乳酸乳球菌抗酸元器件的高效筛选及其作用分析

论文摘要

碳代谢导致的产酸积累是促使微生物细胞活性降低的关键因素,但目前尚缺乏基于抗酸元器件生理调控方式解析的靶向控制策略。在对抗酸元器件作用方式解析的基础上通过靶向的调控和改造策略可以有效提升微生物细胞的酸胁迫耐受性。本论文以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis NZ9000）为出发菌株,通过基因组突变结合高通量筛选技术获得了酸胁迫抗性明显提升的突变菌株。利用转录组学技术,探究了原始菌株和突变菌株在酸胁迫条件下的转录响应过程,初步确定了部分与酸胁迫抗性相关的作用因子。在此基础上,通过代谢工程改造有效提升了乳酸乳球菌的酸胁迫耐受性并分析了关键抗酸元器件的具体作用方式。主要研究结果如下:（1）诱变育种结合高通量筛选获得三株耐酸性乳酸乳球菌。以L.lactis NZ9000为出发菌株,通过化学和紫外诱变并结合高通量筛选技术获得三株耐酸性突变菌株。对突变菌株的酸胁迫耐受性分析发现,在pH 4.5条件下,突变菌株L.lactis WH101、L.lactis WH102和L.lactis WH103的最大生物量分别是原始菌株的5.5、3.6和4.3倍。pH 4.0胁迫5 h后,突变菌株的存活率分别是原始菌株的16000、351.4和264.3倍。进一步对突变菌株的胞内生理应答机制进行分析发现,酸胁迫条件下,突变菌株L.lactis WH101维持了更高的胞内ATP和NH4+水平,且胞内pH维持了相对平衡。（2）基于转录组学技术分析乳酸乳球菌酸胁迫响应过程。通过转录组学技术研究了乳酸乳球菌原始菌株和突变菌株在酸胁迫前后的差异表达基因。碳代谢（kdgA,malQ,and bglX）与转运（msmK,malEFG,rbsAB,fruA,and ptnD）途径中基因的显著差异表达促进了中心代谢,为细胞在酸性环境中存活、生长和代谢提供能量。氨基酸代谢（hisCHZ,serB,arcC1C2,ilvABCDN,leuABC,gltBD,glmS,glnA,arcABC1C2,and asnB）与转运（dppA,ctrA,glnPQ,and yjeM）途径中基因的显著差异表达,可通过脱氨、脱羧等反应生成NH3或碱性物质,消耗胞内的H+,维持胞内pH的相对平衡。脂肪酸生物合成途径中相关基因（accABCD and fabDFGHZ）的差异表达,影响了细胞膜结构和相关组分的变化,从而影响酸胁迫条件下相关质子的跨膜转运。（3）基于过表达转运蛋白的抗酸元器件提高了细胞的酸胁迫抗性。基于乳酸乳球菌在酸胁迫条件下的转录响应分析,通过在L.lactis NZ9000中过量表达ABC和氨基酸转运蛋白明显提高了L.lactis NZ9000在酸胁迫条件下的存活率。基于ABC转运蛋白的比较转录组学分析结果表明,分别过表达四个ABC转运蛋白的重组菌株可通过上调一些共有基因的表达（如编码冷休克蛋白（csp）、参与脂肪酸（fabH）以及辅酶A（coaD）的生物合成过程）来帮助细胞抵御酸胁迫的损伤;其次某些特定的重组菌株还具有其特有的酸胁迫响应过程。基于氨基酸转运蛋白的比较转录组学分析结果表明,过表达CtrA和GlnP蛋白强化了胞内氨基酸的转运（yjeM）、精氨酸的代谢（argGH）以及嘧啶的生物合成过程。另外,多个冷休克蛋白（csp）、核糖体蛋白（rpsA and rpmFG）编码基因、细胞分裂（rodA and gpsB）相关的基因以及负责胞内外离子、氨基酸等物质转运的多个基因均发生了显著上调。（4）硫胺素提高了乳酸乳球菌细胞的酸胁迫耐受性。发现并研究了硫胺素提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的作用机制。通过外源添加硫胺素以及过表达硫胺素转运途径中的thiT基因或合成途径中的thiDM基因能有效提高细胞对酸胁迫的耐受性。酸胁迫条件下,硫胺素提高了乙偶姻生物合成途径中关键基因的转录水平,乙偶姻生物合成途径的加强导致质子消耗的增加,维持了胞内pH的动态平衡。另外,硫胺素可明显提高中心代谢途径中TPP依赖性酶丙酮酸脱氢酶的转录水平,从而强化细胞产能途径,为细胞应对酸胁迫提供更多能量。最后,酸胁迫条件下添加硫胺素可明显提高胞内多种氨基酸尤其是谷氨酸的浓度,且胞内ATP浓度也得到提高。（5）基于差异基因的互作关系解析确定了单因素抗酸元器件的串联表达方案。为确定具备协同作用效果的抗酸元器件串联表达方案,对差异基因进行互作关系解析,明确了具有潜在协同效果的抗酸元器件串联表达方案。并通过构建抗酸胁迫重组菌株验证了串联表达的作用效果,进一步分析了串联表达对胞内氨基酸代谢和ATP浓度的影响。结果表明,GlnP和GlnQ蛋白的共表达,菌株对酸胁迫的耐受性进一步提升,串联表达菌株L.lactis（GlnP/GlnQ）的存活率分别是L.lactis（GlnP）和L.lactis（GlnQ）的16.0和36.6倍。此外,GlnP和GlnQ的共表达进一步提高了胞内天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸浓度以及ATP浓度。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 概述

