Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗研究

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV）引起的、以偶蹄动物发病为主的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。FMD是对畜牧业发展威胁最大烈性传染病之一,被世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health,OIE）列为必须报告的动物疫病。目前,包括我国在内的许多国家,采取免疫接种疫苗的措施控制口蹄疫。不同时期,口蹄疫弱毒疫苗、灭活疫苗等使用,在控制口蹄疫的大流行中发挥了重要作用。弱毒疫苗因毒力返强引起口蹄疫流行而被停用。目前,大多使用的灭活疫苗,虽然较弱毒疫苗安全,但在病毒大量培养和灭活等生产过程中仍然存在极大的生物安全风险,而且对疫苗生产的设施条件要求高,同样存在灭活不完全而引起口蹄疫暴发的风险。因此,需要研究安全、有效的口蹄疫新型疫苗。随着免疫学和基因工程技术的快速发展,表达口蹄疫病毒主要功能结构蛋白基因,在体外组装病毒样颗粒,以此为抗原研制疫苗成为口蹄疫疫苗研究热点。本研究利用原核表达系统,将Asia 1型口蹄疫病毒的VP0、VP1、VP3结构蛋白基因克隆到表达载体上,构建重组菌,诱导表达Asia 1型口蹄疫病毒的VP0、VP1、VP3蛋白,体外组装成Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒,配制疫苗以期获得良好的免疫效果。1.重组表达菌的构建:以酿酒酵母基因组DNA为模板,扩增smt3基因,插入到pET-28a载体得到pSMK载体,用氨苄抗性基因（AmpR）替换pSMK载体的卡那霉素抗性基因（KanR）,获得pSMA载体。将编码Asia 1型口蹄疫病毒（Asia1/JSL/06株）的结构蛋白基因VP0、VP3、VP1分别克隆到pSMK、pSMA和pSMK,得到重组表达载体pSMK/VP0、pSMA/VP3和pSMK/VP1。以pSMK/VP1为模板,扩增VP1基因的DNA片段,插到pSMK/VP0载体,获得双表达重组载体pSMK/VP0-VP1。将pSMA/VP3和pSMK/VP0-VP1载体共转化到表达菌BL21（DE3）感受态细胞,获得重组菌种,命名为BL21（pSMK/VP0/VP1/VP3）。2.Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒蛋白抗原表达:将BL21（pSMK/VP0/VP1/VP3）重组菌种转接于含卡拉霉素抗性的LB培养液中培养到对数生长期,加入诱导剂IPTG诱导表达重组融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现,大部分融合蛋白（VP0/VP1/VP3）以水溶性形式表达。Western blot试验证实,该融合蛋白能够被抗Asia 1病毒的阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性,纯化后的融合蛋白用小泛素样蛋白酶酶切、组装,透射电镜观察可观察到与亲本口蹄疫病毒抗原空衣壳形态和大小相似的75S的粒子,即Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒。3.安全性和免疫原性的研究:以不同含量的Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒为抗原,与Montanide ISA 206佐剂1:1混合乳化制备成Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗,免疫豚鼠、猪和牛,研究Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒抗原的安全性和免疫原性。在10天观察期内,所有试验动物精神状态良好、均无明显的临床不良反应,证实Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒对试验动物安全。采用液相阻断ELSIA方法检测免疫试验动物血清中的Asia 1型口蹄疫病毒抗体,结果显示猪和牛在免疫后21d28d抗体达到高峰,87.5%（14/16）的动物Asia 1型口蹄疫特异性抗体阳性;攻毒试验,对猪和牛的保护比例分别为15/16和14/16,证实该病毒样颗粒能诱导动物机体产生免疫应答反应。4.疫苗中适宜抗原含量确定:用每头份分别含200μg、100μg、50μg和25μg的Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备疫苗,免疫猪和牛。牛免疫21天、猪免疫28天后用Asia 1/JSL/GSZY/06攻毒。发现前3种含量的疫苗免疫动物的保护率均高于75%,免疫合格率均高于70%;25μg含量组的疫苗免疫动物保护率低于75%,免疫合格率低于70%。参考OIE和我国农业农村部标准,为确保疫苗免疫效果,将Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的抗原含量确定为100μg/头份。5.疫苗免疫效力实验:用实验室制备的Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫牛和猪,牛免疫21天、猪免疫28天后,用Asia 1/JSL/GSZY/06攻毒,研究疫苗的免疫效力。结果,疫苗对牛和猪的保护率均为95.8%（46/48）;且免疫合格率均为87.5%（42/48）,符合口蹄疫疫苗质量标准。6.疫苗免疫持续期研究:用实验室制备的3批Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫牛和猪。免疫后第1、2、3、4、5、6和7个月采血,检测免疫抗体。免疫后第6个月和7个月时用Asia 1/JSL/GSZY/06攻毒,研究疫苗免疫动物的抗体消长情况及免疫持续期。结果,免疫牛和猪体内抗体消长情况基本一致,均在免疫后的13个月保持较高的抗体水平,随后逐渐下降,至免疫后第6个月时,疫苗免疫合格率均已接近70%;免疫后7个月时,免疫合格率均已低于70%。免疫动物攻毒结果表明,免疫6个月时,疫苗免疫牛和猪攻毒保护率均高于75%,免疫7个月时,仅1批疫苗免疫牛的保护率高于75%,其他免疫组动物攻毒保护率均低于75%。据此,确定该疫苗的免疫持续期约为6个月。以上研究结果表明,体外制备的Asia 1型口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫试验动物后,对试验动物安全,能诱导机体产生免疫应答反应并可有效抵抗Asia 1型口蹄疫强毒攻击,免疫持续期约6个月,具备应用和推广价值,为今后继续开展O型和A型病毒颗粒疫苗奠定了基础。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 靳野

导师: 余四九,刘湘涛

关键词: 型口蹄疫,病毒样颗粒,免疫效力,免疫持续期

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学

基金: 科技基础性工作专项“口蹄疫病毒检测标准物质研制(2013FY113300-7)”,国家重点研发计划课题“兽用生物制品质量检验和控制标准(2017YFF0208603)”,国家自然科学基金面上项目(31873023),中农威特生物科技股份有限公司,四川省华派生物制药有限公司

分类号: S852.65

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000228

总页数: 93

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