导读:本文包含了细胞外离子论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:远端小管通道,钠氯共转运体,大电导钙激活钾通道,钾离子
细胞外离子论文文献综述
杨阳,张娅,郭琴,张翀[1]（2019）在《细胞外钾对小鼠远端肾小管离子通道活性的影响》一文中研究指出目的·探索细胞外钾在短时间内浓度的变化对小鼠远端肾小管离子通道钠氯共转运体(sodium chloride co-transporter,NCC)、大电导钙激活钾通道(large conductance Ca~(2+)-activated K+channel,BK)活性的影响。方法·6只8～10周龄的无特定病原体动物(specific pathogen free,SPF)级C57BL/6小鼠取肾后获得肾片,并随机放入正常钾溶液、高钾溶液、氯化钡溶液和氯化铷溶液中进行孵育。通过蛋白质印迹法观察在不同浓度钾离子溶液及不同时间下,肾片NCC蛋白的表达丰度及磷酸化水平变化,以及经2种钾离子溶液孵育2 h后肾片BK中总蛋白和膜蛋白的表达变化。结果·与正常钾溶液相比,经高钾溶液孵育5、15、30 min后NCC磷酸化水平显着下降(均P<0.05);而经氯化钡或氯化铷干预后,NCC磷酸化水平亦受到显着抑制(均P<0.05)。经2种钾离子溶液处理2 h后,BK核心亚基α和β4的总蛋白表达间无明显变化,且BKα亚基的膜蛋白表达间亦无显著差异。结论·细胞外高浓度的钾离子可直接下调NCC的磷酸化水平,且该下调可能是为下游离子通道的迅速排钾做准备。(本文来源于《上海交通大学学报(医学版)》期刊2019年09期）
岳家吉[2]（2019）在《镁离子调节Erk信号通路及自噬形成抑制软骨细胞外基质钙化的分子生物学机制研究》一文中研究指出研究目的:骨性关节炎最重要的细胞病理学变化包括软骨细胞肥大化、软骨细胞凋亡、软骨细胞被成骨细胞替代。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)由以胶原为主要成分向以钙磷酸盐为主要成分转化,导致软骨细胞外基质被骨组织所替代,并最终形成骨性关节炎的主要组织学特点。镁是人体内常量元素,是细胞内含量仅次于钙离子的二价阳离子,它在维持人体的正常生理功能、促进细胞和生物酶活性中发挥了至关重要的作用,其参与多种酶促反应、蛋白合成和能量代谢;调控骨组织生长和维持神经肌肉的兴奋性;保持胃肠道和激素功能的稳定性。Ca~(2+)和Mg~(2+)作为人体内含量最大的两种二价阳离子,细胞外液的平衡调控着细胞外微环境中钙盐沉积和组织钙化水平;同时生理性的骨形成、骨吸收和病理性的异位骨化、软骨细胞钙化也受到这两种离子的调控影响。目前发现,钙化的肌腱组织和韧带中,钙含量较正常组织增高,且随着肌腱退变和钙化的严重程度而加剧,而镁的含量则随着肌腱老化和退变而下降;近年研究表明,Mg~(2+)与细胞外基质的钙化过程密切相关,涉及很多常见的病理状态,如骨质疏松和动脉血管粥样硬化中钙化斑块的形成。除此之外,结缔组织异位骨化被Mg~(2+)有效抑制也已经在动物实验中得到证实;关节腔内注射硫酸镁也可以有效抑制关节软骨产生类似骨性关节炎的病理变化;新英格兰杂志也指出,血液中镁离子含量的异常,可导致焦磷酸钙在软骨细胞间沉积从而引起软骨钙质沉着症。人群的大样本研究也提示,当血清Mg~(2+)浓度升高或饮食中添加较高浓度镁元素时,膝关节骨性关节炎的影像学表现则有所减弱,差异具有统计学意义,可以说Mg~(2+)在调控细胞外基质钙化过程中起到了关键作用。ATDC5细胞系和DMM手术诱导的骨性关节炎动物模型是目前被广泛使用的,用以研究骨性关节炎发病机制最有效的体外和体内研究的实验对象。与衰老引发的自发性小鼠膝关节骨性关节炎模型相比,DMM手术诱导模型可以在较短的时间内复制相似严重程度和相同位置的病理变化。该模型可以造成膝关节不稳定和内侧间室的压力集中,导致软骨退化从膝关节的内侧间隙开始,该病理机制与人体膝关节炎的发病机制相似。软骨细胞是关节软骨中唯一的常驻细胞,其主要功能为合成丰富的ECM,并参与细胞外基质的转换,而ECM从胶原向骨组织转换则是本研究中的重点。ATDC5细胞系于1990年首次从小鼠肿瘤组织中分离得来,相关研究也发现,该细胞系相对于其他已知细胞系(C3H10T1/2和RJC3.1)相比,具有非常强大的软骨形成及软骨分化能力。