高嵩[1]2003年在《利用聚合酶链反应（PCR）鉴定小鼠早期胚胎性别的研究》文中研究表明哺乳动物早期胚胎性别鉴定是生物领域的一项重大课题，同时也是胚胎工程的一个重要环节。本实验采用PCR方法，通过SRY／Sry基因的序列分析、特异性引物的设计以及PCR检测等环节完成了对小鼠早期胚胎的性别鉴定，并建立了一套完整的PCR扩增体系。 本实验通过对几种哺乳动物SRY／Sry基因核心序列的分析，分别设计出特异于小鼠、人以及牛的叁对PCR扩增引物，这叁对引物对雄性小鼠白细胞Sry基因的扩增率分别为96.7％、86.7％和26.7％，前两者差异不显着(p＞0.05)；前两者与后者差异显着(p＜0.05)。扩增效果最好的为特异于小鼠Sry基因的第一对引物，其序列为：上游(Sry1)：5’GGCTACTTACGGAAGTACCAC 3’；下游(Sry2)：5’GCCTATGAAGAGCGCCACGTC 3’。采用该对引物，分别以10mmol/L、15mmol/L、25mmol/L以及30mmol/L的Mg~(2+)浓度配成PCR反应缓冲液扩增雄性小鼠白细胞Sry，扩增率分别为30％、60％、100％和100％，前两者均显着低于后两者(p＜0.05)。将PCR循环次数分别设为25、36和50，扩增结果基本一致，但以36次为宜。经测序，扩增产物长度为192bp，且与小鼠Sry基因核心序列相符率为98.4％，差异不显着(p＞0.05)。采用确定后的最适宜PCR扩增体系扩增12枚小鼠孤雌胚，结果无一出现特异扩增带，鉴定准确率为100％。对随机抽取的小鼠8-细胞期、16-细胞期、桑椹期以及囊胚期胚胎进行PCR检测，阳性胚胎率分别为13.3％、36.7％、46.7％和43.3％，与50％的理论值相比较，除第一组外(p＜0.05)，差异均不显着(p＞0.05)。本实验建立的PCR扩增体系对于16-细胞期以后(包括16-细胞期)小鼠胚胎的性别鉴定具有较高的可信度，但还不能完全对早于8-细胞期(包括8-细胞期)的胚胎进行PCR检测。因此，今后工作的重点应放在完善实验条件、提高PCR扩增体系对超微量DNA模板的扩增能力即检测灵敏度等方面。
付强[2]2006年在《水牛SRY基因及胚胎性别鉴定技术的研究》文中研究说明本论文研究内容是水牛SRY基因和胚胎性别鉴定PCR体系的建立和优化。论文共分为两部分：第一部分，包括第一章和第二章，为文献综述部分；第二部分，包括第叁章和第四章，为试验研究部分。 第叁章研究目的是通过对水牛SRY基因的克隆、序列分析及Southern杂交检测，为进一步研究SRY基因的作用机理和设计特异于水牛SRY基因的胚胎性别鉴定引物打下基础。根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物，PCR扩增后得到水牛SRY基因，测序后分析表明，该基因长度为2005bp，其中1～504bp为5’启动子区(Promoter)，1196～2005bp为3’侧翼序列(UTR)，505～1195bp为SRY的读码框(ORF)。将该基因序列提交到GenBank数据库(登录号为DQ 417872)。BLAST比对显示，与牛属动物的同源性为95％～96％，其中HMG-box区的同源性高达99％，具有高度的进化保守性。使用ClustalX对水牛SRY基因外显子区域做多重比对分析后，构建部分哺乳动物系统进化树，与实际进化关系保持很好的一致。在SRY基因保守区设计探针，分别对雄性水牛和雌性水牛基因组进行Southern杂交，只在雄性水牛出现杂交信号，说明SRY基因为雄性特异。 第四章研究目的是建立并优化水牛胚胎性别鉴定的PCR体系，以便该项技术能在生产中大规模应用。根据第叁章中水牛SRY基因核心序列设计两对特异于水牛的性别鉴定引物SA1／SA2、SB1／SB2，根据小鼠ZFX／ZFY基因和水牛G3PDH基因分别设计内参引物ZA1／ZA2、GA1／GA2。对不同
