徐东[1]2008年在《金鱼雌核发育单倍体与正常二倍体胚胎蛋白质组研究》文中指出在具有相同基因组的金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中,单倍体本身的条件导致了它在基因表达上有缺陷,发育不正常,而二倍体发育正常。本研究采用蛋白质组学的研究手段对金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎作了一系列的研究,共分为两个部分:第一部分,为了研究金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中的蛋白质表达水平的差异,并阐明单倍体不能正常发育的机制,我们以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体(HE)和二倍体(DE)早期发育过程的胚胎,即神经板期(为受精后18小时)的胚胎为材料,提取胚胎的全蛋白质,采用双向凝胶电泳进行蛋白质点的分离,获得重复性较好的凝胶图谱,经PDQUEST 2D分析软件对HE和DE的差异蛋白质进行比较分析,HCT质谱初步鉴定了43个差异蛋白质,包括一些分子伴侣、细胞骨架蛋白和酶类,另外还有大量卵黄蛋白质被鉴定到。在金鱼早期发育过程中,卵黄蛋白作为主要的营养物质,为鱼类发育提供必要的能量,因此卵黄蛋白为高丰度蛋白质,而大部分在表达水平上急剧变化的蛋白质,例如某些转录因子和信号蛋白,由于丰度低,在2-DE凝胶上无法清楚的展示。为了降低样品的复杂程度,富集低丰度蛋白质,提高蛋白质的检出灵敏度,鉴定到一些低丰度的转录因子和信号蛋白,我们提取雌核发育单倍体胚胎核蛋白(HEN)和正常二倍体胚胎的核蛋白质(DEN)进行研究,并采用定量蛋白质组方法2D-DIGE对蛋白质点进行分离,再经Decyder分析软件对HEN和DEN的差异蛋白质进行分析,得到97个差异蛋白质点,经HCT质谱分析初步鉴定了66个差异蛋白质。通过对这些差异蛋白质点的功能分析,发现一些与发育调控、神经发育、细胞分化、信号传导等相关的蛋白质。结果表明金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎在发育过程中基因表达水平上有显着性差异,这些差异也许是导致单倍体发育不正常的原因。第二部分,前期研究表明在金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中,一些对发育起关键作用的基因未能被选择表达或表达受阻而导致单倍体发育异常。在单倍体胚胎发育过程中出现了正常眼,泡状眼,无腔眼叁种表型,经统计分析表明,单倍体发育的胚胎数目以正常眼:泡状眼:无腔眼为1:2:1的比例分配。已有研究证明Vsx1基因在单倍体胚胎中表达受阻,而导致了单倍体胚胎发育异常,其中正常眼单倍体胚胎中Vsx1基因能够表达,无腔眼中Vsx1的基因不能表达,泡状眼中等位基因中一个表达,一个未表达。与二倍体相比,Vsx1基因在单倍体胚胎中未能被选择表达,可能与单倍体胚胎发育异常有关。为了揭示金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中的这种发育异常的机制,本文以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体形成的无腔眼(CLHE)和正常眼(NHE)的相应眼睛色素出现期的胚胎为材料,提取胚胎全蛋白质后,采用双向凝胶电泳进行蛋白质点的分离,获得重复性较好的凝胶图谱,再用PDQUEST 2D分析软件对CLHE和NHE的差异蛋白质进行比较分析,经MALDI-TOF/TOF和Q-TOF质谱分析鉴定了59个差异蛋白质点。通过生物信息学分析方法对这些差异蛋白质点的功能分析,发现了与眼睛发育,神经发育,细胞分化,体节形成,信号传导等相关的蛋白质。此外,通过免疫印迹法和免疫组织化学法,某些重要差异蛋白质已得到了进一步的验证。
黄凌云, 罗琛, 谢锦云, 梁宋平[2]2003年在《金鱼(Carassius auratus)雌核发育单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究》文中提出在具有相同基因组背景的金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中,单倍体本身的条件导致了它在基因表达上有缺陷,发育不正常,而二倍体发育正常。为了研究在金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中的蛋白质表达水平的差异,并鉴定一些与胚胎发育相关的重要蛋白质,我们以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体和正常二倍体的相应眼睛形成的发育阶段的胚胎为材料,然后提取胚胎的全蛋白,用二维聚丙烯酰胺电泳的方法进行蛋白质点的分离,获得了质量较好的IPG-2DE图谱,利用PDQUEST 2DE分析软件对扫描后的凝胶图象进行了处理,斑点检测,匹配和量化,获得了一系列的差
