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利用酵母双杂交技术筛选与CCDC58相互作用的蛋白

2020-12-02阅读(265)

利用酵母双杂交技术筛选与CCDC58相互作用的蛋白

论文摘要

卷曲螺旋是存在于多种天然蛋白质中的一种结构域,涉及调节基因表达,膜融合以及细胞分裂等多种重要的生物学功能.CCDC58是一种由人体宿主细胞编码的蛋白质,含有卷曲螺旋结构域,由144个氨基酸组成,编码CCDC58的基因定位于人类3号染色体上.目前对该蛋白的研究不是很多,它的具体作用机制及相关的互作蛋白并不清楚.本实验通过酵母双杂交技术,以CCDC58作为诱饵,在cDNA文库中寻找与CCDC58相互作用的蛋白,最后通过反向验证筛选出5个可能有相互作用的蛋白.为了在体外进一步确认这种相互作用,本实验通过GST Pull-down实验,最终确认TP53BP2和CCDC58具有很强的相互作用.

论文目录

  • 0 引言
  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 菌株和质粒:
  •     1.1.2 主要试剂及仪器:
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 诱饵蛋白表达载体的构建:
  •     1.2.2 验证重组质粒在酵母细胞中的表达:
  •     1.2.3 诱饵蛋白的自激活实验:
  •     1.2.4 酵母杂交及初步筛选:
  •     1.2.5 阳性酵母菌落筛选及鉴定:
  •     1.2.6 反向验证相互作用:
  •     1.2.7 CCDC58-PET30 mbp克隆构建:
  •     1.2.8 CCDC58-PET30mbp蛋白表达与纯化:
  •     1.2.9 GST Pull-down检验蛋白相互作用:
  • 2 结果与分析
  •   2.1 诱饵蛋白克隆构建
  •   2.2 western blot检测重组蛋白在酵母中表达情况
  •   2.3 验证自激活
  •   2.4 酵母杂交及初步筛选
  •     2.4.1 杂交效率:
  •     2.4.2 TDO、QDO与蓝白斑筛选情况:
  •     2.4.3 筛选得到的蛋白情况:
  •   2.5 反向验证结果
  •   2.6 GST Pull-down结果与分析
  •     2.6.1 CCDC58-PET30 mbp克隆构建:
  •     2.6.2 CCDC58蛋白表达与纯化:
  •     2.6.3 待检测蛋白的表达与纯化:
  •     2.6.4 GST Pull-down检验蛋白相互作用:
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 陈文丽,刘新奇

    关键词: 卷曲螺旋结构域,酵母双杂交技术,实验

    来源: 南开大学学报(自然科学版) 2019年03期

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 南开大学生命科学学院

    分类号: Q78

    页码: 11-17

    总页数: 7

    文件大小: 1187K

    下载量: 530

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