赵雪[3]2003年在《牛早期胚胎性别鉴定的PCR方法的研究》文中研究说明在畜牧业生产实践中，往往需要人为控制家畜的性别及比例，加速优良品种繁育，扩大优良母畜的利用率，因而，牛早期胚胎性别鉴定就成了人们关注的研究课题。目前的研究主要集中于在传统的细胞遗传学基础上，运用分子生物学等先进手段提高牛早期胚胎性别鉴定的准确率和鉴定速度，以满足生产实际的需要。 本试验以牛全血为试验材料，提取基因组DNA，采用PCR技术扩增牛Y染色体特异性DNA片段，优化性别鉴定的PCR条件，同时利用PCR技术对牛SRY基因进行扩增、克隆和序列分析，为PCR法鉴定牛早期胚胎性别用于生产实践打下研究基础。本试验取得了以下结果： 1．建立了提取高质量牛基因组DNA的方法。 2．确定了进行牛早期胚胎性别鉴定的连续复合PCR技术，即在双引物的存在下，实现了两种基因片段的同时扩增；确定了PCR的最佳反应条件，先在反应体系中加入一对Y—特异性引物扩增一段时间，再加入牛特异性引物继续进行扩增，保证了性别鉴定的强特异性和高敏感性，使性别鉴定过程在2个小时内可以完成。牛胚胎性别鉴定的鉴定率为95.24％。建立了一种行之有效的鉴定牛早期胚胎性别的PCR方法。 3．利用PCR技术扩增出牛SRY基因并对其进行了克隆和序列分析。以公牛全血基因组DNA为模板，在一对特异性引物的引导下，确定出PCR反应的最佳条件。得到的PCR产物使用UNIQ—10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收和纯化，然后将该片段连接到pMD-18T载体上，转化感受态大肠杆菌，提取质粒DNA进行鉴定和序列测定。本试验扩增的牛SRY基因由2713个核苷酸组成，与NCBI中公布的牛SRY基因进行比较，上游的同源性为98.7％，下游的同源性为98.1％。与其他物种同源性比较结果显示，SRY基因有一定的同源性，说明SRY基因在物种进化过程中有一定的保守性，同时也有一定的变异，为设计具有针对性的特异性引物提供了依据，可以使性别鉴定的准确性和特异性得到保证。
何允[4]2012年在《小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究》文中认为哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。在畜牧业生产中,通过性别控制能够建立优化商品畜群,充分发挥母畜的繁殖能力及公畜的生长优势,提高畜产品经济效益,并能够在生产前排除潜在有害基因型,防止性连锁疾病；在分子生物学、胚胎细胞学及发育遗传学等基础学科的研究中,胚胎性别鉴定是探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实现肿瘤分子调控等热点研究课题的环节之一；胚胎成纤维细胞具有细胞体积大数目多、来源广泛且取材方便以及在体外培养条件下能够迅速生长繁殖,并且能够长期传代等优点,广泛应用于胚胎干细胞的分离与培养、体细胞克隆与核移植等课题的研究,因此小鼠早期胚胎及成纤维细胞的性别鉴定在畜牧生产、遗传育种、胚胎发育学及临床应用范围内均具有实用价值。本课题使用双重PCR法对小鼠附植前8-细胞胚胎以及小鼠胎儿成纤维细胞进行了性别鉴定,旨在探寻一种简便可靠的双重PCR性别鉴定方法,为小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植等研究提供参考。具体内容包括：(1)引物设计及其合理性检测：以雄性特异性SRY基因序列设计了一对特异性引物,即上游引物SRY250U:5’-CTTTTTCCAGGAGGCACAGA-3’及下游引物SRY250L:5’-GACAGGCTGCCAATAAAAGC-3’;以雄性及雌性共有的锌指结构ZFX基因序列设计另一对内标引物,ZFX399U 5’-AAGAGAGTCCATTCAAGTGTGA-3’为上游引物,ZXF399L: 5’-GCTACCTTTGTTGCCGAAAT-3’为下游引物；使用离心柱式动物基因组DNA提取试剂盒提取小鼠肝脏组织DNA基因组作为模板,在适宜的反应体系及条件下,分别用两对引物进行体外扩增,扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳进行结果检测。结果表明SRY基因引物对能够对雄性基因组扩增出约250bp的目标条带,雌性基因组扩增结果为空白,而ZFX基因引物对可对雄性及雌性小鼠肝脏组织基因组均扩增出399bp大小的目标条带；使用已知性别小鼠肝脏基因组为模板,同时用两对引物进行扩增,结果雄性小鼠扩增结果为内标条带及判断条带同时存在,而雌性小鼠扩增结果为399bp一个条带,说明试验所设计引物具备有效性及合理性；(2)将适龄健康的雌鼠注射PMSG和hCG后与雄鼠合笼,将见栓后2d的雌鼠进行无菌手术,取出子宫并以M2操作液冲洗,得到2.5d胚龄的胚胎。