周新文, 张玲, 罗琛, 谢锦云, 陈平[3]2004年在《金鱼(Carassius auratus)雌核发育过程中的单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究》文中研究表明本室前期已发表的工作表明在金鱼雌核发育眼睛形成期(受精后26个小时)单倍体上一些与眼睛发育、神经发育、发育调控等相关的重要蛋白未能被选择表达或表达受阻,从而导致了单倍体发育畸形。为了进一步研究在金鱼雌核发育过程中不同发育阶段的单倍体和二倍体蛋白质表达水平的差异,并阐明单倍体不能正常发育的机制,我们以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体(HE)和正常二倍体(DE)
黄凌云[4]2003年在《金鱼（Carassius auratus）雌核发育单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究》文中研究指明在具有相同基因组的金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中，单倍体本身的条件导致了它在基因表达上有缺陷，发育不正常，而二倍体发育正常。为了研究在金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎发育过程中的蛋白质表达水平的差异，并鉴定一些与发育相关的重要蛋白质，我们以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体和正常二倍体的相应眼睛形成的发育阶段的胚胎为材料(3个时期，分别为HE-1和DE-1，HE-2和DE-2，HE-3和DE-3)，然后提取胚胎的全蛋白，用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行蛋白质点的分离，获得了质量较好的凝胶图谱，结果显示大部分蛋白质点分布在pH5-10，相对分子质量在10000-50000Da。利用PDQUEST 2-D分析软件对扫描后的凝胶图象进行了处理，经斑点检测，匹配和量化，获得了一系列的差异蛋白质点图谱，发现在HE-3和DE-3间有100多个有显着性差异的蛋白质点，HE-2和DE-2间有250多个有显着性差异蛋白质点。分别选取其中70个分辨好的差异蛋白质点进行原位胰蛋白酶酶解，酶解的肽片段用基质辅助激光解析电离分行时间质谱(MALDI-TOF MS)得到肽质指纹图谱，再在网上PeptIdent软件中搜索SWISS-PROT和TrEMBL数据库，初步鉴定了HE-3和DE-3上32个差异蛋白质点，其中包括16个表达量上有差异的蛋白质点(P＜0.05)和16个有无表达的差异蛋白质点，并且初步鉴定了HE-2和DE-2上25个差异蛋白质点，其中包括5个表达量上有差异的蛋白质点(P＜0.05)和20个有无表达的差异蛋白质点。通过对这些鉴定的差异蛋白质点的功能分析，发现了一些与眼睛发育、发育调控、神经发育、细胞分化与维持、体节形成、信号传导等相关的蛋白质。结果表明金鱼雌核发育单倍体和二倍体胚胎在发育过程中基因表达水平上有显着性的差异。这些差异也许是导致单倍体发育不正常的原因。 我们还对第二时期和第叁时期胚胎蛋白质组进行了比较研究，并对部分差异蛋白质点进行了分析，其中包括DE-2和DE-3胚胎蛋白质组的比较，以及HE-2和HE-3胚胎蛋白质组的比较，发现单倍中文摘要体和二倍体在这两个发育时期基因表达也存在很大的差异。
