不产氧光合细菌5-氨基乙酰丙酸（ALA）的合成途径分布和代谢调控

论文摘要

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是合成血红素、（细菌）叶绿素及VB12等物质的重要前体,也已广泛应用于农业和医疗等领域。ALA生物合成途径包括C4途径和C5途径。不产氧光合细菌（Anoxygenic phototrophic bacteria,APB）是一类依赖细菌叶绿素（BChl）进行不产氧光合作用的代谢多样性类群,ALA是BChl合成的必需前体,因此利用APB生产ALA也备受关注和青睐。但目前对C4和C5途径在APB分布的认识还不完善,也存在一定分歧,实验证据缺乏。针对这些问题,本研究首先在基因组水平上,系统全面的分析了APB中C4和C5途径的分布特点和规律;并选择一株γ变形菌纲紫细菌Marichromatium gracile YL28对其ALA合成途径进行了实验验证;将源于APB C5途径的ALA关键酶基因以及细菌叶绿素合成镁螯合酶基因（bchHID）和镁原卟啉甲基转移酶基因（bchM）依次转入E.coli BL21和Rhodopseudomonas palustris CGA009,探求了ALA的调控机制。主要研究结果如下:（1）ALA合成途径基因组分析和验证。收集了117株APB的基因组数据,系统分析了ALA合成关键酶基因（gtr、gsa和hemA）在APB中的分布特征。首次发现了一个新的C4途径的关键酶基因,提出了C4和C5途径共存于绿细菌、β和γ变形菌纲的紫细菌的新认识;以Marichromatium gracile YL28为研究对象,通过基因异源表达验证了新型ALA合成酶基因的功能,证明了γ变形菌纲紫细菌YL28中除了含有C5途径外,还存在C4途径。（2）C5途径基因对ALA合成的调控。将源于M.gracile YL28的C5途径3个关键酶基因导入E.coli BL21,获得了4个重组菌,谷氨酸和葡萄糖的添加均上调ALA的积累量,gtr-gsa共表达菌株与其它3个单基因表达菌株相比,ALA积累量明显升高。将源于YL28的C5途径3个关键酶基因通过接合转移的方法导入到含有C4途径的R.palustris CGA009中,获得了3个重组菌,结果表明外源C5途径基因的表达均可提高重组菌的ALA积累量。（3）BChl合成途径基因对ALA合成的调控。将源于YL28 BChl合成途径的镁螯合酶基因（bchHID）和镁原卟啉甲基转移酶基因（bchM）依次导入E.coli BL21中,获得了2个重组菌,能合成APB所特有的细菌叶绿素中间体镁原卟啉单甲酯,下调了ALA合成积累。综上所述,本研究丰富了紫细菌和绿细菌中ALA合成途径分布规律的认识;首次提出绿细菌、β和γ变形菌纲紫细菌中共存C4和C5途径的新认识,发现了一个新的C4途径的ALA合成关键基因,对ALA代谢调控进行了初步研究,为进一步深入研究ALA的代谢调控奠定了基础。

论文目录

摘要

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第1章绪论

1.1 引言

1.2 5 -氨基乙酰丙酸（ALA）生理作用和应用

1.2.1 ALA的生理作用

1.2.2 ALA的应用

1.3 ALA生物合成途径

1.3.1 C4 途径

1.3.2 C5 途径

1.3.3 C4和C5 途径在不产氧光合细菌（APB）中分布的认识

1.4 ALA的生产

1.4.1 化学法生产ALA

1.4.2 生物法生产ALA

1.5 ALA合成代谢的调控

1.5.1 ALA合成途径基因对其代谢的调控

1.5.2 底物及其他因素对ALA代谢的调控

1.5.3 血红素合成途径基因对ALA代谢的调控

1.5.4 BChl合成途径基因对ALA代谢的调控

1.6 本课题研究内容及创新点

第2章不产氧光合细菌（APB）ALA合成途径的生物信息学分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 基因组获取