将所得胚胎经0.5%链霉蛋白酶于37℃处理30s去除透明带,M2操作液洗涤后,从每个8-细胞胚胎吸取4个卵裂球用于性别鉴定；将卵裂球加入8μL ddH_((2))O后以5μL石蜡油覆盖,恒温煮沸5mmin后-20℃冰浴5min,14000rpm离心2mmin,取上清液用于扩增,扩增体系为：ddH_((2))O7μl；10×Buffer 3μl；Mg~((2=))=2μl；10×Taq Buffer 2.5μl；dNTP 3μl；引物P11μl；引物P_((2)) 1μl；DNA样本5μl；Taq酶1.5μl；反应条件为：预变性94℃,5min；变性94℃,30s；退火60℃,35s；延伸72℃,40s,共30个循环；72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对40枚小鼠附植前胚胎进行性别鉴定,结果显示其中20枚胚胎电泳检测扩增结果出现250bp大小的判断条带及399bp大小的内标条带,由此判断此20枚附植前胚胎为雄性胚胎；12枚8-细胞胚胎卵裂球提取DNA后进行体外扩增后,电泳结果显示399bp大小的内标条带,判断条带为阴性,因此判断为雌性胚胎；另有8枚胚胎因条带缺失或模糊不明无法进行性别判断。性别鉴定成功率为80.00%。(3)将适龄健康的雌鼠注射激素后与雄鼠合笼,13d后将雌鼠处死进行无菌手术,摘取完整子宫并以取出13.5d胎龄的胎鼠用于分离MEFs；将所得MEFs的细胞密度调整至1×106个/ml,于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养,每24h换液一次,待80-90%细胞贴壁时进行传代培养,并观察贴壁情况,得出F3代MEF贴壁及发育状况均优于其他代细胞；取第3代MEFs按离心柱型细胞基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；使用自主设计的SRY基因引物及ZFX基因引物对MEFs DNA进行体外扩增,扩增体系为：ddH_((2))O 7μl；10×Buffer 3μl；Mg~((2=))2μl；10×Taq Buffer 2.5μl；dNTP 3μl；引物P1 1μl；引物P_((2))1μl；DNA样本5μl；Taq酶1.5μl；反应条件为：预变性94℃,5min；变性94℃,30s；退火60℃,35s；延伸72℃,40s,共30个循环；72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对30只小鼠13.5d胎儿所制备的第3代MEFs进行了性别鉴定,结果表明其中13个MEFs为雄性,电泳结果同时显示大小为250bp的判断条带及399bp大小的内标条带,7个MEFs为雌性,其DNA样本体外扩增电泳结果仅显示ZFX基因内标条带,另有10个细胞系由于条带缺失无法进行性别判断,其检出率为66.67%。本试验自主设计了雄性小鼠特异性SRY基因引物对及雌雄小鼠共有的ZXF基因引物对,并以已知性别小鼠肝脏基因组作为模板进行体外扩增,对引物合理性及有效性进行了检测,成功地建立了双重PCR性别鉴定体系；根据此体系对小鼠附植前胚胎及MEFs进行了双重PCR性别鉴定,其检出率分别达到80.00%及66.67%。通过对试验结果的分析讨论得出,从8-细胞胚胎中吸取4个卵裂球为体外扩增的适宜模板量,从13.5d胎龄制备的MEFs经过3次传代后贴壁发育情况较优,适宜用于提取基因组进行性别鉴定,此结论对小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植的研究提供了参考,具有一定实际意义。
宋淑珍[5]2007年在《绵羊性别鉴定PCR方法的研究》文中研究说明本文通过对绵羊性别决定基因检测多重和巢式PCR体系的建立及优化、性染色体引物的特异性检测，建立了绵羊性别决定基因检测的PCR方法，并讨论了影响PCR扩增的几个因素以及它们之间的相互关系。主要内容包括：(1)从GenBank中检索到长度为723bp的绵羊SRY基因序列作为Y染色体特异序列，长度为3249bp的β-B-珠蛋白基因作为常染色体内标基因序列，利用Primer 3软件，设计了长度均为20bp性染色体巢式引物SRY337、SRY193和常染色体的巢式引物G559、G278。(2)对所设计的引物进行筛选组合，建立了绵羊早期胚胎性别鉴定的多重和多重巢式PCR反应体系。