INTS11在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的作用

论文摘要

中国卤虫在不良环境中会产生保护性的滞育卵,遇到合适的条件可以打破滞育,目前在中国卤虫胚胎重启动的分子调控机制还不是很清楚。通过相关研究发现整合因子复合体11在胚胎重启中过程中发挥着不可缺少的作用,尤其是在参与细胞周期调控方面,但整合因子复合体11在中国卤虫滞育胚胎解除滞育过程中作用机制尚不了解。整合因子复合体11是一种内切核酸酶,与RNA聚合酶Ⅱ（RANPⅡ）大亚基的具有重复氨基酸序列的C端相互作用,进而介导小核RNA 3’末端以及增强子RNA（eRNA）加工,还可以参与编码G1进展和进入S期所需蛋白质的细胞前mRNA起切割作用,使之形成成熟的mRNA,促进细胞周期中靶基因的转录。因此整合因子复合体11在中国卤虫胚胎重启动过程中可能发挥重要作用,本研究为探究整合因子复合体11在中国卤虫体内的作用进行理论分析和实验探究。本实验通过RACE技术,克隆了整合因子复合体11全部cDNA序列,整合因子复合体11的全长序列为1964 bp,ORF编码597个氨基酸,分子量约为67 KDa的一种疏水性蛋白质,等电点为6.79;亚细胞定位预测显示整合因子复合体11最可能在细胞核中高表达,在胞浆也有少量表达;通过SignalP4.1检测蛋白不含有信号肽,整合复合体11属于一种非分泌蛋白质;通过SMART预测该蛋白含有metallo-hydrolase-like-MBL-fold和Beta-casp两个结构域;通过qPCR和Western印迹检测整合因子复合体11在中国卤虫体内基因和蛋白表达水平,结果显示在基因和蛋白水平趋势相一致,都在0-15 h发育过程中表达量增加,在15 h后表达逐渐降低,说明整合复合体11可能在胚胎重启动过程中承担着重要的作用,然而在温度和盐度胁迫中,整合因子复合体11在低温和高盐时表达量最低,当环境适宜时,其表达水平增加,说明整合因子复合体11在调节胚胎发育过程中也受温度和盐度的调控。同时利用Western bloting技术对参与INTS11相关蛋白INTS9和RANPⅡ的表达水平进行检测,结果显示与INTS11表达趋势相一致,推测可能在胚胎发育过程中INTS11和INTS9形成异二聚体与RANPⅡ的C末端相结合参与mRNA的剪接作用,促进细胞周期靶基因的转录。本文进一步分析了整合因子复合体11在中国卤虫滞育胚胎重启动的分子机制,为甲壳动物和其他无脊椎动物滞育胚胎重启动的分子机制的研究提供一定的科学依据。

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摘要

Abstract

1 前言

1.1 卤虫简介

1.1.1 卤虫外部形态

1.1.2 卤虫的繁殖习性及经济价值

1.2 整合因子复合体研究现状

1.2.1 整合因子复合体各亚基生物学功能

1.2.2 整合因子复合体11（INTS11）结构特点及功能

1.2.3 INTS11 上下游相关调控蛋白

1.3 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 中国卤虫的孵化及培养

2.1.2 实验仪器及设备

2.1.3 主要药品试剂

2.1.3.1 中国卤虫总RNA提取相关试剂

2.1.3.2 实验相关药品溶液配制

2.2 方法

2.2.1 总RNA的提取

2.2.2 普通cDNA、3’RACE cDNA、5’RACE cDNA的获取

2.2.3 引物

2.2.4 基因克隆

2.2.5 回收产物

2.2.6 转菌、涂平板、测序

2.2.7 实时定量PCR步骤

2.2.8 原核表达

2.2.9 免疫荧光

2.2.10 Western Blot

2.2.11 生物信息学及生物统计分析

3 结果

3.1 基因全长和生物信息学分析

3.1.1 As-ints11 目的片段的获得

3.1.2 As-ints113’端序列的获得

3.1.3 As-ints115’端序列的获得

3.1.4 As-ints11 c DNA序列全长

3.2 生物信息学分析

3.3 As-INTS11 进化生物学分析

3.4 As-ints11 基因的表达水平

3.4.1 As-ints11 在不同时期的表达水平

3.4.2 As-ints11 在不同的温度胁迫的表达水平

3.4.3 As-ints11 在不同的盐度胁迫的表达水平

3.5 As-INTS11 蛋白表达与纯化

3.5.1 As-INTS11 蛋白的表达

3.5.2 As-INTS11 蛋白可溶性鉴定

3.5.3 As-INTS11 重组蛋白的纯化

3.6 As-INTS11 的亚细胞定位分析

3.7 As-INTS11 的蛋白表达

3.7.1 不同时间As-INTS11 的蛋白表达模式

3.7.2 不同温度胁迫下中国卤虫As-INTS11 的蛋白表达模式

4 讨论

4.1 As-ints11 基因的分子特征

4.2 整合因子复合体11 的表达部位

4.3 As-INTS11 在不同发育时期的表达模式

4.4 As-INTS11 在不温度及盐度胁迫的表达模式

4.5 As-INTS11 在滞育解除、胚胎重启动中的作用

结论

参考文献

攻读博/硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘金枝

导师: 侯林

关键词: 中国卤虫,整合因子复合体,滞育,表达模式

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 国家自然科学基金项目Annexin3介导anxa3,lea,drrb,atf3途径激活中国卤虫滞育胚胎重启动的分子机制,(项目编号:31572607)

分类号: Q78

总页数: 54

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