张晓娜[5]2014年在《久效磷对金鱼（Carassius auratus）甲状腺轴的干扰效应及作用机制研究》文中研究指明甲状腺激素(THs)叁碘甲腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)对鱼类诸多生理机能具有重要的调控作用。为确定有机磷农药久效磷对鱼类甲状腺轴的干扰效应，本文检测了久效磷农药对雄性和雌性金鱼血浆THs含量以及下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)不同位点上调控THs合成、转运及代谢等过程的相关基因表达水平的影响，从激素水平和基因水平两个层面较为系统地研究了久效磷农药对HPT轴的干扰效应及潜在作用机制。此外，久效磷农药可能通过复合作用机制干扰鱼类内分泌系统，本文进一步研究了久效磷(标准品)对雄性和雌性金鱼血浆THs和性激素水平的影响，并以肝脏脱碘酶(d1、d2、d3)、促甲状腺激素(TSH)合成与分泌、促甲状腺激素释放激素(TRH)/促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)调控等多个甲状腺轴内分泌相关因子以及性腺芳香化酶、促性腺激素(GtHs)合成与分泌、促性腺激素释放激素(GnRHs)调控等多个生殖轴线内分泌相关因子为指标，探讨了久效磷干扰金鱼HPT轴和HPG轴的潜在交互作用，以期为可通过影响多个内分泌轴线发挥其内分泌干扰作用的污染物的生态风险评价提供更多理论依据。本文研究结果表明：(1)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天，能够造成甲状腺滤泡上皮细胞增生、滤泡细胞肥大、胶质缺失等病理学变化。采用放射性免疫法(radioimmunoassay, RIA)检测了血浆中THs含量，结果表明：叁个浓度久效磷农药均能够显着降低雄鱼血浆TT3含量及TT3/TT4比值，但对TT4含量无明显影响；血浆FT3和FT4含量分别在0.01、1.00mg/L暴露组和0.10mg/L暴露组显着降低。久效磷农药暴露21天也能够导致雌性金鱼血浆TT3含量及TT3/TT4比值降低；叁个浓度久效磷农药均能够导致雌鱼血浆FT3含量显着降低，0.10mg/L久效磷农药能够显着降低血浆FT4含量，但与雄鱼不同的是，雌鱼血浆FT4含量在0.01mg/L暴露组显着升高。由此说明，久效磷农药具有潜在的甲状腺干扰效应，能够造成雄性和雌性金鱼血浆THs水平紊乱。(2)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后，采用实时定量PCR方法检测了HPT轴相关基因表达水平。结果表明：由于脱碘酶在肝脏、脑、肾脏等组织中的分布及作用特点不同，久效磷农药对脱碘酶基因表达水平的影响具有组织特异性。久效磷农药导致金鱼血浆TT3水平降低的主要原因可能与其对肝脏叁种脱碘酶基因表达的影响有关，0.01和0.10mg/L久效磷农药对雄鱼和雌鱼肝脏d1和d3基因表达的促进作用明显高于对d2基因表达的促进作用，在促进T4向T3转化的同时更加强了T3代谢；雄鱼中1.00mg/L久效磷农药主要通过下调肝脏d2mRNA水平，减少了T4向T3的转化，而雌鱼中1.00mg/L久效磷农药仍通过上调d3mRNA水平，加强TH代谢，最终导致血浆TT3水平降低。由于血浆T3水平降低的负反馈调节作用，久效磷农药暴露导致金鱼垂体促甲状腺激素(tshβ)mRNA水平上调。血浆FT3水平降低除了与TT3水平降低有关外，可能还与肝脏甲状腺激素运载蛋白(ttr)mRNA水平变化有关。此外，下丘脑trh mRNA水平下调以及crh mRNA水平变化的影响机制较为复杂，可能同久效磷对HPT轴之外的其它因子的影响有关。(3)0.004、0.040和0.400mg/L久效磷(标准品)暴露雄性和雌性金鱼2、4、8、12天后，经RIA和实时定量PCR检测发现，能够造成血浆TT3、TT4、17β-雌二醇(E2)和睾酮(T)水平紊乱，并影响甲状腺轴和生殖轴线不同位点相关基因表达水平。久效磷标准品短时间暴露的实验结果同久效磷农药暴露21天的实验结果并不完全一致，但从中我们推测，久效磷对甲状腺轴和生殖轴线的干扰作用可能存在一定程度上的交互影响。久效磷暴露2天和4天，对肝脏d2和d3基因表达的抑制作用可能同其导致的E2水平升高有关；通过久效磷对金鱼性腺中甲状腺激素受体(TRα-1和TRβ)基因表达水平的影响推测，性腺芳香化酶基因表达水平的升高可能与久效磷暴露造成的T3含量减少存在一定关系。综上，本研究表明，久效磷农药对雄性和雌性金鱼甲状腺轴具有潜在的干扰效应，能够造成血浆THs水平紊乱，进而可能影响依赖THs调控的相关生理机能。HPT轴不同位点上调控THs合成、转运及转化等过程的相关基因对久效磷农药暴露较为敏感，其中，久效磷农药对肝脏、脑和肾脏等外周组织脱碘酶基因表达水平影响尤为显着且具有组织特异性。此外，久效磷农药的有效成分—久效磷短时间暴露，能够影响雄性和雌性金鱼血浆THs和性激素水平以及HPT轴和HPG轴相关基因表达水平。由此我们推测，久效磷通过复合作用机制干扰鱼体内分泌系统，其对这两条内分泌轴线的影响间可能存在潜在的交互作用，但尚需结合更多的体外实验为此提供更为可靠的理论依据。