(3)对多重PCR体系用4×3×4因子组合析因设计实验(dNTP的终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM；Mg2+浓度分别为1.5mM、2mM、2.5mM、3mM：温度分别为58℃、60℃、62℃)确定了dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度的最优组合，优化了扩增程序。对巢式PCR体系第二轮扩增进行了不同dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度、以及不同扩增程序的筛选和优化。(4)用本试验中所采用的SRY巢式引物分别对人、牛、兔基因组DNA及淋巴细胞缓冲液进行扩增，检测引物的特异性和分析性别鉴定过程中可能存在的污染因素。绵羊肝组织基因组扩增结果表明：公羊可同时扩增出性染色体和常染色体片段，而母羊只能扩增出常染色体片段，引物特异性高，外引物间、内引物间扩增温度相差不大，可进行多重扩增。通过析因试验筛选的最优多重PCR性别鉴定体系为：SRY337、G559的浓度分别为0.4州，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为300μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—58℃退火30s—72℃延伸20s}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。优化后的多重PCR体系扩增公羊肝组织基因组，灵敏度为100pg。在巢式PCR中，以建立的最优多重PCR体系进行第一轮扩增20个循环后，析出5μl进行第二轮扩增，其最优反应体系为：SRY193、G278浓度均为0.4μM，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为200μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—64℃退火延伸20s—}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。本多重巢式PCR性别鉴定体系的灵敏度为100fg(1个细胞约5pg)，4细胞的DNA就可扩增鉴定结果，总鉴定时间约为110min。特异性检测结果表明：SRY基因引物只对羊、牛雄性特异，其他动物雄性DNA及淋巴细胞缓冲液均不影响检测结果。本实验所建立的巢式PCR体系相对简单、快速、准确率高，完全可以在生产实践中用来鉴定绵羊性别。
肖海霞[6]2006年在《应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究》文中研究表明在畜牧业生产实践中，往往需要人为控制家畜的性别及比例，加速优良品种繁育，扩大优良母畜的利用率，因而，性别控制技术在畜牧生产上具有重要的意义。随着农业产业化的进程，特别是牛羊胚胎工程产业化的迅速发展，运用性别控制技术来加快这种产业化的进程显得越来越重要。本研究旨在通过用PCR法、LAMP法进行牛早期胚胎性别鉴定的研究和应用，从而确立可以在实际应用中被推广的性别控制方法，提高养殖场和农户的经济效益，进而推动新疆乃至全国养牛业的发展。本研究主要做了以下方面的研究： 1．通过设计特异性引物，改变Mg~(2+)浓度、退火温度、调整循环条件等影响PCR的因素，并且经过不同样品的验证，最终确定适合生产实践的PCR反应体系为： 双重PCR反应体系总体积为25μl：2.5μl 10×Buffer，1.5mM Mg~(2+)，0.2mM dNTP，2U TaqDNA聚合酶，性控引物浓度为0.4μM(P0)，内标引物浓度为0.15μM(P4)(性控和内标引物可单独加入同一反应液里)。94℃预变性5min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s；72℃延伸5min，33个循环。 巢式PCR第一次反应体系总体积为10μl：1μl 10×Buffer，2.5mM Mg~(2+)，0.2mM dNTP，1U TaqDNA聚合酶，各引物浓度(P1，P5)为0.1μM。94℃预变性4min，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s；72℃延伸2min，20个循环；第二次反应体系总体积为20μl，2μl10×Buffer，2.5mM Mg~(2+)，0.2 mM dNTP，2U TaqDNA聚合酶，各引物浓度均为0.25μM。