在细胞培养过程中,该细胞显示出软骨结节形成、II型胶原分泌、聚集蛋白聚糖和其他ECM分子的分泌等典型软骨细胞特征。随着培养时间的延长,ATDC5细胞出现肥大化现象,同时X型胶原蛋白表达也随之升高,在标准培养基培养45天后出现ECM钙化现象。ATDC5软骨细胞,具有快速增殖和未分化状态持久性较强的特点,有效确保本研究中的体外实验有效实施。本研究将着重探讨Mg~(2+)在有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,减缓小鼠膝关节骨性炎发展中的分子生物学机制和相关细胞信号通路,为临床工作中有效预防膝关节骨性关节炎,减缓疾病进展提供新的理论依据和新的治疗思路。研究方法:本研究以软骨细胞细胞系ATDC5细胞系和DMM手术诱导的骨关节炎动物模型为主要研究对象,着重探讨Mg~(2+)在有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,减缓小鼠膝关节骨性炎发展中的分子生物学机制和相关细胞信号通路。1、ATDC5软骨细胞分别在普通培养基,成骨诱导培养基,及含有梯度浓度Mg~(2+)的成骨诱导培养基(1.2 mM/L,1.6 mM/L,2.0 mM/L和2.4 mM/L)中连续培养14天,并进行茜素红染色,评估成骨诱导作用。2、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基或含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基中培养3,7和15天,采用qPCR技术检测成骨相关基因ALP,Runx2,软骨细胞肥大化基因Col10α1,MMP13,软骨细胞标记基因Sox9,Col1α1及钙化抑制基因MGP。3、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基或含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基中培养,并进行蛋白印迹法检测。于24小时后检测磷酸化ERK1/2蛋白及总ERK1/2蛋白,于72小时后检测LC3和p62蛋白,于7天后检测Runx2,MMP13,Col1α1,Col10α1。4、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基,含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基及含有5mM/L 3-MA的成骨诱导培养基中养孵育3小时或6小时。使用FACScan流式细胞仪,对ADTC5细胞中LC3蛋白阳性表达进行检测。5、对12周龄雄性小鼠的右膝进行DMM手术,从而诱导膝关节骨性关节炎的发生。通过打开和暴露膝关节腔,不对关节软骨或半月板进行任何操作,对同一小鼠的左膝进行假手术,以此作为阴性对照。6、术后第2周至11周,在麻醉(Avertin 240mg/kg体重)下每周向实验组小鼠双侧膝关节腔内注射MgCl_2(50μg,溶解于10μl生理盐水中),向对照组注射10μl生理盐水。在手术后12周收集双侧膝关节的标本,脱钙、处理、包埋、切片并进行组织学研究。7、对小鼠膝关节进行连续的矢状位切片(3μm厚)并用阿尔新蓝/苏木精和曙红(AB/H&E)染色,从而进行组织学和形态学分析。8、用OsteoMeasure软件(OsteoMetrics,Inc.,Atlanta,GA,USA)进行组织形态学测量。在每个组织切片的投影图像上描绘AB/H&E染色区域中关节软骨的蓝色区域,并进行统计学分析比较。9、根据Glasson等学者制定的骨性关节炎评分系统,对每只小鼠膝关节骨性关节炎进展的严重性进行评价。10、在3-μm厚的组织切片上进行免疫荧光(IF)染色,采用链霉抗生物素蛋白(488缀合物,Thermo Fisher)检测LC3阳性表达的荧光信号。使用具有DAPI的封片液封片,其中细胞核可以被染为蓝色。研究结果:高浓度Mg~(2+)可以有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,关节腔内注射MgCl_2可以有效抑制DMM手术诱导的膝关节骨性关节炎进展。1、当成骨诱导培养基中镁离子含量在1.6mM/L或更高浓度时,ATDC5软骨细胞外基质钙化程度受到显着的抑制,茜素红染色定量显着下降,细胞外高浓度Mg~(2+)的抑制作用具有剂量依赖效应。