车东升[1]2006年在《猪肌生成抑制素单克隆抗体制备及组织分布研究》文中进行了进一步梳理本研究以猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)为研究对象,在E.coil大量培养工程菌MSTN-PGEX-4T-1-BL21,经IPTG诱导获得融合蛋白。将菌体超声破碎,并进行GST亲和层析分离纯化重组MSTN蛋白,得到的重组肌生成抑制素GST-MSTN蛋白,利用凝血酶裂解切除GST端,得到较纯的MSTN-C端功能区蛋白。经12%SDS-PAGE分析表明,GST-MSTN融合蛋白在38kD有明显的蛋白质表达条带, MSTN-C端蛋白在12kD有明显的条带,且两者分子量均与预期的理论值相符。以分子量较大的GST-MSTN融合蛋白作为免疫抗原免疫Balb/C小鼠,以MSTN-C端蛋白为检测抗原制备MSTN单克隆抗体。成功获得3株MSTN单克隆抗体,其中2株IgG (1G8和10H1),1株IgM(3D3)。纯化腹水经效价测定达到1:32000,亲和力分析结果表明3D3的亲和常数为3.23×10~7 L/mol,1G8的亲和常数为1.73×10~8 L/mol,10H1的亲和常数为2.62×10~8 L/mol。3株单抗的相对亲和力依次为:10H1>1G8>3D3,且具有不同的抗原识别位点。采用获得的MSTN单抗,运用Western blotting和免疫组化方法对猪的MSTN组织学定位进行了研究。Western blotting结果表明:在心脏;肺脏、肝脏、骨骼肌、脂肪、胰脏、肾脏均有MSTN分布,脂肪、肺脏检测信号较弱。免疫组化结果显示:肺脏、肝脏、小脑、心脏、骨骼肌、脾脏、肾脏及结肠组织均有不同程度的阳性细胞,主要在存在肌细胞的组织中分布。在肝脏中沿肝被皮向肝内组织染色逐渐减弱。
逄大欣[2]2006年在《猪肌生成抑制素作用靶位点的研究》文中提出肌生成抑制素(MSTN)是近几年来发现的骨骼肌生长的负调控因子,其活性的丧失,会引起动物肌肉的过度发育,肌纤维直径变大或肌纤维数增加,表现为动物的“双肌”性状。目前在该基因的结构、染色体定位及表达分析等方面已有较深入的了解,但对于MSTN的组织定位文献研究报告不一致,而且其作用机制如受体的结构、分布及信号转导等方面仍知之甚少。因此,本研究构建了猪MSTNC端功能区原核表达载体,表达并纯化了猪MSTN融合蛋白;在体外对重组蛋白质的生物学活性进行了鉴定;成功制备MSTN的多抗血清,用Western blotting及免疫组织化学法检测猪的九种组织器官细胞的MSTN分布情况。应用GST-Trap和液相色谱质谱联用技术从猪心肌、骨骼肌组织中筛选了猪MSTN的膜受体。
车东升, 张春, 李占军, 李莉, 逄大欣[3]2013年在《猪肌生成抑制素单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究表明用纯化的重组GST-MSTN蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗猪肌生成抑制素单克隆抗体。以纯化的MSTNC端成熟蛋白为检测抗原,采用ELISA的方法检测免疫小鼠血清抗体效价、杂交瘤细胞培养上清效价、纯化腹水效价、免疫球蛋白的类型和亚类,抗体相加指数。用Western blot检测抗体的特异性。结果表明:3D3、1G8和10H1 3株单克隆抗体细胞培养上清效价分别为1∶400,1∶800,1∶800,纯化腹水效价分别为1∶16 000,1∶32 000,1∶32 000。Western blot分析显示,3株单抗均能与重组MSTN蛋白特异结合。免疫球蛋白亚类鉴定显示杂交瘤细胞所分泌的抗体中3D3属于IgM亚类,1G8和10H1属于IgG2a亚类。抗体相加试验结果表明3D3、1G8与10H1有不同的抗原识别位点。
金定恩[4]2008年在《小梅山猪MSTN叁种重组蛋白的制备及其免疫对小鼠生长的影响》文中研究指明1研究背景与目的肌肉生成抑制素基因(myostatin,MSTN),又称生长分化因子-8(GDF-8),是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一,是近几年发现的骨骼肌生长负调控因子,其活性的丧失,可引起动物肌肉的过度发育,肌纤维直径变大或肌纤维数增加,表现为动物的“双肌”性状。MSTN相关研究的突破将对于提高猪、鸡、牛等肉用畜禽的生产性能以及临床治疗肌肉消耗和衰竭等症具有特别重要的意义。