94℃预变性5min，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃30 s；72℃延伸5min，30个循环。 通过不同样品的试验和46枚胚胎现场的应用，证明建立的PCR胚胎性别鉴定方法可用于生产实践。 2．LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法是一种新的基因扩增技术，具有简便、准确、灵敏、快速的特点；通过不同样品、现场126枚常规胚胎和42枚性控胚胎的鉴定，结果证明该方法可应用于牛早期胚胎性别鉴定。 3．PCR法和LAMP法所鉴定同一样品的结果是吻合的，说明在控制好实验条件的情况下，根据实际情况可选用这两种方法的任何一种进行牛早期胚胎的性别鉴定应用。
赵雪[7]2011年在《奶牛性别控制技术研究》文中研究表明胚胎性别鉴定技术和性别控制技术为哺乳动物胚胎工程核心技术之一，该技术的优化和成熟，对胚胎工程技术在生产实践上的广泛应用具有重要的经济意义。本研究通过对奶牛胚胎体外生产过程中多个环节进行优化进行性别控制。包括（1）利用不同免疫方式免疫动物，制备高效价H-Y抗体，筛选雌性胚胎；（2）优化胚胎体外生产（IVP）技术关键条件，包括卵母细胞体外成熟条件、性控精液的分离方法、性控精液的密度、胚胎的体外培养液挑选等环节；（3）研究了卵巢输送时保存温度对卵母细胞的回收、成熟、性控精液体外受精、胚胎发育及两种应激基因Hsp70.1和Bax在囊胚中的表达的影响；（4）研究胚胎性别控制技术联合胚胎冷冻技术对牛胚胎体外发育、胚胎质量及其牛犊出生率的影响等研究。得到如下结果与结论：（1）利用免疫动物制备H-Y抗原抗体，与早期胚胎共培养筛选雌性胚胎，结果表明4-8Cell胚胎采用H-Y抗原抑制的方法不能进行准确的性别鉴定，桑葚胚采用H-Y抗原抑制的方法雌性胚胎的PCR验证结果为81.5%，说明选择性阻滞胚胎发育为一种比较可靠雌性胚胎选择的方法。（2）EGF和IGF-Ⅰ联合应用能够促进牛卵母细胞的体外成熟，提高IVF胚胎的体外发育能力；Percoll梯度离心法与上浮法的精子IVF胚胎的发育能力差异不显着(P>0.05)；0.5×106个/ml的精子密度比较适合，可提高性控精液的利用率；mSOF和G1/G2更适合与性控精液IVF胚胎的培养，其中G1/G2是商品化培养液，效果稳定；利用最优化的条件，比较性控精液与普通精液IVF胚胎发育率，发现X精子、Y精子和未分离精子的卵裂率和囊胚率无显着差异， X精子IVF胚胎雌性率为89.9%（62/69），未分离精子雌雄比例为47.9：52.1。（3）卵巢运输温度对性控精液的体外受精率及受精后胚胎的发育有显着的影响。卵巢在35°C保存3-4h显着降低了A、B级卵母细胞的回收率，卵母细胞的成熟率、性控精液的受精率及囊胚的发育率，同时第七天囊胚内的细胞凋亡率及Hsp70.1和Bax的表达显着升高。来源于25°C保存卵巢的卵母细胞受精率显着高于其它两组。（4）性控精液获得的IVF胚胎冷冻后，其复活率和24h孵化率，同对照组相比差异不显着,但非性控精液的IVF冷冻胚胎解冻后，48h的孵化率高于性控组。两组囊胚的细胞凋亡率没有显着性差异。两组囊胚内细胞团细胞与滋养层细胞数之间的比例分别为0.26±0.13和0.24±0.09，二者差异不显着。性控胚胎和非性控胚胎移植后的妊娠率、出生率以及性控效率差异不显着。
唐纪伟[8]2011年在《牙釉质基因鉴定山羊早期胚胎性别的研究》文中认为山羊的牙釉质(AMEL)基因定位于X和Y染色体上的同源区,根据AMEL基因在X和Y染色体同源区上存在不同程度碱基缺失的特点,设计巢式引物,就PCR引物准确性检测、超微量DNA鉴定方法的建立、胚胎DNA扩增及鲜胚移植等方面进行了研究,旨在利用巢式PCR扩增AMEL基因建立一种早期胚胎性别鉴定的方法。研究结果如下:1.对AMEL基因巢式引物的内引物和外引物分别扩增山羊血液基因组DNA,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳、EB染色,外引物经扩增后雌性山羊只得到一条349 bp的来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的349 bp的扩增条带和一条源自Y染色体的289 bp的扩增条带。内引物经扩增后雌性山羊只得到一条311 bp的来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的311 bp的扩增条带和一条源自Y染色体的251 bp的扩增条带。