2、培养3天,7天或15天的ATDC5中提取的总RNA显示,高浓度的Mg~(2+)对ALP表达没有调控作用。成骨诱导培养基显着抑制MGP,Col1α1和Sox9的mRNA表达,高浓度Mg~(2+)则逆转了成骨诱导培养基的抑制作用。成骨诱导培养基可以显着提高Runx2,Col10α1和MMP13的mRNA表达,高浓度的Mg~(2+)则可以逆转其表达升高。3、培养24小时后,成骨诱导培养基中磷酸化的ERK蛋白显着增高,高浓度的Mg~(2+)可以抑制p-ERK的表达,而总ERK保持稳定。4、培养72小时后,LC3 II蛋白在成骨诱导培养基中表达升高,而高浓度Mg~(2+)和3-MA都可以降低该蛋白的表达。p62在成骨诱导培养基中受到抑制,高浓度的Mg~(2+)和3-MA则显着提高了p62的表达。5、培养7天后,成骨诱导培养基可激活ATDC5中软骨细胞肥大化标志物Runx2,Col10α1和基质降解酶MMP13水平,高浓度Mg~(2+)则明显降低了蛋白升高水平;培养7天后,成骨诱导培养基抑制ATDC5中的软骨细胞标记物Col1α1,高浓度的Mg~(2+)逆转抑制效果并呈现软骨细胞保护作用。6、每组样品分析1×10~4个ATDC5细胞。成骨诱导培养基可显着激活LC3表达,而高浓度的Mg~(2+)和3-MA均抑制LC3的表达。7、在DMM手术后连续关节腔内注射MgCl_2可以有效缓解骨性关节炎的进展。AB/H&E染色显示,在DMM手术后12周,小鼠膝关节出现显着骨性关节炎样表型,包括软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化。Mg~(2+)可以有效缓解骨性关节炎的进展,减少软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化的出现。8、通过组织形态学测量来量化胫骨平台的关节软骨面积,使用OsteoMeasure系统追踪阿尔新蓝阳性染色区域,注射MgCl_2的DMM组胫骨软骨面积明显高于注射生理盐水的DMM组样本;采用盲法由另外两位观察者对小鼠膝关节进行OARSI评分,结果显示,DMM手术引起显着的骨关节炎样缺陷,高浓度Mg~(2+)可有效保护关节软骨。9、通过免疫荧光检测标本石蜡切片中LC3的表达,LC3阳性的软骨细胞显示绿色荧光。与假手术组相比,DMM诱导的骨性关节炎标本中,软骨细胞的LC3阳性表达率更高,并且MgCl_2注射也可以降低LC3阳性表达的软骨细胞百分比。研究结论:高浓度Mg~(2+)可以有效抑制软骨细胞ATDC5细胞外基质钙化,抑制DMM手术诱导的小鼠膝关节骨性关节炎,产生软骨保护作用。1、高浓度Mg~(2+)通过抑制成骨相关转录因子Runx2,软骨细胞肥大化基因Col10α1,MMP13的mRNA及蛋白表达,抑制ATDC5细胞外基质钙化;高浓度Mg~(2+)通过上调软骨细胞标记基因Sox9,Col1α1及钙化抑制基因MGP的mRNA和蛋白表达,对ATDC5软骨细胞产生保护作用。2、高浓度Mg~(2+)通过抑制细胞信号通路ERK1/2蛋白磷酸化,有效抑制ATDC5软骨细胞自噬蛋白LC3-II的形成,增加自噬体内载体标记蛋白p62表达,有效抑制成骨诱导激活的细胞自噬形成,对细胞外机制钙化产生抑制作用。3、关节内注射MgCl_2可以有效减缓DMM诱导的小鼠膝关节骨性关节炎,在一定程度上减少软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化的现象,有效降低膝关节OARSI评分,部分保留关节软骨面积,缓解DMM模型的关节炎进展;免疫荧光染色显示,关节腔内注射MgCl_2还可以有效降低关节软骨中LC3阳性表达的细胞数量。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-02-01）