本研究采用原核表达方法制备了基于猪MSTN活性区的叁种融合蛋白,用于免疫小鼠,制备其抗血清,比较分析叁种候选蛋白免疫小鼠对生长的影响,旨在寻找促进机体肌肉生长的蛋白疫苗,探讨运用主动免疫方法改善畜禽肌肉质量的可行性。2方法与结果应用PCR方法扩增小梅山猪MSTN编码成熟区蛋白基因,借助Linker将通用T细胞表位TT、PADRE连接到MSTN成熟区N末端,构建编码MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN的克隆和表达载体,并在BL21工程菌实现叁种候选蛋白的表达、提取与鉴定;利用提取的MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN蛋白分别免疫小鼠,ELISA法检测免疫后各组血清中抗MSTN抗体滴度,比较各组小鼠体重、料肉比、胴体、胸大肌、股四头肌、股二头肌、腓肠肌和腹腔游离脂肪等变化情况。最终结果显示:本研究正确的构建了MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN表达载体,完成了融合蛋白的表达及鉴定,实现了叁种候选蛋白的大量制备;叁种候选蛋白免疫小鼠后均可诱导出MSTN特异性中和抗体,其中TT-MSTN、PD-MSTN效果较好(滴度＞5×10~3);叁种候选蛋白疫苗对小鼠肌肉组织各部分生长均有一定积极影响,并且TT-MSTN效果优于其他候选蛋白疫苗;与MSTN、PD-MSTN相比,TT-MSTN候选疫苗在促进小鼠生长和降低料肉比等方面有一定改善作用,但效果不显着。3结论成功构建了MSTN叁种重组蛋白疫苗,系统地比较了叁种疫苗间的免疫效果,确证Th细胞辅助表位TT_(830-844)和PDARE在增强MSTN自体疫苗的免疫原性方面有一定的作用,同时TT-MSTN蛋白作为未来候选疫苗在促进机体肌肉生长和提高机体生长性能方面有一定表较优势。这些研究为进一步研究肌肉生长发育机制、开发促生长的生物新技术奠定理论依据并提供了技术支撑。
张桐嘉[5]2014年在《旋毛虫与肝癌H7402相关抗原蛋白的单克隆抗体制备及应用》文中指出旋毛虫（Trichinella speralis）是一种毛形科毛形属寄生虫，对人畜皆有感染能力。根据现有的研究资料表明，旋毛虫对部分肿瘤细胞具有一定的抑制和干扰作用，能够降低肿瘤细胞的增殖能力或诱导肿瘤细胞的凋亡。肝癌被认定为世界健康一大杀手，发病率及死亡率居高不下，其危险性不容小觑。但是，肝癌疫苗及传统抗肝癌药物并不能良好的发挥作用，因此，探寻高效、低毒、副作用少的生物制剂成为人们对抗肝癌的迫切需求。现已有研究证明旋毛虫虫体蛋白与肝癌H7402细胞间存在交叉抗原；本实验室利用免疫筛选得到的旋毛虫与肝癌H7402相关的CK-1基因制备了单克隆抗体，其在体内和体外实验中均发现能够抑制肝癌H7402细胞的生长。由此可见，旋毛虫体内可能含有或分泌抗癌物质。故而，本实验拟通过表达文库筛选法寻找其他旋毛虫与肝癌H7402细胞之间的相关抗原，并利用制备的单克隆抗体来观测其抑制肿瘤细胞生长的效果，从而为日后探索肝癌的生物治疗方法和旋毛虫抑制肿瘤的效果提供信息。本实验在已建立的旋毛虫cDNA表达文库的基础上，利用免疫筛选的方法获得了与肝癌H7402细胞具有免疫反应的6种相关抗原基因，分别为半胱氨酸线性蛋白（Tsp_06120）、高尔基体联合植物相关致病蛋白（Tsp_07885）、硒蛋白T（Tsp_03801）、DNA剪切修复蛋白ERCC-1（Tsp_01641）、脱氧核苷酸转移酶作用蛋白（Tsp_01476）和核糖氧化还原蛋白（Tsp_04425）。通过生物学分析后，后续试验选择硒蛋白T基因进行原核表达和纯化。在硒蛋白T单克隆抗体的制备中，我们共得到3株单克隆细胞记为4F1，4H2和4D4。经抗体亚类鉴定、核型分析和效价检测后，4H2为IgG2b亚类，染色体数目104，腹水效价，大于1×105。随后，用4H2抗体进行了体内和体外的肿瘤抑制实验。结果发现，在体外MTT实验中，当单克隆抗体含量为50μg/100μL时，对肝癌H7402细胞的生长抑制率为26.7%；在动物模型实验中，当单克隆抗体含量为100μg/100μL时，对肿瘤的抑制率为80.3%。
