论文摘要
研究背景:哺乳动物和人的十二指肠黏膜上皮具有吸收和分泌两大功能,其分泌粘液和HCO3-的能力,对于保护脆弱的十二指肠上皮免受胃酸和胃蛋白酶等侵袭因子的损害至关重要。目前已知囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）和Cl-/HCO3-阴离子交换器（AE）是参与十二指肠黏膜上皮顶端HCO3-分泌主要的蛋白。但除了CFTR和AE之外,还发现肠上皮细胞表达能够介导阴离子分泌的其他几种Cl-通道,其中ClC-2通道已经证明在肠上皮细胞的顶端或/和基底外侧膜中表达。ClC-2通道是一类电压门控性阴离子通道ClC超家族的成员,在全身广泛表达,发挥非常重要的生理作用,在肠道ClC-2通道可介导结肠Cl-分泌,其特异性激动剂鲁比前列酮已经作为治疗便秘的药物在临床广泛应用。到目前为止,ClC-2通道在小肠上皮阴离子分泌中的作用,特别是十二指肠黏膜分泌中的作用和机制很少被研究。因此我们旨在探讨ClC-2通道介导十二指肠黏膜上皮细胞分泌的作用和分子机制,并初步探索ClC-2与Ca2+信号、CFTR与cAMP信号的相互作用。研究方法:首先,应用组织免疫荧光技术和荧光实时定量RT-PCR技术检测小鼠十二指肠黏膜中ClC-2蛋白和mRNA的表达和定位情况;然后通过Ussing Chamber实验测量小鼠十二指肠黏膜离子分泌功能,分别将6-8周野生型C57小鼠及CFTR-/-小鼠的十二指肠黏膜剥离肌层并安装在Ussing小室中,药物刺激后同时记录体外十二指肠短路电流（Isc）和HCO3-分泌;小鼠体内十二指肠黏膜HCO3-分泌（DMBS）通过CO2敏感电极测量,将小鼠十二指肠下段游离结扎,采用局部灌流和全身静脉注射给药两种方式,收集十二指肠分泌液测量;采用单细胞数字Ca2+测定系统检测十二指肠上皮细胞系SCBN细胞中的游离Ca2+([Ca2+]cyt)浓度;通过短路电流（SSC）技术检测小鼠十二指肠黏膜的跨上皮电阻（TEER）。研究结果:1.ClC-2在小鼠十二指肠黏膜有表达,并且定位于基底侧（浆膜侧）;2.鲁比前列酮（lubiprostone,10-1000 nM）,一种选择性ClC-2激动剂,仅在小鼠十二指肠浆膜侧给药时,浓度依赖性地引起Isc增高和HCO3-分泌,在黏膜侧（顶侧）给药时未检测到Isc和HCO3-分泌（p<0.01,n=5）;3.在组织外液中完全去除Cl-后,鲁比前列酮无论在浆膜侧还是黏膜侧均不能刺激十二指肠Isc增高;但即使存在DIDS（Cl-/HCO3-交换抑制剂）时,也不影响十二指肠HCO3-分泌（p>0.05,n=6）;4.甘氨酰胺（一种CFTR通道阻滞剂）能够抑制鲁比前列酮诱导的十二指肠HCO3-分泌（p<0.01,n=6）;此外,与同窝野生型小鼠相比,鲁比前列酮诱导的HCO3-分泌在CFTR-/-小鼠中明显降低（p<0.01,n=5）;5.鲁比前列酮（1μM）在十二指肠腔局部灌注并未改变体内基础DMBS,但鲁比前列酮（0.1 mg/kg）腹腔注射能够诱导DMBS,并且能够被ClC-2通道阻滞剂Cd2+明显抑制（p<0.01,n=6）;6.鲁比前列酮激活ClC-2后SCBN细胞内游离Ca2+无明显变化（p>0.05,n=10）,抑制Ca2+激活的K+通道和抑制cAMP信号通路后鲁比前列酮介导的十二指肠Isc和HCO3-分泌无明显抑制（p>0.05,n=6）;鲁比前列酮激活ClC-2后十二指肠黏膜TEER值无明显变化（p>0.05,n=6）。结论:本研究通过小鼠体内外黏膜Isc和HCO3-分泌检测,发现鲁比前列酮可选择性激活十二指肠上皮浆膜侧ClC-2通道,在十二指肠黏膜的离子分泌中发挥重要作用。1.小鼠体内外十二指肠浆膜侧ClC-2通道激活后,能够介导黏膜Cl-及HCO3-分泌;2.ClC-2激活后对细胞内Ca2+信号、细胞间紧密连接及cAMP信号通路无明显影响;3.ClC-2介导十二指肠黏膜Cl-及HCO3-分泌需要黏膜侧CFTR参与,可能机制是浆膜侧ClC-2通道激活为CFTR提供了HCO3-。因此,本研究为十二指肠上皮细胞中ClC-2通道的功能性表达及其在DMBS调节中的新作用提供了证据,为ClC-2在十二指肠溃疡及黏膜保护中的深入研究提供了基础。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 杜超
导师: 赵晓晏
关键词: 电压门控性氯离子通道,十二指肠黏膜,碳酸氢盐分泌
来源: 中国人民解放军陆军军医大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 中国人民解放军陆军军医大学
基金: 国家自然科学基金
分类号: R333
DOI: 10.27001/d.cnki.gtjyu.2019.000244
总页数: 113
文件大小: 2276K
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标签：电压门控性氯离子通道论文; 十二指肠黏膜论文; 碳酸氢盐分泌论文;