余蕾,赵雪红,樊小力,曹健[3]（2018）在《细胞外液钙离子浓度的改变对大鼠比目鱼肌离体单一肌梭自发放电的影响》一文中研究指出观察了含有不同钙离子浓度的细胞外液对大鼠离体单一比目鱼肌肌梭自发放电的影响。实验分为低钙改良任氏液组和高钙改良任氏液组,首先采用空气隔绝法记录大鼠离体单一比目鱼肌肌梭自发放电情况,然后分别以相应改良任氏液灌流肌梭,并记录其自发放电和氯化琥珀胆碱所致的诱发放电的情况。给予低钙改良任氏液灌流肌梭后,其自发放电频率增加(P<0.01),自发放电的周期间隔缩短(P<0.01),给予氯化琥珀胆碱后诱发放电未见明显增加;给予高钙改良任氏液灌流肌梭后,其自发放电频率减少(P<0.01),自发放电的周期间隔延长(P<0.05),给予氯化琥珀胆碱后诱发放电未见明显增加。提示含有较低钙离子浓度的细胞外液可增加大鼠离体单一比目鱼肌肌梭自发放电,含有较高钙离子浓度的细胞外液可抑制该肌梭自发放电。为大鼠肌梭生理的研究及钙离子与失重性肌萎缩的实验研究提供了有意义的资料。(本文来源于《生物学杂志》期刊2018年02期）
王均玲,余晨[4]（2016）在《线粒体超离子与血管紧张素Ⅱ介导肾间质细胞外基质纤维化的研究》一文中研究指出目的探索线粒体超氧离子(superoxides,O~-_2)是否参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导的细胞外基质纤维化。方法培养大鼠肾脏成纤维细胞(NRK-49F),AngⅡ刺激24 h后进行活细胞线粒体荧光染色(mitosox)以检测细胞内的线粒体O~-_2;采用酶标仪和流式细胞术检测线粒体超氧离子含量和分布;利用Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测AngⅡ对细胞外基质胶原蛋白-Ⅰ(collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、胶原蛋白-Ⅲ(collagen-Ⅲ,Col-Ⅲ)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的影响;并进一步检测NADPH氧化酶抑制剂罗布麻宁(apocynin,APO)对下游超氧离子合成以及ColⅠ、ColⅢ和FN表达的影响。结果 AngⅡ明显促进大鼠肾脏成纤维细胞O~-_2的生成以及细胞外基质Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的表达。Apo可显着抑制AngⅡ所引起的肾成纤维细胞中O~-_2表达,而AngⅡ诱导的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的合成作用亦被APO阻断。结论线粒体O~-_2介导了AngⅡ诱导的肾脏成纤维细胞的细胞外基质蛋白的合成,采用APO抑制O~-_2的表达,可使纤维化程度减轻。(本文来源于《同济大学学报(医学版)》期刊2016年03期）
王飞,王焕之,耿鑫,王勇,孙涛[5]（2015）在《大鼠脑动脉平滑肌细胞尼非地平非敏感钙离子电流与细胞外液二价载荷阳离子的关系》一文中研究指出目的:探讨脑动脉平滑肌细胞电压依赖性钙通道(voltage-dependent calcium channels,VDCCs)所介导的尼非地平不敏感电流(nifedipine-insensitive calcium currents,NICCs)与细胞外液二价载荷阳离子的种类和浓度之间的关系。方法:酶促消化法急性分离大鼠脑动脉平滑肌细胞,运用膜片钳研究其在不同二价载荷阳离子细胞外液中的VDCCs电流密度以及对L-VDCCs阻滞剂尼非地平(Nifedipine)和地尔硫卓(Diltiazem)的反应。结果:NICCs存在于以10 mmol/L Ba2+作为二价载荷阳离子的细胞外液中,加入100μmol/L Ca2+后所有VDCCs电流均对尼非地平非敏感;以2 mmol/L的Ba2+或2 mmol/L的Ca2+作为二价载荷阳离子时VDCCs电流均对尼非地平敏感;10 mmol/L的Ba2+中的NICCs可被100μmol/L地尔硫卓完全抑制,由于地尔硫卓对L-VDCCs具有高特异性,故认为NICCs仍是L-VDCCs电流的一部分。结论:再次证实了脑动脉平滑肌细胞仅表达L-型VDCCs,排除了其它类型VDCCs作为脑血流调节或脑血管疾病治疗靶点的潜在可能。(本文来源于《神经解剖学杂志》期刊2015年05期）