1.1.1 乳酸菌概述

1.1.2 乳酸菌在食品及发酵工业中的应用

1.1.3 微生物的代谢产酸

1.2 抗酸元器件的研究进展

1.2.1 微生物细胞应对酸胁迫的自我调控机制研究

1.2.2 微生物细胞酸胁迫抗性提升的策略研究

1.2.3 抗酸元器件的构建研究

1.3 本论文主要研究内容

1.3.1 立题依据及研究意义

1.3.2 本论文主要研究内容

第二章基因组突变结合高通量技术筛选耐酸性乳酸乳球菌

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株

2.2.2 试剂和药品

2.2.3 仪器和设备

2.2.4 培养基和培养条件

2.2.5 诱变育种

2.2.6 高通量筛选

2.2.7 细胞浓度的测定

2.2.8 胁迫实验

2.2.9 胞内生理指标的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 基因组突变结合高通量技术筛选耐酸性乳酸乳球菌

2.3.2 突变菌株在酸胁迫条件下的生长性能分析

2.3.3 突变菌株的酸胁迫抗性分析

2.3.4 突变菌株其它胁迫抗性分析

2.3.5 酸胁迫条件下的胞内生理应答解析

2.4 本章小结

第三章乳酸乳球菌应对酸胁迫的转录组学分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株

3.2.2 主要试剂和药品

3.2.3 仪器设备

3.2.4 培养基和培养条件

3.2.5 总RNA提取

3.2.6 RNA测序

3.2.7 转录组数据分析

3.2.8 反转录实时定量PCR（qRT-PCR）分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 原始菌株与突变菌株的差异表达基因分析

3.3.2 差异基因的GO功能和pathway显著性富集分析

3.3.3 关键差异基因的验证分析

3.3.4 差异基因的模块化分析

3.3.5 突变菌株的基因突变分析

3.4 本章小结

第四章基于转运蛋白的抗酸元器件提高细胞酸胁迫抗性

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 试剂和药品

4.2.3 仪器和设备

4.2.4 培养基和培养条件

4.2.5 大肠杆菌感受态的制备与转化

4.2.6 乳酸乳球菌感受态的制备与转化

4.2.7 分子生物学操作

4.2.8 酸胁迫实验

4.2.9 胞内氨基酸、ATP与蛋白浓度的测定

4.2.10 比较转录组学分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 过表达ABC转运蛋白对菌株酸胁迫抗性的影响

4.3.2 过表达ABC转运蛋白提高细胞酸胁迫耐受性的比较转录组学分析

4.3.3 过表达氨基酸转运蛋白对菌株酸胁迫抗性的影响

4.3.4 过表达氨基酸转运蛋白提高细胞酸胁迫抗性的比较转录组学分析

4.3.5 过表达氨基酸转运蛋白对胞内氨基酸浓度的影响

4.4 本章小结

第五章硫胺素保护细胞抵御酸胁迫的作用机制解析

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 菌株和质粒

5.2.2 试剂和药品

5.2.3 仪器和设备

5.2.4 培养基和培养条件

5.2.5 大肠杆菌感受态的制备与转化

5.2.6 乳酸乳球菌感受态的制备与转化

5.2.7 分子生物学实验操作

5.2.8 酸胁迫实验

5.2.9 胞内氨基酸、ATP、蛋白浓度的测定

5.2.10 反转录实时定量PCR（qRT-PCR）分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 硫胺素提高乳酸乳球菌酸胁迫耐受性的作用效果验证

5.3.2 硫胺素对胞内关键基因转录水平的影响

5.3.3 硫胺素对胞内氨基酸代谢的影响

5.3.4 硫胺素对胞内ATP水平的影响

5.3.5 代谢工程改造提高乳酸乳球菌的酸胁迫耐受性

5.4 本章小结

第六章抗酸元器件的串联表达与应用

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株和质粒

6.2.2 试剂和药品

6.2.3 仪器和设备

6.2.4 培养基和培养条件

6.2.5 大肠杆菌感受态的制备与转化

6.2.6 乳酸乳球菌感受态的制备与转化

6.2.7 分子生物学实验操作

6.2.8 酸胁迫实验

6.2.9 胞内氨基酸、ATP浓度和蛋白浓度的测定

6.3 结果与讨论

6.3.1 差异基因的互作关系分析

6.3.2 单因素抗酸元器件的串联表达解析

6.3.3 单因素抗酸元器件的串联表达对胞内氨基酸浓度的影响

6.3.4 单因素抗酸元器件的串联表达对胞内ATP水平的影响

6.3.5 抗酸元器件在E.coli中的应用

6.4 本章小结

主要结论与展望

主要结论

展望

论文主要创新点

致谢

参考文献

附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文

附录 Ⅱ:转录组学分析中的差异基因列表

附录 Ⅲ:氨基酸浓度测定的平均值和标准误差

文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱政明

导师: 吴志猛

关键词: 乳酸乳球菌,酸胁迫,转录组学,抗酸元器件,响应过程

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

基金: 国家自然科学基金面上项目“新型抗酸胁迫元器件的高效筛选及其普适性作用机制解析”(31470160),973项目“生物抗酸和抗高温元器件的发掘,构建与实验室评估”(2013CB733902)

分类号: TS201.3

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乳酸乳球菌抗酸元器件的高效筛选及其作用分析

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