王慧[6]2013年在《久效磷农药对雄性金鱼（Carassius auratus）性激素合成与转化的影响机制研究》文中进行了进一步梳理久效磷农药已被证实具有潜在的环境雌激素活性，可导致雄性金鱼、孔雀鱼体内雄激素睾酮(testosterone, T)水平降低、雌激素17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)水平升高。鱼类性激素的合成涉及一系列的酶促反应，久效磷农药对性激素合成途径中间环节的干扰可能是导致鱼类雄雌激素比例失衡的原因。本文采用0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，首先检测性激素合成底物胆固醇含量变化情况，其次在克隆金鱼多种类固醇生成酶cDNA片段的基础上检测久效磷暴露对其mRNA表达水平的影响，最后检测久效磷暴露条件下性激素合成途径中间产物和效应激素的含量，并分析类固醇生成酶基因表达变化与性激素含量异常的相关关系，以期从性激素合成与转化的角度阐明久效磷农药导致雄性鱼类雄雌激素比例失衡的机制。本文研究结果表明：(1)0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，采用全自动生化分析仪测定雄性金鱼血浆中总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油叁酯的含量。结果表明：0.10mg/L久效磷农药可使雄鱼血浆中高密度脂蛋白胆固醇含量显着降低，可能会导致运输到精巢组织的性激素合成底物含量降低，从而导致T合成受到抑制。(2)0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，采用实时定量PCR(real-time PCR)检测精巢中类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)及胆固醇侧链裂解酶(cholesterol sidechain cleavage enzyme, P450scc)、3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroiddehydrogenase,3β-HSD)、17α羟化酶(cytochrome P45017alpha-hydroxylase,17,20-lyase, P450c17)等类固醇生成酶mRNA的表达水平，采用酶联免疫分析方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定血浆中孕烯醇酮、孕酮、17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、雌酮、11β-羟基睾酮等性激素合成中间产物的含量。结果表明：久效磷农药抑制雄性金鱼精巢中StAR mRNA的表达水平，可能会导致转运到线粒体内膜的胆固醇含量减少；久效磷农药抑制P450scc的表达，从而降低血浆中孕烯醇酮的含量；久效磷农药降低3β-HSD、P450c17mRNA的表达水平，导致雄烯二酮含量减少；由此推测久效磷农药对上述类固醇生成途径的抑制作用，是造成雄性鱼类体内雄激素T含量降低的另一机制。(3)0.01mg/L、0.10mg/L和1.00mg/L久效磷农药暴露雄性金鱼21天，采用real-time PCR检测精巢中20β-羟类固醇脱氢酶(20β-hydroxysteroid dehydrogenase,20β-HSD)、芳香化酶(cytochrome P450aromatase, P450arom)、17β-羟类固醇脱氢酶I(17β-hydroxysteroid dehydrogenase type I,17β-HSD1)、11β-羟化酶(11β-hydroxylase, P45011β)、11β-羟类固醇脱氢酶II(11β-hydroxysteroiddehydrogenase type II,11β-HSD2) mRNA表达水平，采用ELISA法检测血浆中17α,20β-双羟孕酮、11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)等效应激素的含量。