焦玥,李涛,马淑骅,欧阳竞峰,王毅[6]（2015）在《二苯乙烯苷对6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞外氨基酸,细胞内钙离子浓度的影响》一文中研究指出目的:观察二苯乙烯苷(TSG)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用并探讨相关机制。方法:以SH-SY5Y细胞为研究对象,以100μmol·L-16-OHDA建立SH-SY5Y细胞损伤模型,以浓度6.25,12.5,25,50,100,200μmol·L-1TSG作用损伤的SH-SY5Y细胞,另设空白组,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率,观察不同浓度的TSG对其的保护作用,激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度的变化,高效液相-荧光法检测上清液中兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu),抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)含量。结果:与空白组比较,模型组细胞存活率降低,游离钙明显增多(P<0.01),细胞外Glu及GABA浓度明显升高(P<0.01);与模型组比较,TSG预处理24 h可以改善6-OHDA造成的细胞存活率的下降,其中12.5μmol·L-1的细胞保护作用最为明显(P<0.05),明显降低内游离钙含量,明显降低细胞外Glu及GABA浓度(P<0.05,P<0.01),TSG对其有明显的抑制作用。结论:TSG可能通过减轻钙超载及兴奋性毒性对6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞起到保护作用。(本文来源于《中国实验方剂学杂志》期刊2015年15期）
顾京红,滕银成,黄亚绢,徐钦洋,马莉[7]（2014）在《重度子痫前期血管平滑肌细胞外钙离子内聚作用的研究》一文中研究指出目的:探讨钙离子在子痫前期(PE)血管平滑肌细胞功能异常中作用的分子机制。方法:检测并比较129例重度PE孕妇(重度PE组)中早发、晚发型孕期及产后的血压及血钙水平,并分析两者的相关性;同时检测120例正常妊娠孕妇(正常对照组)孕期及产后1月血钙水平,比较重度PE组与正常对照组血钙水平的差异。体外建立内皮细胞与平滑肌细胞共培养体系,试验分为正常孕妇血清处理组(A组)、PE血清处理组(B组)、共培养平滑肌细胞内钙离子释放通道阻断后PE血清处理组(C组),C组为叁磷酸肌醇受体-Ⅰ小干扰RNA(IP3R-ⅠsiRNA)沉默平滑肌细胞IP3R表达,斯里兰卡肉桂碱(终浓度10μmol/L)阻断兰诺定受体(RyRs)通路诱发的钙离子释放。观察3组共培养平滑肌细胞内钙离子浓度变化。结果:1早发、晚发重度PE产前血钙水平明显低于正常对照组孕中期、孕晚期及产后1月水平(P<0.05),早发、晚发重度PE产后1月血钙水平与正常对照组产后1月比较,差异无统计学意义(P>0.05);早发重度PE收缩压高于晚发重度PE(P<0.05)。2晚发重度PE和重度PE患者血钙水平与收缩压呈负相关(P<0.05),与舒张压无相关性(P>0.05)。3B组与C组钙离子浓度明显高于A组(P<0.05)。结论:重度PE血钙水平明显低于正常妊娠,产后迅速恢复正常;钙离子与PE血管痉挛性收缩的病理过程有关,PE血管平滑肌细胞外钙离子内流可能是导致低血钙及平滑肌细胞痉挛性收缩的重要原因,在PE的病理过程中起重要作用。(本文来源于《实用妇产科杂志》期刊2014年12期）
乔成功,李伟恒,唐国宁[8]（2014）在《细胞外钾离子浓度延迟恢复对螺旋波的影响研究》一文中研究指出在Luo-Rudy相I心脏模型中考虑了细胞外钾离子浓度的频率依赖性,并研究了细胞外钾离子浓度的延迟恢复对螺旋波动力学的影响.数值模拟结果表明,在螺旋波态下,细胞外钾离子浓度的延迟恢复会导致细胞外钾离子浓度周期振荡,其振荡周期和振幅随延迟恢复时间的增加而增加,进而导致出现呼吸螺旋波、多螺旋波共存、螺旋波做Lévy飞行式漫游、螺旋波通过不同方式消失等现象,这些结果与实验结果一致.(本文来源于《物理学报》期刊2014年23期）
高靓,朱华瑞,高学云[9]（2014）在《正电性纳米氧化石墨烯:原位检测肿瘤活细胞外微环境氢离子的荧光探针》一文中研究指出通过改进Hummers的方法,我们制备了带正电荷的发黄绿色荧光的纳米氧化石墨烯(GO),并且其荧光强度随体系酸碱性变化,即体系pH值越低,GO纳米颗粒发射荧光越强。为了提高GO的生物相容性,我们用生物型PEG分子对其进行功能化修饰,修饰之后的GO纳米复合材料(GO-PEG)具有与GO类似的荧光性质。GO-PEG作为一种荧光探针能精确地靶向肿瘤细胞膜,且标记到细胞膜上的纳米探针能够实时(本文来源于《中国化学会第29届学术年会摘要集——第03分会：分析可视化及交叉学科新方法》期刊2014-08-04）
