聚合酶链扩增反应论文_孟兆祥,张伟,檀建新,马晓燕

导读:本文包含了聚合酶链扩增反应论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:核苷酸,跨越式,细胞,凋亡,论文,内切,DNA。

聚合酶链扩增反应论文文献综述

孟兆祥,张伟,檀建新,马晓燕^[1]（2013）在《一种DNA扩增的新技术:利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应》一文中研究指出Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用.本文利用Bst DNA聚合酶的5'→3'聚合酶、核苷酸(末端)转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA).在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA;之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3'末端沿5'→3'方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸(dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1与下游引物P2之间的缺口;然后,以下游引物P2为模板形成互补序列(RcP2);接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3'末端,形成(dNMP)n序列.继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1;如此往复,形成[P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n-…]序列.本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论.该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索.(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2013年09期）

李彪^[2]（2013）在《聚合酶—内切酶扩增反应（PEAR）制备硫代和2’-氟修饰寡核苷酸及其促凋亡活性的初步研究》一文中研究指出人工合成的寡核苷酸（ODNS）广泛应用于基因的诊断和治疗。作为一种有效的基因表达调节工具，反义寡核苷酸已经发展成为一种新型的靶向基因治疗药物。未修饰的天然寡核苷酸容易被内源性核酸酶所降解，而且有些还发现具有严重的副作用。然而带有合适的化学修饰基团的寡核苷酸，在体内具有较强的稳定性，副作用小，比相应的未修饰的寡核苷酸更具有活力。目前寡核苷酸几乎都是使用DNA合成仪进行化学合成，大规模的制备和纯化十分困难，不仅设备成本非常高，而且使用危险化学品。在之前的研究中，我们提出了一种用于大量制备反义寡核苷酸的核酸扩增技术—聚合酶-内切酶扩增反应（Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR）。在本文中的第一部分，我们用PEAR技术制备了硫代磷酸修饰和2’-氟修饰的反义寡核苷酸，利用电喷雾液相色谱-质谱联用技术（ESI/LC/MS）对PEAR产物进行检测，分析了PEAR产物的各个组分。分析结果显示PEAR产物的纯度高达100.0%。PEAR产物的双链可用反向高效液相色谱(RP-HPLC)技术进行拆分和纯化，获得正义链和反义链。利用PEAR技术，通过“滑动-切割”的机制，能够使用少量的化学合成的寡核苷酸种子，制备大量的高纯度的目标寡核苷酸。与化学合成的方法相比，具有成本低，纯度高，易纯化，易大量制备等优点。证明了PEAR技术可以作为大量制备修饰的反义寡核苷酸的一种工具。文章的第二部分，我们检测了PEAR产物的生物学活性。一般情况下反义寡核苷酸是以单链形式在细胞中或者体内发挥作用的。PEAR的产物为双链寡核苷酸的重复序列，使用之前必须将PEAR产物进行完全酶切和分离双链。据报道，双链寡核苷酸能够更有效地抑制基因表达，据此我们推断PEAR制备的双链寡核苷酸也应该能够有效地抑制基因表达。据报道，miR-30家族能够通过抑制p53基因的途径，来抑制细胞的凋亡，促进细胞的癌变。因此我们把miR-30a作为研究目标，利用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的双链寡核苷酸重复序列（anti-miR-30a），用脂质体转染技术导入胃癌细胞，利用流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡率。转染后24h检测结果显示，未修饰的anti-miR-30a和2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组，细胞的凋亡率要显着高于空白对照组，而且2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组的促进细胞凋亡的效率相对更明显。所以我们初步推断用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的寡核苷酸重复序列，能够抑制胃癌细胞中miR-30a的表达，进而促进p53基因的表达，使细胞凋亡率增加，而且2’-氟修饰的比未修饰的寡核苷酸重复序列稳定性要强，抑制效果更好。因此我们初步推测PEAR制备的寡核苷酸双链重复DNA具有特异性地抑制基因表达的生物学活性，但尚需进一步实验证实此现象，并研究其作用机制。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2013-06-02）

聚合酶链扩增反应论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

人工合成的寡核苷酸（ODNS）广泛应用于基因的诊断和治疗。作为一种有效的基因表达调节工具，反义寡核苷酸已经发展成为一种新型的靶向基因治疗药物。未修饰的天然寡核苷酸容易被内源性核酸酶所降解，而且有些还发现具有严重的副作用。然而带有合适的化学修饰基团的寡核苷酸，在体内具有较强的稳定性，副作用小，比相应的未修饰的寡核苷酸更具有活力。目前寡核苷酸几乎都是使用DNA合成仪进行化学合成，大规模的制备和纯化十分困难，不仅设备成本非常高，而且使用危险化学品。在之前的研究中，我们提出了一种用于大量制备反义寡核苷酸的核酸扩增技术—聚合酶-内切酶扩增反应（Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR）。在本文中的第一部分，我们用PEAR技术制备了硫代磷酸修饰和2’-氟修饰的反义寡核苷酸，利用电喷雾液相色谱-质谱联用技术（ESI/LC/MS）对PEAR产物进行检测，分析了PEAR产物的各个组分。分析结果显示PEAR产物的纯度高达100.0%。PEAR产物的双链可用反向高效液相色谱(RP-HPLC)技术进行拆分和纯化，获得正义链和反义链。利用PEAR技术，通过“滑动-切割”的机制，能够使用少量的化学合成的寡核苷酸种子，制备大量的高纯度的目标寡核苷酸。与化学合成的方法相比，具有成本低，纯度高，易纯化，易大量制备等优点。证明了PEAR技术可以作为大量制备修饰的反义寡核苷酸的一种工具。文章的第二部分，我们检测了PEAR产物的生物学活性。一般情况下反义寡核苷酸是以单链形式在细胞中或者体内发挥作用的。PEAR的产物为双链寡核苷酸的重复序列，使用之前必须将PEAR产物进行完全酶切和分离双链。据报道，双链寡核苷酸能够更有效地抑制基因表达，据此我们推断PEAR制备的双链寡核苷酸也应该能够有效地抑制基因表达。据报道，miR-30家族能够通过抑制p53基因的途径，来抑制细胞的凋亡，促进细胞的癌变。因此我们把miR-30a作为研究目标，利用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的双链寡核苷酸重复序列（anti-miR-30a），用脂质体转染技术导入胃癌细胞，利用流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡率。转染后24h检测结果显示，未修饰的anti-miR-30a和2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组，细胞的凋亡率要显着高于空白对照组，而且2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组的促进细胞凋亡的效率相对更明显。所以我们初步推断用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的寡核苷酸重复序列，能够抑制胃癌细胞中miR-30a的表达，进而促进p53基因的表达，使细胞凋亡率增加，而且2’-氟修饰的比未修饰的寡核苷酸重复序列稳定性要强，抑制效果更好。因此我们初步推测PEAR制备的寡核苷酸双链重复DNA具有特异性地抑制基因表达的生物学活性，但尚需进一步实验证实此现象，并研究其作用机制。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。