结果表明：久效磷农药提高P450arom、17β-HSD1mRNA表达水平，推测久效磷农药对这两种类固醇生成酶基因表达的促进作用，是造成雄性鱼类体内雌激素E2含量升高的机制，且P450arom表达的升高可能进一步造成T含量的降低；久效磷农药促进20β-HSD mRNA表达，导致17α,20β-双羟孕酮含量升高；久效磷农药虽然引起P45011β、11β-HSD2mRNA表达水平的降低，但是本文结果表明其对11-KT含量无显着影响。综上所述，本文从胆固醇含量、StAR和类固醇生成酶mRNA的表达量以及性激素合成途径中涉及的中间产物及效应激素的含量叁个方面，探讨了久效磷农药对雄性金鱼性激素合成与转化的影响机制，研究表明久效磷农药造成雄性金鱼血浆中雄雌激素比例失衡主要是由于：(1)降低血浆中高密度脂蛋白胆固醇含量，抑制雄激素合成相关酶类mRNA表达，从而降低雄激素(主要为T)的合成；(2)促进雌激素合成相关酶类mRNA表达，进而提高雌激素(主要为E2)的合成。本文系统研究了结构与内源性激素并不相似的久效磷农药发挥环境雌激素效应的机制，以期为非典型环境雌激素(不能直接与激素受体相结合)的作用靶点研究提供一定的借鉴。
张玲[7]2006年在《1.金鱼雌核发育单倍体无腔眼和正常眼胚胎的蛋白质组研究 2.基于质谱的BLAST方法在金鱼胚胎蛋白质鉴定中的应用》文中进行了进一步梳理第一部分金鱼雌核发育单倍体胚胎无腔眼和正常眼胚胎的蛋白质组研究在金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中，一些对发育起关键作用的基因未能被选择表达或表达受阻而导致单倍体发育异常。在单倍体胚胎发育过程中出现了正常眼，泡状眼，无腔眼叁种表型，经统计分析表明，单倍体发育的胚胎数目以正常眼：泡状眼：无腔眼为1：2：1的比例分配。我们已研究证明Vsx1基因在单倍体胚胎中表达受阻，而导致了单倍体胚胎发育异常，其中正常眼单倍体胚胎中Vsx1基因能够表达，无腔眼中Vsx1的基因不能表达，泡状眼中两个基因一个表达，一个未表达。与二倍体相比，Vsx1基因在单倍体胚胎中未能被选择表达，可能与单倍体胚胎发育异常有关。为了揭示金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中的这种发育异常的机制，本文以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体形成的正常眼和无腔眼发育阶段的胚胎为材料，通过蛋白质表达水平上进行差异分析，试图探讨影响金鱼眼睛发育的基因表达调控机理。首先提取胚胎的全蛋白质，用SDS-PAGE和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，进行蛋白质点的分离，获得了分辨率较高的凝胶图谱。利用PDQUEST 2-D分析软件对扫描后的凝胶图象进行了处理，斑点检测，匹配和量化分析，得到差异蛋白质点，选取其中分辨好的差异蛋白质点进行原位胰蛋白酶酶解，再经MALDI-TOF-TOF和Q-TOF的MS／MS分析，通过MASCOT数据库及MS BLAST同源性搜索，一共鉴定到59个差异蛋白质点。通过生物信息学分析方法对这些差异蛋白质点的功能分析，发现了与眼睛发育，神经发育，细胞分化，体节形成，信号传导等相关的蛋白质。此外，通过Western blotting实验，某些重要差异蛋白质已得到了讲一步的验证。第二部分基于质谱的BLAST方法在未知基因组的金鱼蛋白质鉴定中的应用未知基因组及蛋白质序列数据库有限的物种的蛋白质组学分析是当前一些非模式生物物种蛋白质组学研究领域的瓶颈之一。基于同源性搜索的blast方法(MS BLAST)，是近年新发展起来的一种用于未知基因组的蛋白质鉴定的搜索工具，已成功应用于许多未知基因组物种的蛋白质鉴定。SPITC化学辅助方法是本实验室建立的一种改进的de novo质谱测序方法。我们采用MS BLAST方法对经Mascot软件数据库搜索未能鉴定到的19个金鱼胚胎蛋白质进行鉴定，其中12个蛋白质是直接测序后进行MS BLAST搜索得到的结果，另外7个蛋白质是联合MS BLAST和SPITC衍生方法得到的鉴定结果。实验结果证明了采用Ms BLAST方法进行蛋白质的跨物种鉴定具有可行性和可靠性，给蛋白质的跨物种鉴定提供了一条新的途径。