周新异,刘娟,吴巧凤,田晓宁,范亚朋[10]（2014）在《不同状态下艾灸对穴位局部细胞外钾离子浓度的影响》一文中研究指出目的:观察生理病理两种不同状态下艾灸对穴位局部细胞外钾离子的不同影响,为探索艾灸对穴位局部的作用机制提供实验依据。方法:选取雌性SD大鼠40只,随机分为空白组、空灸组、模型组、模灸组,每组10只。模型组与模灸组采用弗氏完全佐剂造佐剂性关节炎模型(AA模型),其中空白组、模型组不予艾灸干预,空灸组、模灸组艾灸"足叁里"30min。各组均用微透析仪于"足叁里"穴位局部收集组织液,所得样品均用电解质分析方法进行即时分析,观察"足叁里"局部钾离子的浓度变化。结果:①生理状态下(空白组、空灸组),空白组在150min内细胞外钾离子浓度无明显变化(P>0.05);空灸组细胞外钾离子浓度灸前为(1.21±0.31)mmol/L,灸后缓慢升高,60min时达到高峰(2.38±0.42)mmol/L(P<0.05),之后下降,至灸后150min时,钾离子浓度略高于灸前,也略高于空白组,在60min时空灸组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。②病理状态下(模型组、模灸组),模型组细胞外钾离子浓度在150min内无明显变化,各时间点之间差异无统计学意义(均P>0.05);模灸组细胞外钾离子浓度灸前为(1.09±0.12)mmol/L,灸后即有明显升高(1.96±0.18)mmol/L(P<0.05),灸后60min、90mim时虽有下降但仍保持较高水平,分别为(1.87±0.29)mmol/L、(1.59±0.16)mmol/L(均P<0.05);艾灸后的各个时间点模灸组与模型组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:生理状态下艾灸能升高大鼠穴位局部钾离子浓度,但作用时间较短;在病理状态下艾灸大鼠"足叁里"穴,局部钾离子浓度明显升高,并且维持时间较长。(本文来源于《中国针灸》期刊2014年01期）
细胞外离子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究目的:骨性关节炎最重要的细胞病理学变化包括软骨细胞肥大化、软骨细胞凋亡、软骨细胞被成骨细胞替代。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)由以胶原为主要成分向以钙磷酸盐为主要成分转化,导致软骨细胞外基质被骨组织所替代,并最终形成骨性关节炎的主要组织学特点。镁是人体内常量元素,是细胞内含量仅次于钙离子的二价阳离子,它在维持人体的正常生理功能、促进细胞和生物酶活性中发挥了至关重要的作用,其参与多种酶促反应、蛋白合成和能量代谢;调控骨组织生长和维持神经肌肉的兴奋性;保持胃肠道和激素功能的稳定性。Ca~(2+)和Mg~(2+)作为人体内含量最大的两种二价阳离子,细胞外液的平衡调控着细胞外微环境中钙盐沉积和组织钙化水平;同时生理性的骨形成、骨吸收和病理性的异位骨化、软骨细胞钙化也受到这两种离子的调控影响。目前发现,钙化的肌腱组织和韧带中,钙含量较正常组织增高,且随着肌腱退变和钙化的严重程度而加剧,而镁的含量则随着肌腱老化和退变而下降;近年研究表明,Mg~(2+)与细胞外基质的钙化过程密切相关,涉及很多常见的病理状态,如骨质疏松和动脉血管粥样硬化中钙化斑块的形成。除此之外,结缔组织异位骨化被Mg~(2+)有效抑制也已经在动物实验中得到证实;关节腔内注射硫酸镁也可以有效抑制关节软骨产生类似骨性关节炎的病理变化;新英格兰杂志也指出,血液中镁离子含量的异常,可导致焦磷酸钙在软骨细胞间沉积从而引起软骨钙质沉着症。人群的大样本研究也提示,当血清Mg~(2+)浓度升高或饮食中添加较高浓度镁元素时,膝关节骨性关节炎的影像学表现则有所减弱,差异具有统计学意义,可以说Mg~(2+)在调控细胞外基质钙化过程中起到了关键作用。ATDC5细胞系和DMM手术诱导的骨性关节炎动物模型是目前被广泛使用的,用以研究骨性关节炎发病机制最有效的体外和体内研究的实验对象。