46个山羊血液DNA样本(22F,24M)经性别鉴定后与实际性别比较,准确率为100%(22F/22F,24M/24M)。2.对6只山羊(3F,3M)10 pg量血液基因组DNA(约3个细胞)进行巢式PCR扩增,雌性山羊只得到一条来自X染色体的扩增条带,而雄性山羊能得到一条源自X染色体的扩增条带和一条源自Y染色体的扩增条带。3.利用超数排卵技术获得86枚可用胚胎,36枚胚胎用于性别鉴定,33枚有扩增结果,雌雄性别比为16F/17M;50枚胚胎移植给50只受体山羊,产羔27只,胚胎移植妊娠率为54%(27/50),雌雄比为12F/15M。胚胎性别鉴定的雌雄性别比率与胚胎移植后产羔性别比率无明显差异(P>0.05)。
洪桂云[9]2003年在《PCR法鉴别哺乳动物胚胎性别的研究》文中研究表明本实验建立了用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术体外扩增哺乳动物SRY特异序列鉴别哺乳动物胚胎性别的方法。依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物Sry基因高度同源性设计一对SRY引物，两条引物均为22个碱基，对公牛的SRY特异的163bp序列进行体外扩增。从公、母牛的组织或血液提取基因组DNA，用作PCR扩增基因组DNA的模板，同时在立体显微镜下收集羊-兔异种克隆胚胎，先用0.145mol／L NaCl冲洗2次，再移入20μL胚胎处理液中(10mmol／L Tris-HCl pH8.3，50mmol／L KCl，2mmol／L MgCl_2，0.45％NP-40，0.45％Tween-20，0.1μg／μL蛋白酶K)，将羊-兔异种克隆胚胎及其处理液在55℃水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR扩增胚胎DNA的模板。按照析因设计，建立最适PCR扩增牛基因组DNA和羊-兔异种克隆胚胎DNA条件：反应体系中加入无MgCl_2的缓冲液和3×2×3因子组合浓度的SRY引物(每种引物浓度分别为：0.1μmol／L，0.3μmol／L，0.5μmol／L)，dNTPs(浓度分别为：0.1mmol／L，0.2mmol／L)和MgCl_2(浓度分别为：0.75mmol／L，1.5mmol／L，2.25mmol／L)；模板为公牛基因组DNA(2μL约100ng)或羊-兔异种克隆胚胎溶解物20μL；2IU Taq DNA聚合酶。反应体系为50μL。反应在微机控制Flexigene型PCR仪上进行，反应参数为：95℃预变性5min后，按95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行30或35个循环后，72℃延伸9min，于4℃结束反应。扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用PCR Marker作分子量标准，紫外灯下观察，最适PCR反应条件为扩增出最强的SRY产物带而无非特异性扩增带出现时的反应条件。结果表明：SRY引物扩增牛基因组DNA时，PCR最适条件为：0.1μmol／L SRY引物，0.1mmol／L dNTPs和1.5mmol／LMg~(2+)，退火温度为58℃，循环次数30次；SRY引物扩增胚胎DNA时，PCR扩增最适条件为：0.5μmol／L SRY引物，0.1mmol／L dNTPs和1.5mmol／L Mg~(2+)，退火温度为58℃，循环次数35次。 采用PCR扩增牛基因组DNA最适条件分别扩增了黑白花奶牛9头(6，3)、皖北黄牛11头(3，8)、波尔叁羊3只(2，1)、兔4只(1，3)和猪7头(3，4)的基因组DNA。所有雄性样品中均出现清晰可见的特异DNA扩增带，而雌性样品和空白对照中无扩增片段出现。同时采用PCR扩增羊-兔异种克隆胚胎DNA最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA(4个胚胎的供体为公羊，11个胚胎的供体为母羊)，所有以公羊为供体的羊-兔异种克隆胚胎样品均出现清晰可见的特异DNA扩增条带，而以母羊为供体的羊－兔异种克隆胚胎样品和空白对照中无扩增片段出现。结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物的性别以及鉴别哺乳动物胚胎的性别，而且用此法鉴定哺乳动物早期胚胎性别具有相对简单、快速、费用低和准确率高等优点。 本实验还采用设计的性别鉴定引物，按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。经实验该性别鉴定试剂盒使用准确性高，可降低污染，方法简便易行，成本低，在生产实践中有很大的实用价值。