田华[8]2010年在《久效磷农药对金鱼（Carassius Auratus）生殖轴线的影响研究》文中认为久效磷是一种高毒的有机磷农药,可以诱导雄性金鱼卵黄原蛋白(vitellogenin, VTG) mRNA的表达和蛋白合成与分泌,具有潜在的环境雌激素活性,可能是通过干扰金鱼下丘脑-垂体-性腺轴(简称生殖轴线)对性激素分泌、调控完成的。本文检测了久效磷农药对雄性金鱼性激素水平的影响,并从芳香化酶(P450aromatase, P450arom)表达、促性腺激素(gonadotropins, GtHs)合成与分泌、促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormones, GnRHs)调控等多个层次探讨了久效磷农药影响内源性激素水平的原因,以期从生殖轴线的角度阐明与雌激素受体无亲和性的久效磷农药发挥环境雌激素活性的机制。此外,雌性鱼类生殖活动同样受到生殖轴线的调节,其调控机制与雄性鱼类类似,为了确定久效磷农药对雌性鱼类生殖系统和生殖内分泌系统的干扰作用,本文同时研究了久效磷农药对雌性金鱼生殖轴线的影响。本文研究结果表明：(1)0.01、0.10和1.00 mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后,采用放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)检测了血浆中性激素含量。结果表明：在雄鱼体内,睾酮(testosterone, T)基样含量较高,17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)含量极低；在雌鱼体内,E2基样含量较高,T含量较低；随着久效磷暴露浓度的升高金鱼血浆中T含量逐渐降低,E2含量逐渐升高,即E2/T比例逐渐升高,表明久效磷农药暴露影响了金鱼血浆性激素的水平,从而诱导雄性金鱼合成VTG,雌性金鱼卵巢增重。(2)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后,采用实时定量RT-PCR方法检测了性腺和下丘脑组织中P450arom mRNA表达水平。结果表明：随着久效磷农药暴露浓度的升高金鱼性腺P450aromA mRNA表达量逐渐升高,而下丘脑P450aromB表达无显着变化。因此,我们认为久效磷农药作用的特异性靶位点为性腺P450aromA,而非脑P450aromB,且其可能是通过提高金鱼性腺P450aromA的表达,促进了T向E2的转化,从而导致E2水平和E2/T比值的显着升高。(3)0.01、0.10和1.00mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后,采用实时定量RT-PCR方法检测了垂体组织中两种GtHsyβ亚基mRNA表达水平,包括卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黄体激素(luteinizing hormone, LH),采用RIA检测了血浆中LH、FSH的含量。结果表明：随着久效磷农药暴露浓度的升高金鱼FSHβ亚基mRNA表达和血浆水平逐渐升高,LHβ亚基mRNA表达和血浆水平逐渐降低。而FSH水平的升高会导致E2水平的升高,LH水平的降低会导致T水平的降低,从而进一步加强P450aromA基因表达升高所造成的雄雌激素比例的失衡。因此,我们认为生殖内分泌系统也是久效磷作用于金鱼生殖轴线的潜在靶位点,从而间接影响性激素合成与分泌。(4)0.01、0.10和1.00 mg/L久效磷农药暴露金鱼21天后,采用实时定量RT-PCR方法检测了下丘脑促性腺激素释放素sGnRH、cGnRH-ⅡmRNA表达水平。结果表明：随着久效磷农药暴露浓度的升高金鱼下丘脑sGnRH、cGnRH-ⅡmRNA表达水平均无显着变化。久效磷农药对金鱼神经内分泌调节的潜在影响尚需进一步研究。综上所述,本文从性腺性激素合成与转化、垂体GtHs合成与分泌、下丘脑GnRHs调控叁个层次,研究了久效磷农药对雄性、雌性金鱼下丘脑-垂体-性腺轴的干扰作用。本文首次提出了久效磷农药环境雌激素作用机制,证实了久效磷与E2等化合物不同,不是与雌激素受体直接结合发挥其雌激素效应,而是通过生殖轴线的其他位点。久效磷诱导雄性金鱼合成VTG主要通过：(1)使雄性金鱼性腺芳香化酶的基因表达显着增强,从而提高血浆中E2含量；(2)影响垂体GtHs表达与分泌,从而干扰生殖内分泌调节,间接影响性激素水平。同时,本文研究证实了久效磷亦可对雌性金鱼生殖轴线的多个位点产生干扰作用,从而诱导血浆E2水平升高并促进卵巢增重,对雌性鱼类发挥其生殖毒性。通过研究生殖轴线的系统干扰作用,将有利于我们理解化合物如何在生物体的多个水平(从分子效应到表征结果)引起系统范围内的应答效应,为农药的生态风险评价提供理论依据。