刘蓉芳[6]2007年在《绵羊Myostatin基因cDNA全序列的克隆及在CHO中的表达》文中进行了进一步梳理肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一,主要分布于动物的肌肉组织中,对骨骼肌等生长发育起着负调控作用。与同一家族的GDF-8、IGF等的调节机制不同,MSTN基因的突变或部分缺失,可导致Myostatin的抑制功能完全丧失,从而引起肌肉细胞的增殖和肌纤维的增大。MSTN基因通常由3个外显子和2个内含子组成,可在不同的组织中表达,但丰度有明显的差异,肌肉中表达量最高,而其它组织也有表达。绵羊MSTN基因的编码序列为1128 bp,编码375个氨基酸。许多研究证明,MSTN基因是影响畜禽骨骼肌生长的重要候选基因,已成为动物育种中选择的主要目标性状之一,对筛选和鉴定影响生长速度的相关基因或数量性状座位(QTL),改善肉质,提高瘦肉率,具有重要的理论意义和应用价值。绵羊MSTN基因的克隆和表达研究为MSTN基因打靶和肌肉发育调控机理奠定了基础。本实验以小尾寒羊和杜泊羊的杂交种羊骨骼肌总RNA为模板,反转录合成cDNA,根据已知的绵羊MSTN基因cDNA序列,设计了5条特异性引物,采用巢式PCR,扩增得到MSTN基因。将MSTN与pMD20-T载体连接,得到重组质粒MSTN-pMD20-T。将重组子转化大肠杆菌DH5α,采用蓝白斑法,筛选得到阳性克隆。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切MSTN-pMD20-T和真核表达载体pcDNA3.1后,将目的片段克隆到pcDNA3.1载体中,得到MSTN-pcDNA3.1。将重组子转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经筛选、PCR、酶切和测序分析。MSTN基因的表达采用脂质体介导法,将重组质粒MSTN-pcDNA3.1转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,转染培养72h后收获细胞。采用PAGE法和分子免疫印迹法,检测了MSTN基因的表达,同时也做了mRNA水平的检测。研究结果表明:(1)克隆得到的MSTN基因全长为1186 bp,其编码序列为1128 bp,编码375个氨基酸,符合预期的结果。(2)与GenBank中报道的羊MSTN基因序列相比较,其同源性为99%,推导相应氨基酸序列的同源性达98%。高度的保守性反映了该基因功能的重要性以及受到了高度的进化限制。(3)在MSTN基因编码序列中,发现在7个不同位点存在单核苷酸突变,引起了5个编码氨基酸的变化。(4)经PAGE检测,电泳凝胶中可见到蛋白表达,表明CHO细胞中有Myostatin蛋白的表达。
鲍淑青[7]2007年在《重组肌肉生长抑制素的制备及主动免疫生长猪的研究》文中提出肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是一种抑制动物骨骼肌生长发育的负调控因子，在肌细胞的形成过程中有着重要的生理功能。本课题通过分子生物学手段获得了猪MSTN全长DNA片段，构建了克隆载体，并在大肠杆菌中融合表达了猪的MSTN蛋白。利用MSTN蛋白作为抗原，注射免疫生长猪，目的是为了阻断其生理效应从而提高动物产肉率，同时为今后开展其他外源基因的原核表达研究提供技术支持。本试验首先根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物，引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基，提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA，用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因，并将其克隆到pMD18-T载体上，测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，克隆到pET-30a中，构建原核表达载体pET-30a-M，将重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因；克隆载体经过DNA序列测定，所得基因与国外报道的完全一致；成功构建原核表达载体pET-30a-M；经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳结果证明产物约48ku，与预期大小相符。对表达条件进行优化，确定最佳表达条件为IPTG 0.4mmol／L，诱导时间为6h。将菌体进行超声破碎、SDS-PAGE检测表明，本研究发现MSTN在大肠杆菌中的表达主要以包涵体的形式存在。采用包涵体纯化的方法对蛋白进行粗提纯，然后利用重组蛋白6个连续的组氨酸，采用金属螯合亲和层析纯化重组蛋白，得到纯化的目的蛋白。