与衰老引发的自发性小鼠膝关节骨性关节炎模型相比,DMM手术诱导模型可以在较短的时间内复制相似严重程度和相同位置的病理变化。该模型可以造成膝关节不稳定和内侧间室的压力集中,导致软骨退化从膝关节的内侧间隙开始,该病理机制与人体膝关节炎的发病机制相似。软骨细胞是关节软骨中唯一的常驻细胞,其主要功能为合成丰富的ECM,并参与细胞外基质的转换,而ECM从胶原向骨组织转换则是本研究中的重点。ATDC5细胞系于1990年首次从小鼠肿瘤组织中分离得来,相关研究也发现,该细胞系相对于其他已知细胞系(C3H10T1/2和RJC3.1)相比,具有非常强大的软骨形成及软骨分化能力。在细胞培养过程中,该细胞显示出软骨结节形成、II型胶原分泌、聚集蛋白聚糖和其他ECM分子的分泌等典型软骨细胞特征。随着培养时间的延长,ATDC5细胞出现肥大化现象,同时X型胶原蛋白表达也随之升高,在标准培养基培养45天后出现ECM钙化现象。ATDC5软骨细胞,具有快速增殖和未分化状态持久性较强的特点,有效确保本研究中的体外实验有效实施。本研究将着重探讨Mg~(2+)在有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,减缓小鼠膝关节骨性炎发展中的分子生物学机制和相关细胞信号通路,为临床工作中有效预防膝关节骨性关节炎,减缓疾病进展提供新的理论依据和新的治疗思路。研究方法:本研究以软骨细胞细胞系ATDC5细胞系和DMM手术诱导的骨关节炎动物模型为主要研究对象,着重探讨Mg~(2+)在有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,减缓小鼠膝关节骨性炎发展中的分子生物学机制和相关细胞信号通路。1、ATDC5软骨细胞分别在普通培养基,成骨诱导培养基,及含有梯度浓度Mg~(2+)的成骨诱导培养基(1.2 mM/L,1.6 mM/L,2.0 mM/L和2.4 mM/L)中连续培养14天,并进行茜素红染色,评估成骨诱导作用。2、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基或含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基中培养3,7和15天,采用qPCR技术检测成骨相关基因ALP,Runx2,软骨细胞肥大化基因Col10α1,MMP13,软骨细胞标记基因Sox9,Col1α1及钙化抑制基因MGP。3、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基或含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基中培养,并进行蛋白印迹法检测。于24小时后检测磷酸化ERK1/2蛋白及总ERK1/2蛋白,于72小时后检测LC3和p62蛋白,于7天后检测Runx2,MMP13,Col1α1,Col10α1。4、ATDC5软骨细胞在普通培养基,成骨诱导培养基,含有2.4mM/L Mg~(2+)的成骨诱导培养基及含有5mM/L 3-MA的成骨诱导培养基中养孵育3小时或6小时。使用FACScan流式细胞仪,对ADTC5细胞中LC3蛋白阳性表达进行检测。5、对12周龄雄性小鼠的右膝进行DMM手术,从而诱导膝关节骨性关节炎的发生。通过打开和暴露膝关节腔,不对关节软骨或半月板进行任何操作,对同一小鼠的左膝进行假手术,以此作为阴性对照。6、术后第2周至11周,在麻醉(Avertin 240mg/kg体重)下每周向实验组小鼠双侧膝关节腔内注射MgCl_2(50μg,溶解于10μl生理盐水中),向对照组注射10μl生理盐水。在手术后12周收集双侧膝关节的标本,脱钙、处理、包埋、切片并进行组织学研究。7、对小鼠膝关节进行连续的矢状位切片(3μm厚)并用阿尔新蓝/苏木精和曙红(AB/H&E)染色,从而进行组织学和形态学分析。8、用OsteoMeasure软件(OsteoMetrics,Inc.,Atlanta,GA,USA)进行组织形态学测量。在每个组织切片的投影图像上描绘AB/H&E染色区域中关节软骨的蓝色区域,并进行统计学分析比较。9、根据Glasson等学者制定的骨性关节炎评分系统,对每只小鼠膝关节骨性关节炎进展的严重性进行评价。10、在3-μm厚的组织切片上进行免疫荧光(IF)染色,采用链霉抗生物素蛋白(488缀合物,Thermo Fisher)检测LC3阳性表达的荧光信号。