王晗[10]2005年在《PCR法进行小鼠和牛的性别鉴定》文中提出家畜胚胎的性别鉴定是胚胎移植的重要组成部分。通过移植已知性别的胚胎,可使家畜达到理想的性别比例,这在畜牧业生产上具有重要的意义。动物的某些生产性状是受性别限制(泌乳等)或性别影响的(产肉、产毛等),通过性别控制可以使这些性状在更多的理想性别中获得更大的经济效益,加快优良母畜的繁殖速度,促进高效畜牧业的发展。如在养牛业上,结合胚胎分割、胚胎冷冻保存等动物繁殖技术,可以选育优良母牛,增加牛奶产量,提高肉牛产肉率。本研究以小鼠和牛为研究对象,分别建立了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)鉴定小鼠和牛性别的方法,并讨论了影响PCR 扩增的几个因素。主要内容有以下几点:(1) 依据小鼠和牛SRY 基因序列,分别设计合成其巢式PCR 引物;同时根据小鼠和牛ZFY-ZFX基因的序列,设计合成其各自的内对照引物。(2) 分别采集雌雄小鼠和公母牛少量组织样品,试剂盒抽提基因组DNA,保存于TE溶液中,作为反应模板,进行PCR 扩增,其性别鉴定结果与已知性别完全一致。(3) 超排处理母鼠,分别收集2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎和早期桑椹胚,视为微量细胞样品,热处理后进行PCR 扩增。比较常规和巢式、复合式PCR 方法,并对Mg~(2+)浓度进行梯度选择(1.5、2.5、3.0 mmol/L),确立了合适的扩增体系及反应条件。实验结果显示,在扩增微量样品时,巢式PCR 胚胎可鉴别率(94.1%,111/118)高于常规PCR(64.3%,36/56),复合式PCR 则更有利于排除假阴性结果的干扰,而2.5 mmol/L 的Mg~(2+)浓度扩增效果较好。(4) 超排处理母鼠,收集致密桑椹胚和囊胚,进行活检。采用简易切割法,将致密桑椹胚切为一大一小两部分,囊胚则切取少量滋养层细胞。胚胎主体进行染色体分析,其鉴定结果作为性别标准。半胚或取样细胞相应编号,热处理后进行PCR鉴定。实验结果为:通过核型分析法,共鉴定21 枚胚胎,12 枚为雄性,9 枚为雌性;?b通过PCR 法鉴定,其中12 枚胚胎判为雄性,8 枚判为雌性,与核型分析结果一致,1 枚为假阳性结果;PCR 鉴定的准确率为95.2%(20/21)。(5) 收集已知性别的公母牛微量细胞样品。在高倍实体显微镜下分别取5-10 枚细胞,热处理后进行PCR 扩增,确立合适的扩增体系及反应条件。(6) 对牛精液、血清、操作液及操作者头屑等可能对鉴定造成影响的几个因素进行了研究和检测,PCR 扩增结果表明,这些因素不会对PCR 鉴定造成污染。
参考文献：
[1]. 利用聚合酶链反应（PCR）鉴定小鼠早期胚胎性别的研究[D]. 高嵩. 西南农业大学. 2003
[2]. 水牛SRY基因及胚胎性别鉴定技术的研究[D]. 付强. 广西大学. 2006
[3]. 牛早期胚胎性别鉴定的PCR方法的研究[D]. 赵雪. 西北农林科技大学. 2003
[4]. 小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究[D]. 何允. 西南大学. 2012
[5]. 绵羊性别鉴定PCR方法的研究[D]. 宋淑珍. 甘肃农业大学. 2007
[6]. 应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究[D]. 肖海霞. 新疆农业大学. 2006
[7]. 奶牛性别控制技术研究[D]. 赵雪. 西北农林科技大学. 2011
[8]. 牙釉质基因鉴定山羊早期胚胎性别的研究[D]. 唐纪伟. 塔里木大学. 2011
[9]. PCR法鉴别哺乳动物胚胎性别的研究[D]. 洪桂云. 安徽农业大学. 2003
[10]. PCR法进行小鼠和牛的性别鉴定[D]. 王晗. 西北农林科技大学. 2005
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