利用获得的重组肌肉生长抑制素蛋白主动免疫生长育肥猪，考察重组蛋白对生长猪生长性能和肉用品质的影响。试验选用25±1.5kg健康叁元(DLY)杂交猪27头，按体重相近的原则随机分成3个处理，每个处理3个重复，每个重复3头猪，在试验第1、15、29d分别注射生理盐水和不同剂量的重组蛋白。试验第49天每个重复选1头猪进行屠宰试验。结果表明：与对照组相比，免疫MSTN蛋白高剂量组、低剂量组猪在生产性能改善方面均呈现出明显的阶段性效应：3-4周低剂量组饲料效率提高，饲料转化率高于对照组。5-6周低剂量和高剂量组在平均日增重、饲料转化率都高于对照组。在胴体性状方面，高剂量组比对照组的瘦肉率提高了近3个百分点，而且无论是低剂量组还是高剂量组背膘厚均有所降低，眼肌面积提高。通过对猪肉品质相关指标测定结果的分析可以看出，与对照组相比，免疫组滴水损失减少，剪切力增加，其他指标无明显差异。综上所述，应用大肠杆菌表达的重组蛋白MSTN主动免疫动物后能产生抗体，具有一定的提高肌肉生长的作用，本研究为进一步开展MSTN的研究奠定了基础。
李鹏[8]2012年在《CCNL1和TIMP1基因对人乳腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响》文中研究表明乳腺癌是常见的危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展是一个多因素、多突变积累的过程，其发病的病因尚未清楚。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP1）不仅是基质金属蛋白酶的抑制剂，而且还作为一种抗肿瘤的标记物来影响乳腺癌病人的预后效果。很多学者发现TIMP1参与肿瘤细胞的增殖、凋亡及肿瘤的血管发生，且伴随着预后不良。细胞周期蛋白（CCNL1）是最近被确定为一个新的核蛋白质，属于细胞周期蛋白家族。CCNL1包含了C-端精氨酸和丝氨酸丰富（RS）的结构域，在前mRNA剪接中起到重要的作用。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC），CCNL1原位癌发生中起着关键作用，可作为一个隐匿性晚期肿瘤分期指标。因此，CCNL1被认为头颈部鳞癌候选基因生物标志物。为了研究乳腺癌在发生发展过程中基因表达变化情况，我们随机抽取10个乳腺癌病人的乳腺癌组织和癌旁组织，并通过基因芯片技术对乳腺癌及癌旁组织基因表达进行了差异筛选，通过microarry研究分析，得到303个差异表达基因和112个未知功能基因。对筛选到的33个差异极显着的基因进行了分析及验证。在筛选出的这33个差异表达基因中，我们发现，与细胞增殖有关的CCNL1和TIMP1基因表达明显上调，由此我们推测，CCNL1和TIMP1之间可能会存在某种机制，调控人乳腺癌细胞的增殖，且这两个基因可能存在基因表达上相互影响的关系，为研究这两个基因的功能，我们首先对其进行了原核表达研究，通过RT-PCR技术克隆了CCNL1和TIMP1基因全长，其长度分别为624bp和1581bp，并将CCNL1和TIMP1基因全长连接到原核表达载体pET28a中，成功构建了大肠杆菌表达载体pET28a-TIMP1和pET28a-CCNL1，将鉴定正确的菌种进行表达，并纯化出目的蛋白，经Western blot方法检测到了CCNL1和TIMP1蛋白，其蛋白大小为28.5KD和59.6KD。为今后动物实验奠定了基础。为了进一步研究CCNL1和TIMP1基因对乳腺癌细胞生长的影响及在乳腺癌细胞中CCNL1和TIMP1基因表达之间的关系，我们将能够促进真核基因表达的KOZAK序列分别连接于CCNL1和TIMP1基因的5’端，并将这两个基因分别连接于真核表达载体pcDNA3.1中，成功构建了CCNL1和TIMP1基因全长真核表达质粒（pc-CCNL1-K、pc-CCNL1、pc-TIMP1-K和pc-TIMP1），同时根据CCNL1和TIMP1基因的全长我们构建了RNA干扰质粒，将这个基因的真核表达载体转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，对MBA-MD-231和MCF-7细胞中CCNL1和TIMP1基因的表达进行检测。结果表明，KOZAK序列能够显着提高CCNL1和TIMP1基因在人乳腺癌细胞（MBA-MD-231和MCF-7）中表达。我们对构建的CCNL1和TIMP1基因的干扰质粒进行了筛选，筛选结果表明，CCNL1RNAi-1173和TIMP1RNAi-229在转录水平上干扰效果最好。