[4]. TGF-β1/Smad信号通路在运动性心肌纤维化发生中的作用研究[D]. 王世强. 上海体育学院. 2016
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[7]. 气候变化和土地利用变化背景下淮河流域中上游径流变化研究[D]. 杨满根. 南京大学. 2014
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[9]. 基于计划行为理论视角的变革支持行为研究[D]. 柏帅蛟. 电子科技大学. 2016
[10]. 通过增加骨髓间充质干细胞的定向归巢和存活提高其治疗急性心梗疗效的实验研究[D]. 田夏秋. 北京协和医学院. 2016
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