猪德尔塔冠状病毒抗原及抗体检测方法的建立

论文摘要

猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是近年来新发现的肠道致病性冠状病毒。仔猪感染PDCoV后出现呕吐、腹泻和脱水等症状,有较高的发病率和死亡率,是导致仔猪死亡的重要原因之一。目前,在多个国家和地区都检测到了 PDCoV,在国内多个省份也有该病毒的相关报道。鉴于PDCoV在猪群中的广泛流行性及潜在威胁,本研究建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法和细胞免疫组化法,以及检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法。1.检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立本研究通过DNAStar Protean软件对PDCoV N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段（265～342 aa）,根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。分别利用pET-32a和pGEX-6p-1表达系统进行原核表达,获得的两种融合蛋白分别带有His和GST标签,命名为PDCoV-N-His和PDCoV-N-GST,且均呈可溶性表达。Western Blot鉴定结果显示两个重组蛋白大小均与预期相符,分别约为31 kDa 和 36 kDa。利用Ni-NTA亲和层析介质和高亲和力GST纯化介质,分别纯化出两种重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,经比较,以PDCoV-N-His作为包被抗原检测效果更好。最终以PDCoV-N-His作为包被抗原建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份己知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%（20/20）,阴性符合率为100%（20/20）,表明方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。2.检测PDCoV抗体的细胞免疫组化法的建立根据完整PDCoV N基因序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆N基因,进而构建表达N蛋白的慢病毒载体。以包装的慢病毒感染Vero细胞,通过4μg/mL的嗓呤霉素筛选,获得稳定表达N蛋白的重组细胞系Vero/PDCoV-N。经Western Blot鉴定,该细胞系能表达与预期大小相符的41 kDa的蛋白条带。应用该细胞系进一步建立了检测PDCoV特异性抗体的细胞免疫组化检测方法。应用该方法检测已知PDCoV阳性血清,显色后细胞质呈现特异性棕褐色,而作为对照的Vero细胞无任何颜色反应。该方法的建立为PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查提供了另外一种有效的血清学检测方法。3.检测PDCoV抗原的双单抗夹心ELISA方法的建立本研究以PDCoV-N-His蛋白为免疫原,以PDCoV-N-GST蛋白为检测抗原,采用杂交瘤技术,经ELISA筛选获得了 6株能稳定分泌针对PDCoVN蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C5、5C5、8C12、8E8、10A7。亚类鉴定结果显示,在6株单抗中,4株为IgGi亚型,2株为IgM亚型。对6株单抗的相对亲和力和抗原结合表位进行综合分析,选择1A2为捕获抗体,HRP偶联的5C5为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。该方法的双对数回归拟合线线性相关系数大于0.99,通过回归方程确定定量分析PDCoVN蛋白的检测范围为80 ng/mL～1.3μg/mL。批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,表明方法具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的双单抗夹心ELISA方法展示出对重组N蛋白的良好检测效果,有望以此为基础进一步开发出可用于临床PDCoV感染诊断的特异性抗原检测方法。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