2.2.2 同源基因及酶序列的搜索

2.2.3 系统进化树构建与序列保守性分析

2.2.4 M.gracile YL28的ALA合成关键酶理化性质预测与结构建模

2.3 结果

2.3.1 ALA合成途径在不产氧光合细菌中的分布特征

2.3.2 不产氧光合细菌3 种关键酶的系统发育分析

2.3.3 不产氧光合细菌3 种关键酶序列保守性分析

2.3.4 M.gracile YL28的3 个关键酶理化性质分析与结构模型

2.4 讨论

2.5 小结

第3章两种ALA合成途径共存于γ变形菌纲紫细菌的验证

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 仪器与试剂

3.2.3 培养基及培养条件

3.2.4 试剂配制

3.2.5 YL28 基因组DNA提取和质粒的提取

3.2.6 目的基因的PCR扩增

3.2.7 限制性内切酶酶切

3.2.8 DNA纯化

3.2.9 DNA连接

3.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.2.11 转化

3.2.12 阳性重组子的筛选与鉴定

3.2.13 重组菌的诱导表达与蛋白的电泳检测

3.2.14 蛋白质浓度的测定-Bradford

3.2.15 菌体生物量测定

3.2.16 ALA的测定

3.2.17 4 个关键酶胞内酶活测定

3.2.18 4 个关键酶胞外酶活测定

3.2.19 酯酶活性测定

3.3 结果

3.3.1 基因组DNA和质粒载体的检测

3.3.2 4 个目的基因的检测

3.3.3 4 个重组菌E.coli（hemA/gltX/gtr/gsa）的构建与鉴定

3.3.4 4 个重组蛋白的表达、纯化与鉴定

3.3.5 4 个重组酶的体外酶活验证

3.3.6 4个重组酶的体外酶活验证

3.3.7 GTR酯酶活性测定

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 C5 途径基因在以C4 途径合成ALA的 APB中的表达

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株和质粒

4.2.2 仪器和试剂

4.2.3 培养基及培养条件

4.2.4 基因共表达

4.2.5 载有C5 途径关键酶基因的3 个接合转移供体菌E.coli的构建

4.2.6 接合转移

4.2.7 载有C5 途径关键酶基因的3 个重组R.palustris CGA009 的构建

4.3 结果

4.3.1 质粒载体和目的基因的检测

4.3.2 3 个接合转移供体菌E.coli（gtr/gsa/gtr-gsa）的鉴定

4.3.3 3 个重组R.palustris CGA009（gtr/gsa/gtr-gsa）的鉴定

4.3.4 C5 途径基因对R.palustris CGA009生长和ALA积累量的影响

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 ALA合成代谢的调控

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株和质粒

5.2.2 仪器和试剂

5.2.3 培养基及培养条件

5.2.4 底物对ALA合成的影响

5.2.5 共表达工程菌E.coli（gtr-gsa）和E.coli（bchHID-bchM）的构建

5.2.6 镁原卟啉单甲酯（MPE）的光谱分析

5.2.7 镁原卟啉单甲酯（MPE）的HPLC分析

5.3 结果

5.3.1 质粒载体的检测

5.3.2 共表达工程菌E.coli（gtr-gsa）的鉴定

5.3.3 底物及gtr和 gsa共表达对重组菌积累ALA的影响

5.3.4 2 个重组E.coli（bchHID/bchHID-bchM）的鉴定

5.3.5 bchHID的表达及bchHID和bchM共表达对E.coli生长和ALA积累量的影响

5.3.6 2 个重组E.coli（bchHID/bchHID-bchM）的MPE光谱分析

5.3.7 重组E.coli（bchHID-bchM）的MPE HPLC分析

5.4 讨论

5.5 小结

第6章结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

附录 A GTR氨基酸序列多重比对

附录 B GSA氨基酸序列多重比对

附录 C ALAS氨基酸序列多重比对

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 祝靓靓

导师: 赵春贵

关键词: 氨基乙酰丙酸,不产氧光合细菌,代谢调控,海洋着色菌,沼泽红假单胞菌

来源: 华侨大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,有机化工

单位: 华侨大学

分类号: Q933;TQ226.35

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不产氧光合细菌5-氨基乙酰丙酸（ALA）的合成途径分布和代谢调控

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