为进一步研究CCNL1和TIMP1基因表达之间的相互关系，我们将这两个基因过表达质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，并检测CCNL1和TIMP1基因的表达情况。结果表明CCNL1的过表达能够引起TIMP1基因表达的增加，而TIMP1的过表达也能够引起CCNL1基因表达增加。我们将筛选到的CCNL1和TIMP1基因的干扰质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，对CCNL1和TIMP1基因的表达进行检测，结果表明，CCNL1基因表达的干扰引起TIMP1基因表达显着增加，而TIMP1基因表达的干扰则对CCNL1基因表达的增加影响差异不显着，为进一步研究两基因之间相互影响关系，将TIMP1过表达质粒与CCNL1基因干扰质粒共同转染与乳腺癌细胞中，表现为TIMP1表达的显着增加，TIMP1与CCNL1同时过表达表现为TIMP1和CCNL1表达的强烈增加。由于TIMP1与CCNL1基因对于细胞生长具有调控作用，我们将TIMP1与CCNL1基因的干扰质粒和过表达质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，通过MTT方法检测细胞的生长情况，结果表明，TIMP1对乳腺癌细胞具有正调控作用，CCNL1对乳腺癌细胞具有负调控作用。TIMP1过表达和CCNL1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，表现为很强的促进细胞增殖的作用。CCNL1过表达和TIMP1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，表现为较明显的抑制细胞增殖的作用。TIMP1和CCNL1过表达共同作用于乳腺癌细胞时，细胞未出现明显的增殖变化。TIMP1和CCNL1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，细胞同样未出现明显的增殖变化。说明在乳腺癌细胞中TIMP1和CCNL1同时上调是细胞内维持细胞增殖速度的内部调节机制，以维持细胞平衡的需要。由于癌症的发生是一个多基因、多因素调控产生的。因此，我们推测，在乳腺癌发生时，细胞内TIMP1和CCNL1基因的变化也可能会引起其他基因的变化，因此，我们对TIMP1和CCNL1基因的相关基因变化进行了研究，通过Western blot技术检测了在TIMP1和CCNL1基因过表达时，MMP1、MMP2、CCNL2和P53基因的表达变化情况。结果表明，TIMP1基因的过表达可引起P53和MMP2表达的增加，同时CCNL1的过表达也影响P53和MMP2的表达。TIMP1和CCNL1基因的过表达未对MMP1和CCNL2表达产生显着影响。通过本研究初步探明了在乳腺癌组织和乳腺癌癌旁组织中的基因变化情况，同时，本研究也首次发现了TIMP1与CCNL1基因存在着密切的联系，且CCNL1基因对乳腺癌细胞的生长具有负调控作用，为进一步研究乳腺癌的发生机理奠定了一定的基础。
参考文献：
[1]. 猪肌生成抑制素单克隆抗体制备及组织分布研究[D]. 车东升. 吉林大学. 2006
[2]. 猪肌生成抑制素作用靶位点的研究[D]. 逄大欣. 吉林大学. 2006
[3]. 猪肌生成抑制素单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 车东升, 张春, 李占军, 李莉, 逄大欣. 吉林农业大学学报. 2013
[4]. 小梅山猪MSTN叁种重组蛋白的制备及其免疫对小鼠生长的影响[D]. 金定恩. 华中农业大学. 2008
[5]. 旋毛虫与肝癌H7402相关抗原蛋白的单克隆抗体制备及应用[D]. 张桐嘉. 吉林大学. 2014
[6]. 绵羊Myostatin基因cDNA全序列的克隆及在CHO中的表达[D]. 刘蓉芳. 石河子大学. 2007
[7]. 重组肌肉生长抑制素的制备及主动免疫生长猪的研究[D]. 鲍淑青. 四川农业大学. 2007
[8]. CCNL1和TIMP1基因对人乳腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响[D]. 李鹏. 吉林大学. 2012
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