第一章文献综述

1.1 PDCoV的病原学

1.1.1 PDCoV的形态结构

1.1.2 PDCoV的基因组结构

1.1.3 主要编码蛋白及其功能

1.2 PDCoV感染的流行病学调查

1.3 PDCoV的致病性

1.4 PDCoV的体外培养特性

1.5 PDCoV检测技术的研究进展

1.5.1 病原学检测技术

1.5.1.1 逆转录-聚合酶链式反应

1.5.1.2 反转录巢式PCR

1.5.1.3 实时荧光定量PCR

1.5.1.4 高通量测序诊断技术

1.5.1.5 免疫组织化学技术

1.5.2 间接ELISA

1.6 研究目的与意义

第二章 PDCoV抗体检测方法的建立

2.1 材料

2.1.1 载体与菌株

2.1.2 毒株与细胞

2.1.3 主要生物试剂

2.1.4 其他实验材料

2.1.5 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 PDCoV N蛋白的原核表达

2.2.1.1 PDCoV N蛋白原核表达质粒的构建

2.2.1.2 PDCoV N蛋白原核表达质粒的转化

2.2.1.3 PDCoV N蛋白的诱导表达

2.2.1.4 PDCoV N蛋白的Western Blot鉴定

2.2.1.5 PDCoV N蛋白最佳诱导条件的摸索

2.2.1.6 PDCoV N蛋白的纯化

2.2.2 检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立

2.2.2.1 包被抗原的筛选

2.2.2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

2.2.2.3 最佳封闭条件的确定

2.2.2.4 最佳一抗孵育时间的确定

2.2.2.5 二抗最佳孵育条件的确定

2.2.2.6 最佳显色时间的确定

2.2.2.7 临界值的确定

2.2.2.8 特异性实验

2.2.2.9 重复性与稳定性试验

2.2.2.10 间接ELISA方法的验证

2.2.3 表达PDCoV N蛋白重组细胞系构建与细胞免疫组化方法的建立

2.2.3.1 引物设计

2.2.3.2 PDCoV-N-CL基因片段的RT-PCR扩增

2.2.3.3 慢病毒表达质粒构建

2.2.3.4 慢病毒表达质粒的转化及鉴定

2.2.3.5 慢病毒的包装及鉴定

2.2.3.7 Vero细胞嘌呤霉素杀伤曲线试验

2.2.3.8 慢病毒感染Vero细胞和嘌呤霉素筛选

2.2.3.9 RT-PCR鉴定

2.2.3.10 Western Blot鉴定

2.2.3.11 细胞免疫组化

2.3 结果

2.3.1 PDCoV N蛋白的原核表达

2.3.1.1 PDCoV N原核表达质粒的酶切鉴定

2.3.1.2 诱导表达的SDS-PAGE鉴定

2.3.1.3 Western Blot鉴定

2.3.1.4 PDCoV N蛋白最佳诱导条件的摸索

2.3.1.5 PDCoV N蛋白的纯化

2.3.2 检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立

2.3.2.1 最佳包被抗原的确定

2.3.2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

2.3.2.3 最佳封闭条件的确定

2.3.2.4 最佳一抗孵育时间的确定

2.3.2.5 最佳二抗孵育条件的确定

2.3.2.6 最佳显色时间的确定

2.3.2.7 临界值的确定

2.3.2.8 特异性实验

2.3.2.9 重复性与稳定性实验

2.3.2.10 间接ELISA方法的验证

2.3.3 表达PDCoV N蛋白细胞系的建立及应用

2.3.3.1 PDCoV-N-CL基因片段的RT-PCR扩增

2.3.3.2 慢病毒表达质粒的酶切鉴定

2.3.3.3 慢病毒的RT-PCR鉴定

2.3.3.4 嘌呤霉素筛选浓度的确定

2.3.3.5 重组细胞系筛选

2.3.3.6 RT-PCR鉴定

2.3.3.7 Western Blot鉴定

2.3.3.8 细胞免疫组化

2.4 讨论

第三章基于PDCoV N蛋白单克隆抗体的双抗体夹心ELISA检测方法的建立

3.1 材料

3.1.1 毒株、细胞系和实验动物

3.1.2 主要生物试剂

3.1.3 其他实验材料

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 PDCoV N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

3.2.1.1 McAb的制备

3.2.1.2 Western Blot鉴定

3.2.1.3 McAb亚类鉴定

3.2.1.4 McAb相对亲和力分析

3.2.1.5 McAb抗原结合表位分析

3.2.1.6 McAb腹水的纯化

3.2.2 基于PDCoVN蛋白单克隆抗体的双抗体夹心ELISA方法的建立

3.2.2.1 检测抗体的制备

3.2.2.2 捕获抗体包被浓度和检测抗体稀释度的确定

3.2.2.3 最佳封闭条件的确定

3.2.2.4 酶标抗体最佳孵育时间的确定

3.2.2.5 最佳显色时间的确定

3.2.2.6 双对数回归拟合线的绘制

3.2.2.7 重复性与稳定性试验

3.3 结果

3.3.1 PDCoV N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

3.3.1.1 McAb的制备

3.3.1.2 Western Blot鉴定

3.3.1.3 McAb亚类鉴定

3.3.1.4 McAb相对亲和力分析

3.3.1.5 McAb抗原结合表位分析

3.3.1.6 McAb腹水的纯化

3.3.2 双抗体夹心ELISA方法的建立

3.3.2.1 检测抗体的制备

3.3.2.2 捕获抗体包被浓度和检测抗体稀释度的确定

3.3.2.3 最佳封闭条件的确定

3.3.2.4 酶标抗体最佳孵育时间的确定

3.3.2.5 最佳显色时间的确定

3.3.2.6 双对数回归拟合线的绘制

3.3.2.7 重复性与稳定性试验

3.4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的学术成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钱炳旭

导师: 吴艳涛,张小荣,何海蓉

关键词: 猪德尔塔冠状病毒,核衣壳蛋白,间接,细胞免疫组化,单克隆抗体,双抗体夹心

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 扬州大学“高端人才支持计划”(2016年度)江苏高校优势学科建设工程资助项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000407

总页数: 74

文件大小: 4293K

下载量: 274

猪德尔塔冠状病毒抗原及抗体检测方法的建立

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