王姝妍[9]2013年在《古环境变化和人工选择对鲫属鱼类遗传结构的影响》文中认为第四纪冰期-间冰期多次交替,青藏高原隆升、东亚季风、对各大洲古环境均造成一定程度的影响,这种环境的变化对物种形成的作用可能会印记在遗传物质上并传递给下一代。研究广布物种现存的分布格局可以有助于我们深入理解古环境变化对物种多样性分布格局的重要作用。鲫属(Carassius)鱼类,是一种广布于欧亚大陆及其东部诸岛、具有较高的遗传多样性和上新世晚期起源的淡水鱼类。而且,鲫属鱼类的变种金鱼,在长期的以观赏为目的人工筛选下,其外部形态同鲫鱼相比表现出显着的变异。因此,对于我们探讨古环境变化和人工选择对物种遗传结构的作用,鲫属鱼类是良好的生物素材。首先,我们分析了来自中国大陆、台湾、日本本岛、琉球群岛和俄罗斯等覆盖了该物种全部分布范围的1876条鲫属样品的线粒体控制区和191条细胞色素B序列,结果显示鲫鱼复合种分为具有明显地理结构的叁大类群。其中类群A和B主要分布于日本,类群C主要分布于大陆、台湾及琉球群岛。类群C中包含6个具有明显地域性的亚类群(C1-C6)：其中亚类群C1仅分布于福建和越南,是大陆群体中最古老的类群；亚类群C2为主要分布于我国东北和新疆以及俄罗斯的银鲫,C3和C4仅在琉球群岛Tokara gap的南侧和中国大陆东南部有分布,C5主要分布于长江中下游,C6为全国广布。系统地理学和群体遗传学分析结果显示,尽管存在少量的人工引种(约占总量的10%),但是现存地理格局主要是受到古环境变化影响的结果。对分歧时间的估算表明,在大约3.0百万年以前,对马海峡间的陆桥消失所造成的地理隔离是中国大陆和日本类群间产生分歧的主要原因。随后由于受青藏高原隆升的影响东亚季风逐渐加强,在强大的干冷冬季风的影响下,大陆群体向南退缩至中国东南部的福建和越南,这些地区可能是鲫属鱼类在冰期时的避难所。而日本本岛较为古老的鲫属类群(A和B)则因为日本岛屿气候环境几乎不受东亚季风影响而被保留了下来。在更新世中期伴随着温暖潮湿夏季风的加强,位于避难所中的大陆群体向北辐射扩散重新占据中国大陆。而冰期-间冰期海平面变化和地质活动使得台湾、琉球群岛和中国大陆东部的淡水连接时有形成,东亚鲫鱼通过淡水连接经台湾扩散到达Tokara gap以南的琉球群岛中南部诸岛。其次,为了更加清晰的展现鲫属各个(亚)种以及地方类群间的系统发育关系,我们检测了来自119条鲫属样品的线粒体D-loop区,以及细胞色素B、COⅡ、 ND2、ND4和ND5等5个基因的序列。系统发育关系显示,黑鲫和鲫属复合种作为鲫属中独立的两个种,在距今大约4.0个百万年以前,就已经分离开来。日本白鲫和剩下的所有鲫属复合种形成姐妹类群,在大约2.54个百万年以前分歧出来。而且日本白鲫在染色体数目和分布范围上都有自己的特征。因此,我们认为将日本白鲫当做鲫属中的一个种来对待可能更为合理。主要分布于中国大陆的鲫属复合种,包含6个亚类群,其中所有的银鲫单倍型聚集在了一起形成单系,在距今大约0.60个百万年以前从鲫属复合种中分歧出来。系统发育关系和分歧时间的估算显示,银鲫可能起源于鲫属复合种中一个更为古老的亚类群C1。除此之外,我们的系统发育关系分析还显示,滇池高背鲫、普安鲫、彭泽鲫和金鱼的母系来源均为鲫属指明亚种或者银鲫。最后,我们收集了来自中国(昆明、杭州、北京、长春和兰州)、加拿大、韩国和日本的234条金鱼样品,分别检测了它们的线粒体控制区和细胞色素B(Cytb)序列,通过构建系统发育关系和分析各野生鲫鱼群体和金鱼间的遗传差异,试图揭示金鱼的母系起源,以及最初的驯养地点。结果显示所有的金鱼单倍型均和主要分布于中国南方的野生C. a. auratus聚在了一枝；通过对分布于中国8个流域野生鲫鱼群体和金鱼间的遗传差异的分析也表明,来自长江下流的野生群体和金鱼群体间拥有有最强的基因流。这一结果符合历史记载：金鱼的家养化可能开始于浙江杭州和嘉兴。通过对野生群体和金鱼之间、金鱼各品系间,遗传多样性水平的比较,以及中性检验,结果显示金鱼的驯化过程曾经经历过两次瓶颈作用,推测其人工驯化的过程可能包括最初的驯化(草系金鱼)和近代品系(文系和蛋系金鱼)的人工培育两个阶段。我们还对中国金鱼4个品系分类形态特征进行了评估,结果显示：相较于以眼睛特征作为分类依据的四分法(草系、蛋系、文系和龙系)和五分法(草系、蛋系、文系、龙系和龙背系),叁分法(草系、蛋系和文系)更符合金鱼的进化历史。根据鱼类背鳍的生物学作用,我们推测没有背鳍的蛋系金鱼应该出现在双尾鳍金鱼之后。我们的研究显示,第四纪古环境变化和以观赏为目的人工选择对鲫属鱼类遗传结构均造成了巨大影响。收集更多尤其是来自西伯利亚和远东的样品,检测更多的分子标记,可能有助于发现欧亚鲫属鱼类在早期进化中的类群,从而能更为清晰反映鲫属鱼类地理格局和各类群间系统发育关系。而检测同外形改变相关的基因,可能对我们进一步理解金鱼的人工驯化历史提供更多线索。