使用具有DAPI的封片液封片,其中细胞核可以被染为蓝色。研究结果:高浓度Mg~(2+)可以有效抑制ATDC5软骨细胞外基质钙化,关节腔内注射MgCl_2可以有效抑制DMM手术诱导的膝关节骨性关节炎进展。1、当成骨诱导培养基中镁离子含量在1.6mM/L或更高浓度时,ATDC5软骨细胞外基质钙化程度受到显着的抑制,茜素红染色定量显着下降,细胞外高浓度Mg~(2+)的抑制作用具有剂量依赖效应。2、培养3天,7天或15天的ATDC5中提取的总RNA显示,高浓度的Mg~(2+)对ALP表达没有调控作用。成骨诱导培养基显着抑制MGP,Col1α1和Sox9的mRNA表达,高浓度Mg~(2+)则逆转了成骨诱导培养基的抑制作用。成骨诱导培养基可以显着提高Runx2,Col10α1和MMP13的mRNA表达,高浓度的Mg~(2+)则可以逆转其表达升高。3、培养24小时后,成骨诱导培养基中磷酸化的ERK蛋白显着增高,高浓度的Mg~(2+)可以抑制p-ERK的表达,而总ERK保持稳定。4、培养72小时后,LC3 II蛋白在成骨诱导培养基中表达升高,而高浓度Mg~(2+)和3-MA都可以降低该蛋白的表达。p62在成骨诱导培养基中受到抑制,高浓度的Mg~(2+)和3-MA则显着提高了p62的表达。5、培养7天后,成骨诱导培养基可激活ATDC5中软骨细胞肥大化标志物Runx2,Col10α1和基质降解酶MMP13水平,高浓度Mg~(2+)则明显降低了蛋白升高水平;培养7天后,成骨诱导培养基抑制ATDC5中的软骨细胞标记物Col1α1,高浓度的Mg~(2+)逆转抑制效果并呈现软骨细胞保护作用。6、每组样品分析1×10~4个ATDC5细胞。成骨诱导培养基可显着激活LC3表达,而高浓度的Mg~(2+)和3-MA均抑制LC3的表达。7、在DMM手术后连续关节腔内注射MgCl_2可以有效缓解骨性关节炎的进展。AB/H&E染色显示,在DMM手术后12周,小鼠膝关节出现显着骨性关节炎样表型,包括软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化。Mg~(2+)可以有效缓解骨性关节炎的进展,减少软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化的出现。8、通过组织形态学测量来量化胫骨平台的关节软骨面积,使用OsteoMeasure系统追踪阿尔新蓝阳性染色区域,注射MgCl_2的DMM组胫骨软骨面积明显高于注射生理盐水的DMM组样本;采用盲法由另外两位观察者对小鼠膝关节进行OARSI评分,结果显示,DMM手术引起显着的骨关节炎样缺陷,高浓度Mg~(2+)可有效保护关节软骨。9、通过免疫荧光检测标本石蜡切片中LC3的表达,LC3阳性的软骨细胞显示绿色荧光。与假手术组相比,DMM诱导的骨性关节炎标本中,软骨细胞的LC3阳性表达率更高,并且MgCl_2注射也可以降低LC3阳性表达的软骨细胞百分比。研究结论:高浓度Mg~(2+)可以有效抑制软骨细胞ATDC5细胞外基质钙化,抑制DMM手术诱导的小鼠膝关节骨性关节炎,产生软骨保护作用。1、高浓度Mg~(2+)通过抑制成骨相关转录因子Runx2,软骨细胞肥大化基因Col10α1,MMP13的mRNA及蛋白表达,抑制ATDC5细胞外基质钙化;高浓度Mg~(2+)通过上调软骨细胞标记基因Sox9,Col1α1及钙化抑制基因MGP的mRNA和蛋白表达,对ATDC5软骨细胞产生保护作用。2、高浓度Mg~(2+)通过抑制细胞信号通路ERK1/2蛋白磷酸化,有效抑制ATDC5软骨细胞自噬蛋白LC3-II的形成,增加自噬体内载体标记蛋白p62表达,有效抑制成骨诱导激活的细胞自噬形成,对细胞外机制钙化产生抑制作用。3、关节内注射MgCl_2可以有效减缓DMM诱导的小鼠膝关节骨性关节炎,在一定程度上减少软骨下硬化,软骨退化和软骨细胞肥大化的现象,有效降低膝关节OARSI评分,部分保留关节软骨面积,缓解DMM模型的关节炎进展;免疫荧光染色显示,关节腔内注射MgCl_2还可以有效降低关节软骨中LC3阳性表达的细胞数量。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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