程晓洁[10]2008年在《久效磷对金鱼（Carassius auratus）的遗传毒性研究》文中研究表明久效磷能够诱导雄性金鱼卵黄原蛋白的产生,具有环境雌激素效应和生殖毒性,但关于久效磷遗传毒性的研究报道还很少。本文以金鱼(Carassius Auratus)为试验对象,研究了久效磷对金鱼DNA的损伤,从久效磷导致DNA损伤的类型、导致DNA氧化损伤的量、对抗氧化酶的影响以及对端粒DNA的损伤四个方面探讨了久效磷对金鱼的DNA损伤的机理,为筛选农药的遗传毒性提供理论依据。0.01、0.10和1.00 mg/L久效磷暴露金鱼24 h,金鱼的外周血细胞和肝细胞DNA的损伤与对照相比显着升高;暴露48 h时损伤达到峰值;暴露96 h,损伤有所减轻;1周后损伤降到最低,但与对照相比仍存在极显着差异。在相同的暴露时间下,金鱼外周血细胞DNA损伤随着久效磷暴露浓度的升高而加重,具有剂量-效应关系。通过不同pH条件下的单细胞凝胶电泳和在电泳中添加EndoⅢ和FPG酶处理发现:久效磷暴露48 h,导致了金鱼外周血细胞和肝细胞DNA单链断裂、双链断裂,产生碱不稳定位点,而碱不稳定位点的大量产生是DNA损伤的主要类型;久效磷可以导致金鱼外周血细胞和肝细胞DNA中氧化嘧啶和嘌呤的量显着升高。久效磷暴露可以造成金鱼外周血和肝脏氧化压力的升高。金鱼外周血GPH-Px随着暴露时间延长先降低再升高,96 h达到峰值;肝脏的GPH-Px活性变化趋势也是先降低再升高,在1周达到峰值。金鱼外周血SOD活性无显着变化;肝脏的SOD活性先降低再升高,1周达到峰值。外周血MDA含量24 h降低,48 h升高达到峰值,随后逐渐降低;而肝脏MDA含量24 h显着升高并达到峰值,随后逐渐升高。久效磷暴露48 h可以导致金鱼外周血红细胞端粒DNA的损伤,并且随着暴露浓度的增加,端粒DNA损伤加重,而端粒对氧化损伤比较敏感,又进一步佐证了久效磷导致DNA损伤主要为氧化损伤。综上所述,久效磷对金鱼具有遗传毒性作用,造成了金鱼外周血细胞和肝细胞DNA的损伤,DNA的损伤类型为单链断裂、双链断裂和碱不稳定位点,且碱不稳定位点为久效磷导致DNA损伤的主要形式;久效磷导致了金鱼氧化嘌呤和嘧啶量的显着增加,说明其造成金鱼DNA的氧化损伤;久效磷可以导致金鱼外周血和肝脏氧化压力的升高;同时,久效磷暴露48 h能够导致金鱼外周血端粒的损伤,而端粒对氧化损伤比较敏感,因此,本文研究结果表明久效磷对金鱼DNA的损伤主要为氧化损伤。
参考文献：
[1]. 金鱼雌核发育单倍体与正常二倍体胚胎蛋白质组研究[D]. 徐东. 湖南师范大学. 2008
[2]. 金鱼(Carassius auratus)雌核发育单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究[C]. 黄凌云, 罗琛, 谢锦云, 梁宋平. 中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集. 2003
[3]. 金鱼(Carassius auratus)雌核发育过程中的单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究[C]. 周新文, 张玲, 罗琛, 谢锦云, 陈平. 中国蛋白质组学第二届学术大会论文摘要论文集. 2004
[4]. 金鱼（Carassius auratus）雌核发育单倍体和二倍体胚胎蛋白质组比较研究[D]. 黄凌云. 湖南师范大学. 2003
[5]. 久效磷对金鱼（Carassius auratus）甲状腺轴的干扰效应及作用机制研究[D]. 张晓娜. 中国海洋大学. 2014
[6]. 久效磷农药对雄性金鱼（Carassius auratus）性激素合成与转化的影响机制研究[D]. 王慧. 中国海洋大学. 2013
[7]. 1.金鱼雌核发育单倍体无腔眼和正常眼胚胎的蛋白质组研究 2.基于质谱的BLAST方法在金鱼胚胎蛋白质鉴定中的应用[D]. 张玲. 湖南师范大学. 2006
[8]. 久效磷农药对金鱼（Carassius Auratus）生殖轴线的影响研究[D]. 田华. 中国海洋大学. 2010
[9]. 古环境变化和人工选择对鲫属鱼类遗传结构的影响[D]. 王姝妍. 中国科学技术大学. 2013
[10]. 久效磷对金鱼（Carassius auratus）的遗传毒性研究[D]. 程晓洁. 中国海洋大学. 2008
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